CN110387389A - 一种提高抗真菌活性物质hsaf发酵产量的方法 - Google Patents

一种提高抗真菌活性物质hsaf发酵产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高抗真菌活性物质HSAF发酵产量的方法，通过在菌株发酵前期添加谷氨酸、精氨酸或其盐的一种，可使发酵液中目的产物HSAF的产量达到473.13‑572.95mg/L，比未添加氨基酸的对照组提高了18.14‑43.06％。本发明所述方法可以大幅提高HSAF的发酵产量，且简单易行，成本较低，比较适合大规模工业化生产。

Description

一种提高抗真菌活性物质HSAF发酵产量的方法
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高抗真菌活性物质HSAF发酵产量的方法。
背景技术
热稳定抗真菌因子(Heat Stable Aniifungal Factor，HSAF)是由一种新型的生防细菌 Lysobacterenzymogenes分泌的次级代谢产物，其结构由一个独特的大环内酰胺体系、一个四胺酸结构单元和5,5,6-三环骨架组成(如下所示)，这一新颖结构不同于目前市场上任何一种杀菌剂。HSAF对多种真菌、部分细菌和线虫具有良好的拮抗效果，而且其抗真菌机制比较独特。研究表明HSAF的作用靶标是细胞膜上鞘脂类化合物的生物合成，从而影响真菌菌丝的极性生长。其只对丝状真菌有抑制效果，对哺乳动物和植物不起作用，这说明了HSAF安全性高，对人体基本无毒性，因此，HSAF可开发成良好的生物源农药用于生物防治。
在前期工作中，我们已对HSAF发酵的培养基成分及培养条件进行了系统地优化，使HSAF产量迅速提高到400.49mg/L。虽然取得了一定的成绩，然而与工业化生产仍有一定差距，因此有必要对其发酵产量进一步深入研究，从而满足大规模生产和市场的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高抗真菌活性物质HSAF发酵产量的方法，具体为在产酶溶杆菌(L.enzymogenes)OH11发酵过程中添加一种氨基酸或其盐。本发明所述方法可以大幅提高HSAF的发酵产量，且简单易行，成本较低，比较适合大规模工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种提高抗真菌活性物质HSAF发酵产量的方法，在菌株发酵前期添加单一的氨基酸或其盐进行发酵培养。
进一步的，本发明所述的氨基酸为谷氨酸或精氨酸，申请人发现，添加单一的谷氨酸或精氨酸可以显著提高HSAF的发酵产量。
进一步的，本发明单一的氨基酸或其盐与发酵液的质量体积浓度为1～9g/L，优选的，当选用谷氨酸时，谷氨酸或其盐与发酵液的质量体积浓度为2～4g/L，更优选为4g/L；当选用精氨酸时，精氨酸或其盐与发酵液的质量体积浓度为1～8g/L，更优选为5～6g/L，最优选为5g/L。
本发明氨基酸或其盐的添加时间需要在菌株发酵前期，优选的，在发酵时间的0～10h 内，更优选为0～6h内，最优选为发酵6h时加入。
本发明氨基酸或其盐在加入之前，优选的将其配制成母液的形式，配制方法可以按照本领域的常规方法和浓度，确保最终添加量能够满足上述需求即可。本发明提供一种氨基酸或其盐母液的配制方法：称取1.1-11g氨基酸或其盐，用超纯水定容至50-100mL，并用酸碱调节pH至7.0。
优选的，菌株发酵条件为装液量20～24％，发酵温度25～27℃，发酵时间56～60h。
菌株发酵所用的培养基可以为常规发酵所用的基础发酵培养基。
本发明菌株在发酵之前可以按照本领域的常规方法进行活化和种子液的制备，种子液制备可以选用本领域常用的种子培养基，如LB液体培养基，优选方式为将活化好的菌株接入到LB液体培养基中，振荡培养。培养后的种子液转接到基础发酵培养基中进行发酵。优选的种子液培养条件为26～30℃、170～190rpm，12～15h，种子液OD600＝1.0～2.0。种子液接入体积为基础培养基的1.0～1.5％。
本发明还提供一种发酵液的后处理方法，采用酸化-添加惰性物质-有机溶剂萃取的方法处理上述步骤得到的发酵液，即可获得发酵液中HSAF产量。
进一步的，酸化为采用HCl调节pH至3.0～4.5。
进一步的，所述惰性物质为无水CaCl2，添加量为(0.15～0.20)g/mL发酵液。
进一步的，所述的有机溶剂为乙酸乙酯，添加量为(0.8～1.2)mL/mL发酵液。
进一步的，萃取条件为1500～2000rpm下涡旋混合振荡1～1.5min。
本发明所述的方法相对于现有技术的有益效果：
本发明通过在HSAF发酵过程中添加氨基酸或其盐，可以大幅提高HSAF的发酵产量，可达473.13～572.95mg/L，比未添加氨基酸的对照组提高了18.14～43.06％。且本发明提供的方法简单易行，成本较低，比较适合大规模工业化生产，可用于今后的HSAF大规模工业化生产。
附图说明
图1不同种类氨基酸对菌体生长和HSAF发酵的影响对比；
图2不同浓度谷氨酸钠对菌体生长和HSAF发酵的影响对比；
图3谷氨酸钠添加时间对菌体生长和HSAF发酵的影响对比；
图4不同浓度精氨酸对菌体生长和HSAF发酵的影响对比；
图5不同浓度谷氨酸钠和精氨酸组合对菌体生长和HSAF发酵的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的培养基的配方如下：
①种子培养基：采用LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)配方；
②基础发酵培养基：黄豆粉8.00g/L，葡萄糖7.89g/L，CaCl2 0.72g/L。
实施例1：添加不同种类氨基酸对HSAF发酵的影响
(1)种子液准备：划取一满环OH11菌体于50mL LB培养液中，28℃下180rpm振荡培养12h至OD600＝1.5，即得到种子液；
(2)基本培养基配制：称取葡萄糖7.89g，CaCl2 0.72g，充分溶解后定容至1L，以每瓶100mL分装于500mL三角瓶中，并每瓶单独加入0.8g黄豆粉，121℃灭菌15min，冷却备用；
(3)氨基酸母液的配制：分别称取缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、α-酮戊二酸、鸟氨酸、瓜氨酸、谷氨酸及精氨酸2.2g溶于100mL纯水中，对于酸性氨基酸利用NaOH调节pH至7.0，碱性氨基酸则用浓HCl条件pH至7.0，充分溶解后，获得不同种类的谷氨酸母液，121℃灭菌15min后备用；
(4)接种发酵培养：将准备好的种子液按照1.5％的接种量接入发酵培养基中，分别加入10mL不同种类的氨基酸母液，使其终浓度为2g/L，于26℃、180rpm下培养58h；
(5)HSAF产量检测：吸取发酵液3mL至15mL离心管中，滴加浓HCl至pH为3.0，向混合液中添加0.45gCaCl2和3mL乙酸乙酯，置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1 min，使有机溶剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为HSAF有机溶剂层，吸取1mL吹干加入500μL甲醇溶解后通过HPLC 对其含量进行检测。
由图1可知，向发酵培养基中添加缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、α-酮戊二酸、鸟氨酸、瓜氨酸对HSAF的生物合成不产生促进作用，而添加谷氨酸、精氨酸条件下，HSAF产量分别为473.13、479.63mg/L，比对照(400.49mg/L)提高了18.14、19.76％，因此本发明所述的两种氨基酸能够明显提高HSAF的发酵产量。
实施例2：发酵0h添加不同浓度谷氨酸钠对HSAF发酵产量的影响
(1)此实施例中关于种子液制备、基本培养基配制，与实施例1中方法相同；
(2)谷氨酸钠母液的配制：分别称取1.1、2.2、3.3、4.4、5.5、6.6、7.7g谷氨酸钠溶于100mL纯水中，搅拌至充分溶解，制得不同梯度的谷氨酸钠母液，121℃灭菌15min 后备用；
(3)接种发酵培养：将准备好的种子液按照1.5％的接种量接入发酵培养基中，同时加入10mL不同浓度的谷氨酸钠母液，于26℃、180rpm下培养58h；
(4)HSAF产量检测：方法同实施例1中所述。
由图2可知，本发明所述的2-4g/L浓度范围内的谷氨酸钠对菌体生长影响不很明显，而其有利于HSAF的生物合成，当谷氨酸钠浓度为4g/L时，HSAF产量达到最大，为546.64mg/L，比对照提高30.92％；超过此范围浓度，HSAF产量出现急剧下降。
实施例3：不同发酵时间添加谷氨酸钠对HSAF发酵产量的影响
(1)此实施例中关于种子液制备、基本培养基配制，与实施例1中方法相同；
(2)谷氨酸钠母液的配制：称取4.4g谷氨酸钠溶于100mL纯水中，搅拌充分溶解，121℃灭菌15min后备用；
(3)发酵培养：将准备好的种子液按照1.5％的接种量接入发酵培养基中，于26℃、180rpm条件下振荡培养，分别在发酵0h、6h、12h、24h向培养基中加入10mL灭过菌的谷氨酸钠母液，继续培养至58h；
(4)HSAF产量检测：方法同实施例1中所述。
由图3可知，在本发明发酵前期(0-10h)加入谷氨酸钠能刺激细胞生长并有利于HSAF 产量的合成，最佳的添加时间点为发酵6h，此时能够使HSAF产量积累到572.95mg/L，比对照提高了43.06％。超过本发明所述的范围，如12h，添加谷氨酸钠对HSAF发酵产生负面的影响，因此在生产过程中必须严格控制添加的时间点，才能保证良好的促进效果。
实施例4：发酵0h添加不同浓度精氨酸对HSAF发酵产量的影响
(1)此实施例中关于种子液制备、基本培养基配制，与实施例1中方法相同；
(2)精氨酸母液的配制：称取1.1、2.2、3.3、4.4、5.5、6.6、7.7、8.8、9.9、11.0g 精氨酸溶于100mL纯水中，利用浓HCl调节pH至7.0使精氨酸充分溶解，制得不同梯度的精氨酸母液，121℃灭菌15min后备用；
(3)发酵培养：将准备好的种子液按照1.5％的接种量接入发酵培养基中，同时分别添加10mL不同浓度的精氨酸母液，于26℃、180rpm条件下振荡培养58h；
(4)HSAF产量检测：方法同实施例1中所述。
由图4可知，在本发明所述的添加范围内，能够提高HSAF产量，随着精氨酸浓度的提高，HSAF产量逐渐升高，当精氨酸添加浓度为5g/L时，HSAF产量达到最大，为560.31 mg/L，比对照提高39.91％。超过本发明所述的范围，HSAF产量出现下降。
实施例5：添加谷氨酸钠和精氨酸的混合物对HSAF发酵产量的影响
(1)此实施例中关于种子液制备、基本培养基配制，与实施例1中方法相同；
(2)精氨酸母液的配制：分别称取2.2、4.4、6.6、8.8、11.0g精氨酸溶于50mL纯水中，利用浓HCl调节pH至7.0使其充分溶解，制得不同梯度的精氨酸母液，121℃灭菌15min后备用；
谷氨酸钠母液的配制：分别称取2.2、4.4、6.6、8.8、11.0g谷氨酸钠溶于50mL纯水中，搅拌充分溶解，制得不同梯度的谷氨酸钠母液，121℃灭菌15min后备用；
(3)发酵培养：将准备好的种子液按照1.5％的接种量接入发酵培养基中，同时分别添加5mL不同浓度的精氨酸母液和5mL不同浓度的谷氨酸钠母液，于26℃、180rpm条件下振荡培养58h；
(4)HSAF产量检测：方法同实施例1中所述。
由图5(其中A为在谷氨酸钠培养基里添加不同浓度精氨酸，B为在精氨酸中添加不同浓度的谷氨酸钠)可知，不论是在谷氨酸钠培养基里添加不同浓度精氨酸，还是在精氨酸中添加谷氨酸钠，与添加单一的氨基酸相比，菌体生长和HSAF合成均受到抑制。

Claims (10)

1.一种提高抗真菌活性物质HSAF发酵产量的方法，其特征在于在菌株发酵前期添加单一的氨基酸或其盐进行发酵培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的氨基酸为谷氨酸或精氨酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于单一的氨基酸或其盐与发酵液的质量体积浓度为1～9g/L，优选的，当选用谷氨酸时，谷氨酸或其盐与发酵液的质量体积浓度为2～4g/L，更优选为4g/L；当选用精氨酸时，精氨酸或其盐与发酵液的质量体积浓度为1～8g/L，更优选为5～6g/L，最优选为5g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于氨基酸或其盐的添加时间在发酵时间的0～10h内，更优选为0～6h内，最优选为发酵6h时加入。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于菌株发酵条件为装液量20～24％，发酵温度25～27℃，发酵时间56～60h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养后的发酵液采用酸化-添加惰性物质-有机溶剂萃取的方法处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于酸化为采用HCl调节pH至3.0～4.5。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述惰性物质为无水CaCl2，添加量为(0.15～0.20)g/mL发酵液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为乙酸乙酯，添加量为(0.8～1.2)mL/mL发酵液。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于萃取条件为1500～2000rpm下涡旋混合振荡1～1.5min。
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