CN112239728B

CN112239728B - 一种适用于蛹虫草菌培养的含有还原型谷胱甘肽的合成培养基、制备方法及应用

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Publication number: CN112239728B
Application number: CN202011185798.3A
Authority: CN
Inventors: 王亮; 李鸿宇; 王际辉; 李倩; 李成; 王晗
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2040-10-30
Also published as: CN112239728A

Abstract

本发明公开了一种适用于蛹虫草菌培养的含有还原型谷胱甘肽的合成培养基、制备方法及应用。本发明通过在培养基中添加一定量还原型谷胱甘肽，显著提高谷胱甘肽过氧化物酶活力，大幅增加虫草素产量。此外，在液体培养体系，还原型谷胱甘肽还可以改变蛹虫草菌菌体形态，使其形成疏松网状结构的规则菌球，有助于发酵后期固液分离，实现菌体循环利用，可应用于虫草素工业化生产。

Description

一种适用于蛹虫草菌培养的含有还原型谷胱甘肽的合成培养基、制备方法及应用

技术领域

本发明属于农业、食品及生物医药领域，具体涉及一种通过还原型谷胱甘肽调控蛹虫草菌高产虫草素的方法。

背景技术

1950年Cunningham等首次从药用蕈菌蛹虫草Cordyceps militaris的发酵液中分离得到生物活性物质虫草素。虫草素作为蛹虫草菌的主要生物活性物质，自发现之后备受医学界的关注，其具有调节机体免疫功能，提高机体综合抗病能力，抗菌消炎等功效。虫草素能够有效抑制乳腺癌、宫颈癌细胞的增殖，美国国家癌症研究所研究人员发现虫草素对白血病具有很好的治疗作用，且已进入临床试验阶段。虫草素结构中存在一个游离的-OH，可以嵌入到肿瘤细胞的DNA和RNA中，阻止其磷酸化，从而抑制肿瘤细胞核酸的合成。此外，虫草素还对枯草芽孢杆菌、鸟结核杆菌、牛型结核分枝杆菌、链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌、葡萄球菌等病原菌，以及石膏样小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌、须疮癣菌等皮肤致病性真菌均有明显的抑制作用。

虫草素可以通过化学法和生物法两种途径获得。化学合成法由于其原料成本高、合成工艺繁琐、产物收率低、副产物多等诸多缺点限制了其广泛应用。生物法主要利用蛹虫草子实体或液体培养得到的菌丝体和培养液，从中提取虫草素。虽然蛹虫草子实体能够实现大规模人工培育，但由于培育周期长，培养过程不易控制，且虫草素含量低，使得大规模提取纯化的效率低、成本高。液体培养具有空间利用率高、发酵过程容易控制、且产物生成目的性强等优势。近年来，国内外学者开展了大量应用蛹虫草菌液体培养生产虫草素的研究，考察了培养方式、培养基成分、溶氧控制、前体物质添加等因素对蛹虫草菌合成虫草素的影响，提出了多种提高虫草素产量的有效策略。目前，文献报道中虫草素发酵产量不超过10g/L，但发酵周期长，虫草素生产强度低，难以为虫草素相关新药开发及其产业化生产提供原料保障。因此，大幅提高蛹虫草菌的虫草素生产能力并实现虫草素的规模化生产，具有重要经济及应用价值，是目前研究的主要方向。

发明内容

为弥补现有技术的空白，本发明提供了一种适于蛹虫草菌液体培养或固体培养的外源添加物质还原型谷胱甘肽，有助于提高虫草素产量。

本发明的发明构思是：由于氧化应激参与丝状真菌次级代谢调控。还原型谷胱甘肽作为还原性物质可以参与胞内ROS分解反应，调控胞内氧化还原状态。还原型谷胱甘肽不仅可以显著提高蛹虫草菌虫草素产量，而且在液体发酵体系可以改变菌体形态，形成较规则菌球形态。菌球内部形成较疏松的网状结构，形成一定氧浓度梯度，使得菌球内部的细胞处于氧供应缺乏的状态，有助于虫草素积累。此外，菌球形态便于发酵后期固液分离，实现菌体循环利用，可应用于虫草素工业化生产。

本发明首要目的是，提供一种适用于蛹虫草菌培养的合成培养基，该培养基包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素B₁，具体包括：20-50g/L葡萄糖、5-10g/L硫酸铵、0.5-1g/L磷酸氢二钾、0.5-1g/L磷酸二氢钾、0.5-10g/L硫酸镁、0.5-15g/L硫酸锌、5-10g/L甘氨酸、0.5-1g/L天门冬氨酸、0.5-2g/L谷氨酰胺、0.1-0.5g/L酪氨酸、0.05-0.2g/L半胱氨酸、0.5-1g/L亮氨酸、0.5-2g/L赖氨酸、0.05-0.5g/L苯丙氨酸、0.1-1g/L维生素B₁。

上述合成培养基与还原型谷胱甘肽组成含有还原型谷胱甘肽的合成培养基。

其中，上述含有还原型谷胱甘肽的合成培养基的制备步骤如下：

(1)将葡萄糖溶解于1份水中，作为组分A，单独装于三角瓶内，121℃条件灭菌15-20min；

(2)将无机盐硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁及硫酸锌溶解于4份水，作为组分B，单独装于三角瓶内，121℃条件灭菌15-20min；

(3)将维生素B₁、甘氨酸、天门冬氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸溶解于5份水，作为组分C，单独装于三角瓶内，利用0.45μm无菌滤膜过滤除菌，或121℃条件高温灭菌15-20min；

(4)将组分A、B和C按1：4：5体积比混合，配制成合成培养基；

(5)称取还原型谷胱甘肽溶于去离子水，每1000mL去离子水称取300g还原型谷胱甘肽，利用0.45μm无菌滤膜过滤除菌，添加至合成培养基中，制备含还原型谷胱甘肽的合成培养基。

上述步骤(1)、(2)、(3)中水的份数为体积份数。

进一步的，还原型谷胱甘肽添加量为1.0～3.0g/L。

本发明同时请求保护含有还原型谷胱甘肽的合成培养基在蛹虫草菌发酵生产虫草素中的应用。

所述应用为：以蛹虫草菌为生产菌株，将其按1％(v/v)接种量接种至含有还原型谷胱甘肽的液体合成培养基中，自然pH，25℃，160r/min下培养15～25d，还原型谷胱甘肽添加量为1.0～3.0g/L。

更具体地，所述方法包括：

①菌种活化：从4℃冷藏的蛹虫草菌试管斜面接种菌丝到固体培养基中，25℃静置培养2周至产生孢子；

②孢子悬液的制备：用0.9％NaCl清洗蛹虫草菌固体培养物，用无菌纱布过滤获得蛹虫草菌孢子悬液；

③液体培养：配制由组分A、B、C组成的合成培养基，向其中添加终浓度为1.0～3.0g/L的还原型谷胱甘肽，而后接入孢子悬液，终浓度控制在10⁵～10⁶孢子/mL)，25℃，160rpm下培养15-25d。发酵过程中取样检测生物量、残糖及虫草素产量，同时观察菌丝形态。

所述发酵生产虫草素的方法还可以为：

②孢子悬液的制备：用0.9％(w/v)NaCl清洗蛹虫草菌固体培养物，用无菌纱布过滤获得蛹虫草菌孢子悬液；

③固体培养：配制由组分A、B、C及2％(w/v)琼脂组成的固体合成培养基，向固体合成培养基中添加1～3g/L的还原型谷胱甘肽，而后接入孢子悬液，每100mL固体合成培养基涂布10⁶～10⁷孢子，于25℃，培养45-60d生长子实体，收集子实体提取胞内虫草素，测定其含量。

进一步的，上述方法步骤①中固体培养基为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、琼脂粉30g/L。

进一步的，在蛹虫草菌培养初期或中后期向合成培养基中添加还原型谷胱甘肽均能促进虫草素的合成。

本发明首次发现在液体培养体系中添加还原型谷胱甘肽提高虫草素含量。在发酵培养基中加入0.5～3.0g/L还原型谷胱甘肽，可使蛹虫草菌形成规则菌球形态。该形态控制策略有助于开发蛹虫草菌发酵分离耦合工艺。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过在培养基中添加一定量还原型谷胱甘肽，显著提高谷胱甘肽过氧化物酶活力，大幅增加虫草素产量。此外，在液体培养体系，还原型谷胱甘肽还可以改变蛹虫草菌菌体形态，使其形成疏松网状结构的规则菌球，有助于发酵后期固液分离，实现菌体循环利用，可应用于虫草素工业化生产。

附图说明

图1外源添加还原型谷胱甘肽对蛹虫草菌液体发酵的影响；

图2外源还原型谷胱甘肽对蛹虫草菌液体发酵中酶活力的影响；

图3外源还原型谷胱甘肽对蛹虫草菌液体发酵菌体形态的影响；其中，图A-E分别为添加0g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L及3.0g/L还原型谷胱甘肽添加组；图F和G分别为0g/L及3.0g/L还原型谷胱甘肽添加组菌丝体扫描电镜成像图片。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。本发明的方法可普遍适用蛹虫草菌，为详述本发明，下面实施例以蛹虫草菌C.militarisCGMCC 3.14242为例进行阐述。

实施例1

1)孢子培养：

配制固体培养基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄1 g/L、MgSO₄·7H₂O O.5g/L、琼脂粉30g/L)，在250-mL茄子瓶中装入80mL固体培养基，灭菌凝固后，从冷冻保藏管中挑取蛹虫草菌菌丝，接种于固体培养基，25℃培养两周。

2)孢子悬液制备：

向长有蛹虫草菌菌丝的茄子瓶中加入0.9％(w/v)的生理盐水，用玻璃棒搅拌使孢子脱落，之后用三层纱布过滤，获得孢子悬液。同时利用血球计数板镜检计数，确定孢子浓度及接种量。

3)液体摇瓶培养：

配制液体合成培养基(葡萄糖30g/L、(NH₄)₂SO₄5 g/L、KH₂PO₄1 g/L、K₂HPO₄1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、ZnSO₄·7H₂O 1.5g/L、甘氨酸5g/L、天冬门氨酸0.5g/L、谷氨酰胺1g/L、酪氨酸0.1g/L、半胱氨酸0.1g/L、亮氨酸0.5g/L、赖氨酸1g/L、苯丙氨酸0.2g/L、V_B10.2 g/L)，在250mL三角瓶中装入100mL液体合成培养基，121℃灭菌20min，接入孢子悬液(终浓度10⁵孢子/mL)，160rpm振荡培养20d。发酵过程中取样测定残糖浓度、虫草素浓度及单位细胞酶活力。

4)虫草素的检测：

发酵液中虫草素含量通过HPLC检测，色谱柱Venusil MP C18(2)(4.6mm x250mm)，流动相为甲醇、水，梯度洗脱，检测波长260nm，柱温25℃，流速0.8mL/min。

通过比较天然培养基及合成培养基中蛹虫草菌液体发酵表型参数，考察了不同培养基组成对蛹虫草菌生长及虫草素代谢的影响。

本实施例制作了天然培养基作为对照，天然培养基的组成为：葡萄糖30g/L、蛋白胨/酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L。步骤3)中，在250mL三角瓶中装入100mL天然培养基，121℃灭菌20min，接入孢子悬液，终浓度10⁵孢子/mL，25℃培养20d。发酵过程中取样测定残糖浓度、虫草素浓度及单位细胞酶活力。

实验结果表明，天然培养基中含有酵母粉、蛋白胨等丰富的营养成分，细胞生长略优于合成培养基条件，是合成培养基的1.1～1.2倍，然而合成培养基体系的虫草素合成能力明显强于天然培养基，其虫草素浓度是天然培养基的3～5倍。

实施例2

本实施例考察了向液体合成培养基中加入不同量的还原型谷胱甘肽，对蛹虫草菌液体发酵体系的虫草素产量的影响。

本实施例中除还原型谷胱甘肽终浓度不同，其余条件与实施例1相同。

在液体合成培养基中加入不同量的还原型谷胱甘肽，使得其终浓度分别为0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L及3.0g/L，以不添加组(0g/L GSH)为对照。向对照组和实验组接入相同浓度的孢子悬液(终浓度10⁵孢子/mL)，于25℃，160rpm振荡培养20d，并取样检测发酵液中虫草素含量。图1所示，添加不同浓度还原型谷胱甘肽均可以显著提高蛹虫草菌液体发酵体系的虫草素产量。当添加浓度为3.0g/L时，底物葡萄糖消耗速率显著低于对照组，第10d对照组残糖完全耗尽，而GSH添加组仍残留23.65g/L葡萄糖。与底物消耗相对应，GSH添加组的生物量积累也显著滞后于对照组，而当其残糖耗尽时生物量浓度达到14.45g/L，较对照组最大生物量提高21.42％。由图1d可见，在GSH存在条件下，蛹虫草菌的虫草素合成能力得到了极大提高，在第20d达到了439.69mg/L，是对照组的5.71倍。结果表明，外源添加GSH明显延长细胞生长的延滞期，但当菌体生长进入稳定期后GSH能显著增强蛹虫草菌的虫草素合成能力。

实施例3

本实施例考察了终浓度3.0g/L的还原型谷胱甘肽在培养第10、15、20天抗氧化酶活性。

本实施例中除培养时间不同，其余条件与实施例1相同。

在液体合成培养基中加入还原型谷胱甘肽，使得其终浓度分别为3.0g/L，以不添加组为对照。向对照组和实验组接入相同浓度的孢子悬液(终浓度10⁵孢子/mL)，25℃，160rpm振荡培养20d。选取第10、15、20d进行取样，检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)酶活力，如图2所示。分析SOD及CAT酶活发现，GSH添加组与对照组的SOD及CAT酶活仅在第10d有显著差异，这可能是由于GSH添加对细胞生长带来的延缓作用导致的，在第10d，对照组细胞生长已进入稳定期，而GSH添加组正处于对数生长期。第10d GSH添加组用虫草菌的SOD酶活力较对照组提高了54.09％，而CAT酶活力仅为对照组的43.39％。由图2c可见，虽然在虫草素积累的整个过程中GPX活力逐渐降低，但明显高于对照组，是其酶活力4.00～5.14倍。

实施例4

本实施例考察了液体培养体系菌丝形态的变化过程。

在液体合成培养基中加入还原型谷胱甘肽，使得其终浓度分别为3.0g/L，以不添加组为对照。向对照组和实验组接入相同浓度的孢子悬液(终浓度10⁵孢子/mL)，25℃，160rpm振荡培养20d。通过外源添加谷胱甘肽，经过20d液体摇瓶发酵发现，谷胱甘肽的添加会使菌丝形态发生变化。

外源添加GSH能够促进形成不同大小的菌球形态(图3A-E)。扫描电子显微镜(SEM)成像显示，对照组菌丝呈现分散菌丝形态，而GSH添加组则形成较规则菌球形态。结果表明，外源GSH能够改变菌丝形态，形成内部松散网状结构的菌球形体，与对照组菌丝网状结构相似，这种菌球结构会形成一定氧浓度梯度，使得菌球内部的细胞处于氧供应缺乏的状态。深层液体发酵体系及静止液体发酵体系的蛹虫草菌转录组数据显示，氧缺乏环境可能有利于虫草素的积累，表明菌球形态的形成在一定程度有助于虫草素积累。丝状真菌的生长形态与目标产物的关系密切，产物积累的最优菌体形态控制策略有利于开发发酵分离耦合工艺，实现菌体循环利用，最终实现虫草素高效生产。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims

1.含有还原型谷胱甘肽的合成培养基在蛹虫草菌发酵生产虫草素中的应用，其特征在于，采用合成培养基与还原型谷胱甘肽制备含有还原型谷胱甘肽的合成培养基，还原型谷胱甘肽添加量为1.0~3.0 g/L，该合成培养基包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素B₁；

具体包括：20-50 g/L葡萄糖、5-10 g/L硫酸铵、0.5-1 g/L磷酸氢二钾、0.5-1 g/L磷酸二氢钾、0.5-10 g/L硫酸镁、0.5-15 g/L硫酸锌、5-10 g/L甘氨酸、0.5-1 g/L天门冬氨酸、0.5-2 g/L谷氨酰胺、0.1-0.5 g/L酪氨酸、0.05-0.2 g/L半胱氨酸、0.5-1 g/L亮氨酸、0.5-2 g/L赖氨酸、0.05-0.5 g/L苯丙氨酸、0.1-1 g/L维生素B₁。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，合成培养基制备方法为：

（1）将葡萄糖溶解于1份水中，作为组分A，单独装于三角瓶内，121 ℃条件灭菌15-20min；

（2）将无机盐硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁及硫酸锌溶解于4份水，作为组分B，单独装于三角瓶内，121 ℃条件灭菌15-20 min；

（3）将维生素B₁、甘氨酸、天门冬氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸溶解于5份水，作为组分C，单独装于三角瓶内，利用无菌滤膜过滤除菌，或121 ℃条件高温灭菌15-20 min；

（4）将组分A、B和C按1：4：5体积比混合，配制成合成培养基；

（5）称取还原型谷胱甘肽溶于去离子水，每1000 mL去离子水称取300 g还原型谷胱甘肽，利用无菌滤膜过滤除菌，添加至合成培养基中，制备含还原型谷胱甘肽的合成培养基。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在蛹虫草菌培养初期或中后期向合成培养基中添加还原型谷胱甘肽。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以蛹虫草菌为生产菌株，将其按1%（v/v）接种量接种至含有还原型谷胱甘肽的液体合成培养基中，自然pH，25 ℃，160 r/min下培养15~25 d，还原型谷胱甘肽添加量为1.0~3.0 g/L。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

①菌种活化：从4℃冷藏的蛹虫草菌试管斜面接种菌丝到固体培养基中，25 ℃静置培养2周至产生孢子；

② 孢子悬液的制备：用0.9% NaCl清洗蛹虫草菌固体培养物，用无菌纱布过滤获得蛹虫草菌孢子悬液；

③ 液体培养：配制由组分A、B、C组成的合成培养基，向其中添加终浓度为1.0~3.0 g/L的还原型谷胱甘肽，而后接入孢子悬液，终浓度控制在10⁵~10⁶孢子/mL，25 ℃，160rpm下培养15-25 d。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

②孢子悬液的制备：用0.9% (w/v) NaCl清洗蛹虫草菌固体培养物，用无菌纱布过滤获得蛹虫草菌孢子悬液；

③固体培养：配制由组分A、B、C及2% (w/v)琼脂组成的固体合成培养基，向固体合成培养基中添加1.0~3.0 g/L的还原型谷胱甘肽，而后接入孢子悬液，每100 mL固体合成培养基涂布10⁶~10⁷孢子，于25 ℃，培养45-60 d生长子实体，收集子实体提取胞内虫草素，测定其含量。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤①中固体培养基为葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、琼脂粉30 g/L。