CN114317587B

CN114317587B - 一种过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因提高虫草素产量的方法

Info

Publication number: CN114317587B
Application number: CN202210021555.9A
Authority: CN
Inventors: 王亮; 卫丽娟; 李鸿宇; 李倩; 李成; 刘玉佳; 刘冰南; 张悦; 王际辉
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114317587A

Abstract

本发明公开了一种过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因提高虫草素产量的方法。本发明利用根癌农杆菌介导的蛹虫草菌转化技术将过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因的重组载体导入蛹虫草中，构建蛹虫草重组菌株，经液体深层发酵虫草素发酵产量显著提高。蛹虫草重组菌株发酵第20d虫草素产量达到了868.53±50.11mg/L，为出发菌株的4.30倍。本发明提出了一种基于氧化应激调控策略改造蛹虫草菌构建高产虫草素的重组菌株的方法，也适用于利用其他微生物高产虫草素工艺的开发，具有工业化应用前景。

Description

一种过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因提高虫草素产量的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种基于氧化应激调控策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法。

背景技术

蛹虫草菌(Cordyceps militaris)是中国传统药用菌，含有多种生物活性成分，虫草素作为蛹虫草的主要活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生理功能。虫草素的合成方法包括化学合成和生物合成，其中生物合成包括子实体提取、菌丝体液体发酵等，而液体发酵是虫草素的重要生产途径，但现阶段虫草素发酵产量较低，无法满足工业化生产需求，因此，亟需通过代谢工程改造或发酵工程优化提高虫草素的发酵产量。

目前，利用蛹虫草菌进行液体发酵提高虫草素产量的研究主要集中在三个方面(菌种选育、培养基成分优化和添加物质优化)，虽然虫草素的生物合成途径已初步解析，但虫草素代谢调控机制尚不清晰，开发基于虫草素代谢调控机制的基因工程策略是进一步提高蛹虫草菌虫草素产量的重要途径。

在微生物生长或代谢过程中，胁迫环境会诱导细胞积累过多活性氧(reactiveoxygen species，ROS)(超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)，改变胞内氧化还原平衡，引发氧化应激，导致蛋白质、脂质、核酸等生物大分子严重损伤，严重影响菌体生长及产物积累。为调节胞内ROS水平，细胞已进化形成了非酶促和酶促抗氧化系统，其中抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸盐过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)是重要的抗氧化酶之一，参与许多细胞功能，可以清除胞内的H₂O₂、有机氢过氧化物及脂质过氧化物，调节胞内氧化还原稳态平衡。大量研究表明，氧化应激参与丝状真菌次级代谢调控，基于氧化应激调控策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量具有可行性。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程技术改造参与氧化应激调控的关键酶获得蛹虫草重组突变菌株，且该重组突变菌株经液体发酵后虫草素产量较原始菌株显著提高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首要目的是请求保护过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因GpxA在提高虫草素产量中的应用，基因GpxA具有如SEQ ID NO.3所示序列。

本发明还提供了一种通过过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因GpxA提高虫草素产量的方法，所述提高虫草素产量的方法是通过基因工程手段将目的基因GpxA导入蛹虫草菌中，构建过表达GpxA的蛹虫草重组菌株；所述目的基因为谷胱甘肽过氧化物酶编码基因GpxA。

具体地，所述过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因GpxA的蛹虫草重组菌株按以下方法构建：

(1)提取蛹虫草菌mRNA，逆转录制备cDNA，以蛹虫草cDNA为模板克隆GpxA基因；

(2)将目的基因GpxA与线性化表达载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，经PCR扩增、酶切、基因测序等验证后，筛选转化子获得含重组表达载体的大肠杆菌；

(3)液体培养上述筛选获得的含重组表达载体的大肠杆菌，提取质粒，将重组表达载体转入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciensAGL-1感受态细胞中，利用含50-100μg/mL羧苄青霉素及50-100μg/mL卡那霉素的YEB固体培养基进行培养并筛选转化子，经PCR扩增、酶切等验证后，获得含重组表达载体的根癌农杆菌株；

(4)将上述筛选得到的含重组表达载体的根癌农杆菌经IM液体培养基诱导培养后，与蛹虫草孢子悬液在IM固体培养基上共培养，并覆盖含头孢噻肟和苯菌灵的M-100固体培养基，筛选蛹虫草菌转化子并进一步在含头孢噻肟和苯菌灵的M-100固体培养基进行二次筛选，得到蛹虫草重组菌株；

(5)提取上述筛选得到的蛹虫草重组菌株的基因组，经PCR扩增及测序验证确认目的基因成功整合到基因组上，进而开展摇瓶液体发酵，利用HPLC检测发酵液中虫草素产量，筛选获得虫草素产量提高的蛹虫草重组菌株；

(6)经多次传代培养并经液体发酵验证，最终获得高产虫草素且稳定遗传的蛹虫草重组菌株。

进一步，步骤(1)中所述谷胱甘肽过氧化物酶基因的基因符号为GpxA，Genebank核苷酸序列号CCM_03086。所述目的基因GpxA利用PCR技术以蛹虫草菌cDNA为模板扩增所得，所述蛹虫草菌为Cordyceps militaris，所述GpxA基因PCR扩增引物对分别为：

GpxA-F：5’-ATGTCTTCTGCCGCGTCC-3’；

GpxA-R：5’-TCACTCGGCTTTTTTGTTAATCTCG-3’。

进一步，步骤(2)所述线性化载体为pDHt-SK-BenA。BenA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，步骤(3)所述YEB固体培养基各组分为：蛋白胨10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸粉1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，琼脂粉20g/L。

进一步，步骤(4)所述IM培养基各组分为：IM液体培养基(200mL)各组分为：80mL2.5×MM盐(KH₂PO₄3.625 g，K₂HPO₄·3H₂O 6.72g，MgSO₄·7H₂O1.250g，NaCl 0.375g，CaCl₂0.125 g，FeSO₄·7H₂O 0.0062g，(NH₄)₂SO₄1.250g，ddH₂O添加最终体积至1L，灭菌后室温保存)，0.36mL 10mM葡萄糖溶液，1mL 0.5％甘油，添加ddH₂O至192mL(灭菌后冷却到50℃后添加8mL 1MMES及4mL 10mMAS)。IM固体培养基(400mL)各组分为：160mL 2.5×MM盐，0.36mL 5mM葡萄糖溶液，2mL 0.5％甘油，ddH₂O添加至376mL，琼脂6g(灭菌后冷却到50℃后添加16mL 1M MES及8mL 10mMAS)。

进一步，步骤(4)所述M-100固体培养基组分如下：首先，配制M-100微量元素液(H₃BO₃30 mg，MnCl₂·4H₂O 70mg，ZnCl₂200 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 20mg，FeCl₃·6H₂O 50mg，50mg 200mg，ddH₂O定容到最终体积500mL)；其次，配制M-100盐溶液(KH₂PO₄16 g/L，Na₂SO₄·10H₂O 9.064g/L，KCl 8g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，CaCl₂1 g/L，添加8mL M-100微量元素液，ddH₂O定容到最终体积1L)；最后配制M-100固体培养基(葡萄糖10g/L,KNO₃3 g/L，加入M-100盐溶液62.5mL，ddH₂O定容到最终体积1L，加入15g琼脂，121℃灭菌20min)。

进一步，步骤(5)和(6)中蛹虫草重组菌株液体发酵采用合成培养基，该培养基包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素B₁。具体包括：20-50g/L葡萄糖、5-10g/L硫酸铵、0.5-1g/L磷酸氢二钾、0.5-1g/L磷酸二氢钾、0.5-10g/L硫酸镁、0.5-15g/L硫酸锌、5-10g/L甘氨酸、0.5-1g/L天门冬氨酸、0.5-2g/L谷氨酰胺、0.1-0.5g/L酪氨酸、0.05-0.2g/L半胱氨酸、0.5-1g/L亮氨酸、0.5-2g/L赖氨酸、0.05-0.5g/L苯丙氨酸、0.1-1g/L维生素B₁。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：通过基因工程的手段构建了能够稳定遗传且高产虫草素的蛹虫草重组菌株，该重组菌株与野生菌株相比，液体深层发酵20d虫草素产量达到了868.53±50.11mg/L，较野生型虫草素发酵产量显著提高(提高330.12％)，为基于基因工程改造蛹虫草菌高效生产虫草素提供重要靶点，也适用于利用其他微生物高产虫草素工艺的开发，具有工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明构建的过表达载体上启动子、终止子以及目的基因的PCR扩增结果。其中，(a)M:DL2000 DNAMarker,1-2:GpxA；(b)M:DL2000 DNA Marker,1-2:Gpd启动子；(c)M:DL10000 DNAMarker,1-2:Nos终止子。

图2为本发明构建的pDHt-SK-BenA表达载体的双酶切验证结果。M:DL15000DNAMarker,1:pDHt-SK-BenA双酶切(Eco53KI、XbaI)。

图3为本发明构建的过表达载体pDHt-SK-BenA-GpxA的PCR及酶切验证结果。其中，(a)M:DL5000 DNA Marker,1-3:pDHt-SK-BenA-GpxA(E.coli DH5α)菌液PCR验证；(b)M:DL15000 DNA Marker,1-2:pDHt-SK-Be nA-GpxA(E.coli DH5α)双酶切验证(XbaI，Eco53KI)。

图4为本发明中根癌农杆菌转化子的PCR及酶切验证。(a)M:DL2000DNA Marker,1-3:pDHt-SK-BenA-GpxA(A.tumefaciens AGL-1)菌液PCR验证；(b)M:DL15000 DNA Marker,1-2:pDHt-SK-BenA-GpxA(A.tumefacie ns AGL-1)单酶切验证(EcoRI)；(c)M:DL5000 DNAMarker,1-2:Lsm3启动子PCR产物(从A.tumefaciens AGL-1中提取质粒验证)；(d)M:DL5000DNA Marker,1-2:Gpd promoter-GpxA-nos terminator(从A.tumefaciens AGL-1中提取质粒验证)；(e)M:DL2000 DNA Marker,1-2:BenA-Ura3 ter minator(从A.tumefaciens AGL-1中提取质粒验证)；(f)M:DL15000 DNA Marker,1-2:pDHt-SK-BenA-GpxA单酶切(从A.tumefaciens AGL-1中提取质粒验证)。

图5为本发明构建的蛹虫草重组菌株的PCR验证结果。其中，(a)蛹虫草菌转化得到转化子；(b)M:DL2000 DNAMarker,1-4:以转化子基因组DNA为模板PCR扩增的BenA片段(1846bp)；(c)1-2:转化子提取的基因组；(d)以转化子基因组DNA为模板进行PCR扩增,M:DL2000 DNA Marker,1-2:Gpd-GpxA-Nos(1801bp),3-5:BenA(1846bp)。

图6为本发明构建的过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因的蛹虫草重组菌株液体发酵参数。其中，a-c：重组菌株C.militaris GpxA-OE和出发菌株的生物量(a)、残糖浓度(b)和虫草素浓度(c)变化。

图7为本发明过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因重组载体的构建流程。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明保护范围并不局限于此，本发明保护范围以权利要求为准。本发明蛹虫草菌Cordyceps militaris和根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciensAGL-1均为本领域已知菌种，可从商业渠道获得，为了详细阐述实施例，本实施例所用蛹虫草菌为C.militaris FFCC 5111，由大连工业大学生物工程学院选育保藏。

实施例1：重组表达载体pDHt-SK-BenA-GpxA的构建

提取蛹虫草菌C.militaris FFCC 5111的mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板利用表1中引物PCR扩增GpxA基因、Gpd启动子及Nos终止子片段(图1)。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用DNA胶回收试剂盒回收目的片段(存放于-20℃备用)。胶收产物送华大基因科技有限公司进行基因测序，选取测序正确的PCR胶收产物进行后续实验。

将本实验室构建的pDHt-SK-BenA表达载体进行双酶切(Eco53KI、XbaI)(图2)，运用无缝克隆技术将Gpd启动子、GpxA基因、Nos终止子片段连接到线性化的表达载体上，经PCR、酶切及测序验证(图3)，最终构建GpxA过表达载体pDHt-SK-BenA-GpxA。

表1本实验所用引物

实施例2：根癌农杆菌介导pDHt-SK-BenA-GpxA转入蛹虫草菌

利用化学转化法将重组表达载体pDHt-SK-BenA-GpxA转入大肠杆菌DH5α中，通过液体培养大肠杆菌后提取质粒，获得大量重组表达质粒。进一步，利用化学转化法将重组表达载体pDHt-SK-BenA-GpxA转入根癌农杆菌AGL-1中，获得含pDHt-SK-BenA-GpxA载体的根癌农杆菌AGL-1(图4)。根癌农杆菌培养所用YEB培养基：蛋白胨10g/L，蔗糖5g/L，酵母浸粉1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，加蒸馏水溶解，pH 7.0。固体培养基需添加琼脂粉20g/L。LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，加蒸馏水溶解，3M NaOH调节pH至7.0。固体培养基需添加琼脂粉20g/L。

将成功转化含重组表达载体的AGL-1加入到4mL液体YEB培养基中(向YEB培养基中加入50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素)，28℃，220rpm，培养过夜，8000rpm离心2min收集菌体，弃上清，加入适量的IM液体培养基重悬菌体，培养到OD₆₅₀约0.15，进一步在28℃，150rpm条件下诱导培养至OD₆₅₀＝0.5～0.8。取诱导后AGL-1菌液及新鲜制备的野生型蛹虫草孢子悬液(10⁵个/mL)混合于1.5mL离心管，取100μL上述混合液均匀涂布于IM固体培养基，28℃共培养48h，每个共培养的IM平板加入15mLM-100固体培养基(添加头孢噻肟和苯菌灵)进行覆盖，25℃继续培养10d左右至生长出单菌落。挑取上述菌落到新的M-100固体培养基平板(含头孢噻肟和苯菌灵)上进行二次筛选，用SDB液体培养基对二次筛选平板上的菌落在摇床培养，提取菌丝基因组进行PCR验证(图5)，所用引物如表1所示。

M-100固体培养基配制方法如下：1)配制M-100微量元素液：H₃BO₃30 mg，MnCl₂·4H₂O 70mg，ZnCl₂200 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 20mg，FeCl₃·6H₂O 50mg，50mg 200mg，ddH₂O定容到最终体积500mL；2)配制M-100盐溶液：KH₂PO₄16g/L，Na₂SO₄·10H₂O 9.064g/L，KCl 8g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，CaCl₂1 g/L，添加8mL M-100微量元素液，ddH₂O定容到最终体积1L；3)配制M-100筛选培养基：葡萄糖10g/L,KNO₃3 g/L，加入M-100盐溶液62.5mL，ddH₂O定容到最终体积1L，加入15g琼脂，121℃灭菌20min。

实施例3：蛹虫草菌孢子培养及孢子悬液的制备

在250mL茄子瓶中装入80mL固体培养基(葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄1 g/L、MgSO₄·7H₂O O.5g/L、琼脂粉30g/L)，灭菌，待其凝固后，从-80℃冷冻保藏管中挑取蛹虫草菌菌丝，接种于上述固体培养基，静置在25℃培养箱培养两周。向长有蛹虫草菌丝的茄子瓶中加入0.9％(w/v)的生理盐水，用玻璃棒搅拌使孢子脱落，将瓶中液体用三层纱布过滤，获得孢子悬液。用血球计数板计数，确定孢子浓度及接种量。

实施例4：蛹虫草发酵液中虫草素含量测定

发酵液中虫草素含量利用高效液相色谱进行检测，高效液相色谱条件如下：Waters e2695，检测器为Waters 2998，紫外检测器波长为260nm，色谱柱选用Venusil MPC18(2)(4.6×250mm,5μm)，柱温设定25℃，流动相条件为甲醇∶水(5∶95)梯度，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。

实施例5：蛹虫草重组菌株液体发酵及虫草素含量测定

选取蛹虫草菌C.militaris FFCC 5111为对照组，开展过表达GpxA的蛹虫草重组菌株Gpx-OE的深层液体发酵。液体发酵所用培养基为合成培养基(包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素B₁)，该合成培养基的具体制备过程在发明人另一篇发明专利CN112239728A中已详细阐述，本实施例中所使用的合成培养基组成为：葡萄糖30g，(NH₄)₂SO₄5 g，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，维生素B10.2 g，甘氨酸5g，天冬氨酸0.5g，谷氨酰胺1g，酪氨酸0.1g，半胱氨酸0.1g，亮氨酸0.5g，赖氨酸1g，苯丙氨酸0.2g，ZnSO₄·7H₂O 3mM，ddH₂O添加至1L。作为更优选的合成培养基，还可加入1-3g/L还原型谷胱甘肽。

使用250mL锥形瓶(装液量为100mL)进行液体发酵实验，按1％接种量接入蛹虫草孢子悬液，孢子终浓度为1×10⁵孢子/mL，25℃，160r/min振荡培养20d，期间取样测定生物量浓度、残糖浓度及虫草素产量(图6)。过表达GpxA基后，葡萄糖消耗较对照组缓慢，同时菌体生长也延缓，发酵第10d其生物量浓度为8.26±2.28g/L，而对照组的生物量浓度达到9.73±2.17g/L；而虫草素合成能力大幅提高，第20d虫草素产量达到了868.53±50.11mg/L，较对照组提高330.12％。实验结果表明，虽然过表达GpxA使蛹虫草菌细胞生长的延滞期延长，但显著增强其虫草素合成能力，表明氧化还原调控在虫草素代谢中起重要作用。

序列表

<110> 大连工业大学

<120> 一种过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因提高虫草素产量的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA/RNA

<213> Gpd启动子序列(启动子序列Gpd)

<400> 1

ggccaatttg tctattctgg tagttccgcc gtggccaact tgacggttca ctggttttgt 60

gtcttgatga ctgacaaaga gggccagaga tgagacgacg agctgccggt tgcaccatca 120

gccaaccgtt cgcagaaatc atcagttgcg ctacagtcaa catagcgggt ggtcaaagtt 180

tgcgtgggca cgggttgccg cacgagttgg aacgtcagta aagtggggga ggggaagcaa 240

ccagaacgag gccaattgaa tgggatgaag gcgtctggga gggaagcacg agcgtgaatg 300

aatggacggt tgcgtgactc tggtctcgcg atttcgatcg agtcaaggaa cccgtatggt 360

tgcctcttgt cttggagagc tcgtcgaggc ccaagctgcg agtatatggt tggtgatgcg 420

ctgggcattt gcccctctct gcccctccat ggacggacct gcagctcttg ggctggcaag 480

gtgttgcgct acgtcgagat gcggttaggt aagctggcat aagctggcat aaggttggct 540

gttcttgaga aatcaggcca gcagtcttgc acctctctgg ctacaggctc tccagcggtc 600

agccaccgcc actccagcgc ctgtttttca ctgacgatgg ccttgttttt ttgttgctct 660

ggcagctggc aagctgggtc ccggcagctg ccacggccaa gccacccagg actacaaaac 720

catttgccca cccctcctct tcgccgtgcg tctcttcttt ttctcccctc cattacacct 780

cattcttcag ttcaaaggaa caaaagtgag ttttccatcc gtcccacacc tggctccatc 840

atctcgagct tcattgcttc ttgaccatct accacgctct accctccaac agcttcgctc 900

acccaagagc tgcctgcttt tcccctcctc tccacgaccc cgccatccac cacttaacct 960

aaagttaccc ctcgctaacc gccaaacgtc ccaacaggtt tttcttctct cacctcactt 1020

ttctaatcaa gaaca 1035

<210> 2

<211> 253

<212> DNA/RNA

<213> Nos终止子序列(终止子序列Nos)

<400> 2

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 3

<211> 513

<212> DNA/RNA

<213> GpxA基因序列(基因序列GpxA)

<400> 3

atgtcttctg ccgcgtcctt ttacgacttc aagccgctcg acaagcgcgg ccaggagctg 60

cccctcacca actaccgcgg catggtcgtc ctcgtcgtca acacggcctc caagtgcggc 120

ttcaccggcc agtacgccgg cctcgaaaag ctttaccagt ccctcgccgc caagcatccc 180

gacgactttg tcatcctcgg ctttccctgc aaccagtttg gctcccagga gcccggcagc 240

aacgacgaca cccagacctt ttgccaggtc aactacggcg tcacctttcc catcttgcag 300

aaaatcgacg tcaacggcga caaggccgcg cccgtctacg agtggctcaa gagcgagaag 360

cccggcctgc tcggcctcaa gcgcatcaag tggaactttg aaaagttcct cgtcggccgc 420

gacggcaagg tcgtcaaccg ctgggccagc accaccaccc cggagtcgct cgagaaggag 480

attgtcgccg agattaacaa aaaagccgag tga 513

<210> 4

<211> 1344

<212> DNA/RNA

<213> BenA基因序列(基因序列BenA)

<400> 4

atgcgtgaga ttgtccactt gcaaaccggc cagtgcggca accagattgg cgccgctttc 60

tggcagacca tctcgggcga gcacggcctc gacggctcgg gcgtttacaa cggcacctct 120

gacctccagc tagagcgtat gaacgtttac ttcaacgagg cgtccggcaa caagtacgtc 180

ccccgtgctg ttctggttga cctggagccc ggcactatgg acgctgttcg tgccggcccc 240

ttcggccagc tgttccgtcc cgacaacttc gttttcggcc agtctggcgc tggcaacaac 300

tgggctaagg gccactacac cgagggcgct gaactggttg accaggtcct ggacgttgtc 360

cgtcgtgagg ctgagggctg cgactgccta caaggcttcc agattaccca cagcctgggc 420

ggcggcaccg gcgccggcat gggcaccctc ctcatctcta agatccgtga ggagttcccc 480

gaccgaatga tggctacctt ctcggttgtc ccctcgccca aggtatcgga caccgttgtt 540

gagccctaca acgctaccct cagcgtccac cagctggtcg agaactctga cgctaccttc 600

tgcattgaca acgaggctct gtacgacatt tgtatgcgaa ccctgaagct gtctaacccc 660

tcctacggcg acctgaacca cctggttagc gctgttatgt cgggcgtcac cacctgcctg 720

cgattccccg gccagctcaa ctcggacctc cgaaagctcg ccgttaacat ggtccccttc 780

ccccgactgc acttcttcat ggttggcttc gctcccctca ccagccgcgg cgcccactct 840

ttccgcgccg ttaccgtccc cgagctgacc cagcagatgt acgaccccaa gaacatgatg 900

gccgcctcag acttccgaaa cggccgatac ctcacctgct ccgccatttt ccgtggcaag 960

gttagcatga aggaggtcga ggaccagatg cgtaacgttc agaacaagaa ctcttcttac 1020

ttcgtcgagt ggattcccaa caacgttcag accgccctgt gctctattcc cccccgtggc 1080

ctcaagatgt cgtctacctt cgttggcaac tctacctcta ttcaggagct gttcaagcgt 1140

gttggcgacc agttcaccgc tatgttccgt cgtaaggctt tcctccactg gtacaccggc 1200

gagggcatgg acgagatgga gttcaccgag gctgagtcta acatgaacga cctggtttcg 1260

gagtaccagc agtaccagga tgcctcgatc tctgagggcg aggaggagta cgaggaggag 1320

gttcccattg agggcgagga gtaa 1344

Claims

1.过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因GpxA在提高虫草素产量中的应用，其特征在于，过表达的谷胱甘肽过氧化物酶基因GpxA来源于蛹虫草菌或其他生物体的谷胱甘肽过氧化物酶编码基因，该基因为SEQ ID NO.3所示序列。

2.一种过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因提高虫草素产量的方法，其特征在于：通过基因工程的手段将目的基因GpxA导入蛹虫草菌中构建GpxA基因过表达的蛹虫草重组菌株，过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因GpxA为SEQ ID NO.3所示序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，运用根癌农杆菌介导的蛹虫草菌转化技术将过表达GpxA基因的重组载体导入蛹虫草菌中，构建蛹虫草重组菌株。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，构建流程如下：

S1.将目的基因GpxA与线性化载体pDHt-SK-BenA连接后，转入大肠杆菌感受态细胞中，经PCR扩增、酶切、基因测序验证筛选转化子，获得含重组载体pDHt-SK-BenA-GpxA的大肠杆菌；

S2.液体培养S1得到的含重组载体pDHt-SK-BenA-GpxA的大肠杆菌，提取质粒，将所述重组载体转入根癌农杆菌AGL-1感受态细胞中，利用含50-100μg/mL羧苄青霉素及50-100μg/mL卡那霉素的YEB固体培养基进行培养并筛选转化子，经PCR扩增、酶切验证后，获得含重组载体pDHt-SK-BenA-GpxA的根癌农杆菌；

S3.将步骤S2得到的含重组载体pDHt-SK-BenA-GpxA的根癌农杆菌在IM液体培养基中诱导培养后，与蛹虫草菌孢子悬液在IM固体培养基上共培养，同时覆盖含头孢噻肟和苯菌灵的M-100固体培养基，筛选蛹虫草转化子并进一步在含头孢噻肟和苯菌灵的M-100固体培养基上进行二次筛选，经PCR扩增、基因测序验证，得到过表达谷胱甘肽过氧化物酶基因GpxA的蛹虫草重组菌株。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，目的基因GpxA为通过PCR技术以蛹虫草cDNA为模板扩增得到，PCR扩增所用引物对为GpxA-F：ATGTCTTCTGCCGCGTCC；GpxA-R：TCACTCGGCTTTTTTGTTAATCTCG。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，线性化载体为含有苯菌灵抗性基因BenA的表达载体pDHt-SK-BenA，BenA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蛹虫草重组菌株是在合成培养基中开展液体深层发酵积累虫草素，所述合成培养基包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素B₁；具体包括：20-50g/L葡萄糖、5-10g/L硫酸铵、0.5-1g/L磷酸氢二钾、0.5-1g/L磷酸二氢钾、0.5-10g/L硫酸镁、0.5-15g/L硫酸锌、5-10g/L甘氨酸、0.5-1g/L天门冬氨酸、0.5-2g/L谷氨酰胺、0.1-0.5g/L酪氨酸、0.05-0.2g/L半胱氨酸、0.5-1g/L亮氨酸、0.5-2g/L赖氨酸、0.05-0.5g/L苯丙氨酸、0.1-1g/L维生素B₁。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，合成培养基还包括1-3g/L还原型谷胱甘肽。