CN114921354B - 一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程与过程工程领域，公开了一种产虫草素及其衍生物3’‑脱氧肌苷的工程菌株及其制备方法和应用。包括密码子优化基因Cm1、Cm2、基因扩增与回收片段、甲醇诱导启动子及终止子片段、表达载体连入基因后转入毕赤酵母筛选，得到本发明保护的毕赤酵母工程菌株，该工程菌株可应用于生产虫草素及其衍生物。由本发明制备方法制备的工程菌株在生产虫草素及其衍生物上优势巨大，由于利用特有的蛹虫草菌株产出特有Cm1、Cm2基因，产虫草素效率提升巨大，且后续可实现利用二氧化碳生产虫草素及其衍生物3’‑脱氧肌苷的绿色工艺。

Description

一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程与过程工程领域，具体涉及一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株及其制备方法和应用。
背景技术
虫草素，是食药用真菌蛹虫草的主要活性成分，具有天然的生物活性和独特的药理作用，其中包括抗菌、抗炎、抗肿瘤与抗白血病等，在医药和保健上都有巨大的开发价值和广阔的市场前景。现阶段主要通过化学合成、蛹虫草子实体提取或菌丝体发酵获取虫草素。然而，化学合成原料成本高、合成路线繁琐且产率低。国内外等有关研究所均有报道能从蛹虫草子实体与菌丝体发酵中获得虫草素，但生产周期比较长，生产强度低等缺点导致了虫草素价格较为昂贵，至今还未有可以实现虫草素工业化生产的报道。
随着组学技术的发展，蛹虫草中虫草素生物合成途径已基本阐明。已有报道证明，以酿酒酵母为底盘细胞，成功构建虫草素合成的细胞工厂，但受限于外源基因的低水平表达等原因，虫草素发酵产量较低。因此，迫切的需要开发一种绿色且经济高效的工艺来生产虫草素。
近年来，毕赤酵母、汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母等非常规酵母因底物谱广、可高密度培养、抗逆性强等优点而引起广泛关注，部分非常规酵母作为新型的酵母表达系统已被应用于工业上生产多种高附加值产品、生物燃料与生物材料等。此外，许多非常规酵母的基因组已经完全测序，并开发了基因编辑工具，为非常规酵母细胞工厂的构建提供强有力的技术保障。但是以非常规酵母为底盘细胞，异源合成虫草素的研究还未见有报道。
此外，在蛹虫草体内虫草素会脱氨生成3’-脱氧肌苷，被认为是虫草素的一种解毒机制。而3’-脱氧肌苷可以作为一种单体来生产生物基材料，特别是其含有刚性环与多个羟基，且无需虫草素结构合成聚合物要考虑的氨基保护策略，具有开发特种工程塑料的潜力，潜在材料特征极有可能远优于脂肪链来源的生物基材料，具有较好的应用前景。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株及其制备方法和应用，工程菌株为自絮凝菌株毕赤酵母工程菌株，其发酵产出的虫草素及其衍生物滴度高、生产时间短，发酵培养基成分简单有利于后续分离，使用的毕赤酵母因自絮凝特性可以简化离心步骤，絮凝菌可以通过简单的固液分离装置实现原位发酵-分离耦合，进一步提高生产强度，絮凝可提高菌体密度，进一步增加目的产物滴度，缩短发酵时间。而且通过pH调节可实现在同一株菌实现虫草素或者3’-脱氧肌苷生产模式切换。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株的制备方法，包括以下步骤：
1.按毕赤酵母密码子偏好性优化蛹虫草L5111的氧化还原酶基因Cm1和金属离子依赖的磷酸水解酶基因Cm2，Cm1是如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，Cm2是如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，所述蛹虫草L5111保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2022年4月27日，保藏编号为CCTCC M 2022505，拉丁文名称为Cordyceps militaris；
2.对步骤1所述的基因Cm1、Cm2进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳回收片段；
3.克隆毕赤酵母甲醇诱导启动子DAS2p、AOX1p、FLD1p及终止子AOX1t、RPS25At、CYCt片段；
4.构建毕赤酵母的表达载体然后连入步骤1所述启动子DAS2p、AOX1p、FLD1p、结构基因Cm1、Cm2，随后化转或电转转入毕赤酵母中，通过表达载体所带抗性标记筛选得到毕赤酵母工程菌株，其中，所述毕赤酵母中引入酿酒酵母FLO1基因(其基因系统名称为YAR050W)并通过基因编辑实现基因组上的FLO1二次延长。
本发明的另一个目的是保护上述制备方法制备的产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株。
本发明的再一个目的是保护上述产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株的应用。
进一步的，所述产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株的应用，包括生产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷。
本发明与现有技术相比的有益效果是：由本发明制备方法制备的工程菌株过表达的Cm1、Cm2基因来自于实验室分离的高产虫草素的蛹虫草C.militaris L5111，其中Cm1蛋白序列与已报道的蛹虫草菌Cm1蛋白序列有14个氨基酸的差别，C.militaris L5111的虫草素产量较已报道的菌株提高约5倍；在表达宿主方面，本发明选用了非常规酵母毕赤酵母，在生产虫草素及其衍生物上优势巨大，具体体现为：(1)滴度高、生产时间短：已有报导酿酒酵母虫草素表达体系优化后产量也仅有0.1g/L左右，发酵时间3-7d；蛹虫草菌虫草素液体发酵产量在0.1-1.0g/L之间，但发酵时间长达30-40天；而毕赤酵母发酵时间仅需要7-8d，较蛹虫草可以缩短2/3以上，摇瓶未优化体系已经达到近1.0g/L的产量(优化后摇瓶产量接近2.7g/L)，OD600在8-12；而发酵罐高密度培养毕赤酵母的OD600可达到100左右，结合发酵分离耦合产量可达5-10g/L。因此毕赤酵母体系无论是生产滴度还是生产强度合成虫草素都优势巨大。(2)发酵培养基成分简单有利于后续分离：蛹虫草这一丝状真菌体系对培养基系统要求高，培养基成分复杂、存在大量有机成分，代谢产物也十分复杂，存在大量胞外多糖等物质干扰后续虫草素分离；而毕赤酵母一方面可以利用廉价甲醇作为碳源，特别是二氧化碳转化为一碳甲醇的技术日渐成熟，后续可实现利用二氧化碳生产虫草素及其衍生物的绿色工艺；另一方面毕赤酵母可采用FM22或BSM混合盐发酵体系，铵盐作为氮源，合成的无机培养体系会更进一步降低分离体系复杂度，而且测定发现虫草素及其衍生物95％以上均在毕赤酵母胞外，使得发酵-分离耦合等技术的进一步应用得以实现。(3)本发明仅需要调节发酵初始pH，就可以用同一株菌完成生产虫草素或其衍生物3’-脱氧肌苷的模式选择，而且另一种产物含量极低不会对分离造成干扰。如pH在4-6、处在虫草素生产模式，HPLC几乎检测不到3’-脱氧肌苷的产物峰；pH在7-8处于3’-脱氧肌苷的生产模式，虫草素终点含量低于1％。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明
图1表达载体的构建流程图；
图2A酵母工程菌株THP-292发酵液虫草素的HPLC检测谱图；
图2B酵母工程菌株THP-292发酵液虫草素的质谱鉴定图；
图2C酵母工程菌株THP-292发酵液3’-脱氧肌苷的HPLC检测谱图；
图2D酵母工程菌株THP-292发酵液3’-脱氧肌苷的质谱鉴定图；
图2E酵母工程菌株THP-292发酵产3’-脱氧肌苷的1H NMR谱图；
图3A酵母工程菌株THP-292发酵生产虫草素随时间变化示意图；
图3B酵母工程菌株THP-292发酵生产3’-脱氧肌苷随时间变化示意图；
图4A产虫草素发酵培养基甲醇添加浓度优化随时间变化示意图；
图4B产虫草素发酵培养基添加腺嘌呤浓度优化随时间变化示意图；
图4C产虫草素发酵培养基添加腺苷浓度优化随时间变化示意图；
图4D产虫草素发酵培养基初始pH优化随时间变化示意图；
图4E产虫草素发酵培养基接种量添加浓度优化随时间变化示意图；
图4F产虫草素发酵培养基摇瓶装液量优化随时间变化示意图；
图4G产虫草素发酵培养基单因素优化结果随时间变化示意图；
图4H产虫草素发酵培养基正交试验优化随时间变化示意图；
图5是毕赤酵母菌虫草素耐受实验结果曲线图；
图6是虫草素发酵分离耦合装置图；
图中1.补料瓶；2蠕动泵A；3.转子流量计；4.加湿器；5.发酵罐；6.固液分离器；7.洗脱剂；8.蠕动泵B；9.多向阀A；10.吸附分离柱；11.收集瓶A；12.多向阀B；13.蠕动泵C；14.收集瓶B。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得，下述蛹虫草L5111保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2022年4月27日，保藏编号为CCTCC M 2022505，拉丁文名称为Cordyceps militaris，下述Cm1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述，Cm2的核苷酸序列如SEQID NO.2所述。
相关材料与方法
一.培养基与试剂
YPD培养基(1L)：
20g葡萄糖、5g蛋白胨、5g酵母粉，固体加20g琼脂；
YPDS(1L)：
20g葡萄糖、5g蛋白胨、5g酵母粉、18g Sorbitol、固体加20g琼脂；
低盐LB(1L):
10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5gNaCl,固体加20g琼脂，pH＝7.0-7.2。
121℃,15min。
BMG培养基：
(1.1)10％甘油：跟据甘油密度计算10mL称取12.63g甘油，加入适量去离子水，最后定容至100mL，通过过滤或者高压灭菌来消毒。
(1.2)磷酸盐(pH＝6.0)：称取3.01g K2HPO4(3H2O)；11.81g KH2PO4，加入适量去离子水溶解，最后定容至100mL，121℃，15min。
(1.3)13.4％YNB：取3.4gYNB不含硫酸铵粉末，10g硫酸铵粉末，加入适量去离子水溶解，最后定容至100mL，溶液经过0.22μm滤膜过滤除菌。
(1.4)0.02％生物素：称取20mg生物素，加入100mL去离子水溶解，配置母液，取2mL生物素通过0.22μm滤膜过滤除菌。
最后混合上述所有溶液，并加入700ml去离子水定容至1L，若宿主细胞为毕赤酵母则需要补充2mL(浓度10g/L)组氨酸，4℃保存。
BMM诱导培养基：
(2.1)磷酸盐(pH＝6.0)：称取3.01g K2HPO4(3H2O)；11.81g KH2PO4(3H2O)，加入适量去离子水溶解，最后定容至100mL，121℃，15min。
(2.2)13.4％YNB：取3.4gYNB不含硫酸铵粉末，10g硫酸铵粉末，加入适量去离子水溶解，最后定容至100mL，溶液经过0.22μm滤膜过滤除菌。
(2.3)0.02％生物素：称取20mg生物素，加入100mL去离子水溶解，配置母液，取2mL生物素通过0.22μm滤膜过滤除菌。
最后混合上述所有溶液，并加入5mL甲醇与700ml去离子水定容至1L，若宿主细胞为毕赤酵母则需要补充2mL(浓度10g/L)组氨酸，4℃保存。
二.酵母基因组提取：
(3.1)取1mL酵母过夜培养物12000rpm离心1min，弃上清；重复此步骤。
(3.2)取1mL超纯水将菌泥混悬，12000rpm离心1min。
(3.3)加500μL裂解液将菌泥混悬，再加25μL 5mol/LNaCl。
(3.4)取1/3-1/2溶液体积的玻璃珠于新的1.5ml离心管，倒入上述菌液。
(3.5)振荡7min。振荡时会产热，DNase酶可能会复性，中途需放冰上。
(3.6)12000rpm离心5min，取上清至新的离心管，避免吸取玻璃珠。
(3.7)取等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合液加入步骤(3.6)中的液体，涡旋15S，12000rpm离心10min。
(3.8)取200μL上清至新的离心管，加入2-2.5倍体积预冷无水乙醇。
(3.9)-80℃冻存1-4h，取出12000rpm离心5-10min。弃上清，离心管底有少量沉淀。
(3.10)加70％预冷乙醇1mL，涡旋，将沉淀物悬浮。
(3.11)12000rpm离心5min，弃上清。
(3.12)重复步骤(3.10)、(3.11)。
(3.13)真空泵吸干残余液体。
(3.14)放置室30min直至DNA沉淀物变透明，加入50μL超纯水和0.5μLRNase。
(3.15)基因组溶液放-20℃保存。
三.PCR片段克隆
本发明采用高保真酶进行PCR扩增，扩增体系如下
PCR体系:
扩增结束，产物全部上样跑电泳然后胶回收。
四.In-fusion连接
连接体系:(小片段:大片段摩尔比＝2:1)
50℃15min，连接完成后取5μL连接产物转化感受态细胞E.coli DH5a
五.大肠杆菌感受态转化
(4.1)将感受态细胞E.coli DH5alpha从-80℃中取出，取1μL质粒加入感受态细胞中，冰上放置30min。
(4.2)从冰上取出感受态细胞，于42℃水浴锅热击1min。
(4.3)热击后迅速放回冰上，放置2-5min，加入500μL SOC培养基混匀后转移至50mL离心管。
(4.4)50mL离心管在37℃摇床，150rpm，孵育45-60min。
(4.5)培养基中加入25ug/mL博来霉素，倒平板。
(4.6)孵育结束后，12000rpm离心1min。弃部分上清，留100μL菌液。将菌混悬，涂板，37℃培养。
六.酵母转化
(5.1)取1mL毕赤酵母GS115过夜培养物加入50mLYPD中，30℃；200rpm培养约16h。
(5.2)16h培养结束，看菌的生长状况，取1-2mL种子液进行转接至新的50mlLYPD中，继续培养两个代时，OD600为1-1.5时，制作毕赤酵母感受态细胞。
(5.3)所有种子液分别倒入50mL离心管，放至冰上15min。
(5.4)离心，4℃，1500xg，离心5min，去上清液。
(5.5)用灭好菌的预冷超纯水，洗菌，离心条件如上。
(5.6)重复步骤(5.5)。
(5.7)加入8mL混合液(100mM LiAC、10mM DTT、0.6mM山梨醇、10mM Tris pH＝7.5)洗菌，4℃，1500xg，离心5min，去上清。混合液有助于增加酵母细胞的通透性。
(5.8)预冷1mol/L山梨醇洗菌，4℃，1500xg，离心5min，去上清。
(5.9)重复步骤(5.8)。
(5.10)加入700μL山梨醇混悬菌，冰上预冷，感受态制作完成。
(5.11)取40/80μL菌液分装至预冷1.5mL离心管，并加入5/10μL线性化DNA，轻轻混匀，冰上孵育5min。
(5.12)将孵育好的菌加入预冷的电转杯(2mm/4mm)中，准备1ml 1mol/L的山梨醇。
(5.13)电击后，立即加入预冷的山梨醇，吹打，将菌液全部吸出，加入新的1.5mL离心管。
(5.14)30℃孵育1-4h。
(5.15)孵育结束，12000rpm，离心1min，弃部分上清，剩余100μL，涂布。30℃培养箱，培养2-3d。
七.菌株诱导表达
(6.1)挑取生长于选择平板上步骤六所述的含有表达质粒的单克隆菌落(步骤六)，转接至含有100μg/mL抗生素的5mLYPD培养基中，30℃，220rpm过夜培养。
(6.2)取1％上述过夜培养物转接至50mL BMG中，培养16h-20h。
(6.3)测定BMG培养基中菌液的OD600值，随后2000xg，10min离心收集菌体。
(6.4)随后转接至75mL新培养基BMM中，并调节诱导培养基起始细胞浓度为OD600＝4，30℃，220rpm震荡培养。
(6.5)分别在0、48、72、96、120、144、168h(根据试验要求，也可延长时间或在其它时间点)取500μL菌液，12000rpm,离心1min取上清保留，冻存至-80℃，用于后续液相检测。同时取400μL菌液进行生物量的测定。此外，每24h对培养基里补充1％(v/v)甲醇，为菌株提供足够的碳源。
八.高效液相色谱法(HPLC)相关操作
HPLC检测使用岛津公司配备SPD-M20A UV/Vis检测器和C18-H柱(Venusil MP C18(2)5um 4.6x250mm)的LC-20AD系统(Shimadzu，Tokyo，Japan)进行HPLC分析。进样量为50μl，流动相为超纯水和甲醇(80:20，v/v)等度洗脱，流速0.8ml/min，柱温25℃的洗脱条件，在260nm处检测虫草素及其脱氨产物信号。
九.质谱检测相关操作
LC-MS检测通过Vanquish UPLC系统(Thermo Scientific，德国)的TSQ QuantumUltra三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific,San Jose,CA,USA)进行检测。利用Xcalibur4.2 SP1软件(Thermo Scientific，美国)采集和分析数据。质谱条件：毛细管电压为3kV，毛细管温度为300℃，蒸发器温度为250℃，鞘气压力为35，辅助气体压力为10。
十.引物
后续实施例的引物列于表1中
表1引物
实施例1毕赤酵母异源合成虫草素和3’-脱氧肌苷菌株构建
虫草素合成相关酶基因来源于丝状真菌蛹虫草，虫草素脱氨产物3’-脱氧肌苷由毕赤酵母内源的脱氨酶将虫草素碱基上的氨基脱除形成，两种产物均可以分泌到毕赤酵母胞外上清中。
虫草素合成基因片段可通过上下游引物PCR扩增获得。为使蛹虫草来源的Cm1与Cm2片段在毕赤酵母系统中高效的表达，本发明通过全基因合成方法优化密码子，在通过引物(表1)扩增得到片段。由于毕赤酵母自身不能合成虫草素，为了使其能够合成虫草素，利用Invitrogen公司的pPICZA表达系统(也可构建或使用其他表达载体)，以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，利用引物(表1)对启动子以及终止子片段进行扩增。上述扩增片段通过In-Fusion重组酶连接至载体pPICZA的多克隆位点EcoRI/KpnI上，同时，将来自于C.militaris L5111的Cm1与Cm2分别经过毕赤酵母的密码子优化，连接于载体pPICZA的EcoRI位点。分别获得pPICZA-Cm1-Cm2、pPICZA-Cm1、pPICZA-Cm2质粒。通过抗生素筛选阳性转化子，最后送至华大基因公司测序，验证序列的正确，构建流程见图1。
将上述验证正确的质粒通过线性化之后，通过电转化方式整合至GS115(his4,Mut+)(本实验室保存)基因组中，经抗生素筛选后，分别得到了同时表达Cm1与Cm2转化子THP-292，单独表达Cm1转化子PP-Cm1，单独表达Cm2转化子PP-Cm2。此外，将空载质粒pPICZA也转入酵母中，得到PP-Con转化子。将获得的阳性转化子用20％(v/v)甘油进行保藏。
将上述得到的转化子菌株在YPD液体培养基上培养24h，吸取1％(v/v)YPD培养基上菌种置于50mL的BMG培养基中，培养16-24h，进一步扩大培养。将上述培养后产物离心，收集菌体转至75mL的BMM诱导培养基进行表达，对发酵液进行HPLC检测，结果发现只有同时表达Cm1和Cm2的转化子菌株与虫草素标准品出峰位置一致，而只单独表达Cm1或Cm2，以及仅转入了一个空载质粒的酵母菌株，在相应的保留时间处没有出峰。LC-MS结果证实了该峰的分子量大小与虫草素标准样品的分子量大小一致，该峰即是虫草素的峰(图2A-B)。
BMMY培养基常用于表达分泌型蛋白的培养，富含蛋白胨与酵母粉，然而蛋白胨酵母粉价格昂贵，并不适用于工业化菌株培养。因此，我们分别在BMMY与BMM培养基中进行培养，比较两者之间虫草素产量的差别。THP-292在BMMY与BMM中培养168h，最终经过HPLC检测发现菌株在这两个培养基上发酵产生的虫草素含量分别为：0.871±0.01g/L,0.956±0.02g/L(图3A)，测量OD600在8.0-11.0之间。由此表明，BMM培养基更适于本发明的酵母工程菌株的发酵培养。
调整起始pH＝7.0，THP-292菌株随时间变化切换为3’-脱氧肌苷生产模式，如图3B所示，168h后3’-脱氧肌苷产量接近0.5g/L。其结构证明如图2C-E所示。这是首次在毕赤酵母中报导3’-脱氧肌苷的存在，且可分泌到胞外，可以方便的分离得到，为刚性环生物基材料单体提供了可靠的发酵法生产来源。相比虫草素，其不需要氨基保护，节省合成的步骤。
可以看到毕赤酵母生产虫草素及其衍生物优势巨大：
(1)滴度高、生产时间短：已有报导酿酒酵母虫草素表达体系优化后产量也仅有0.1g/L左右，发酵时间3-7d；蛹虫草菌虫草素液体发酵产量在0.1-1.0g/L之间，但发酵时间长达30-40天；而毕赤酵母发酵时间较蛹虫草可以缩短2/3以上，摇瓶未优化体系已经达到近1.0g/L的产量(优化后摇瓶产量接近2.7g/L)，OD600在8-12，发酵罐高密度培养毕赤酵母的OD600可达到100左右，产量可达到5-10g/L。因此毕赤酵母体系无论是生产滴度还是生产强度合成虫草素都优势巨大。
(2)发酵培养基成分简单有利于后续分离：蛹虫草这一丝状真菌体系对培养基系统要求高，培养基成分复杂、存在大量有机成分，代谢产物也十分复杂，存在大量胞外多糖等物质干扰后续虫草素分离；而毕赤酵母一方面可以利用廉价甲醇作为碳源，特别是二氧化碳转化为一碳甲醇的技术日渐成熟，后续可能会实现利用二氧化碳生产虫草素及其衍生物的绿色工艺；另一方面毕赤酵母可采用FM22或BSM混合盐发酵体系，铵盐作为氮源，合成的无机培养体系会更进一步降低分离体系复杂度，而且测定发现虫草素及其衍生物95％以上均在毕赤酵母胞外，使得发酵-分离耦合等技术的进一步应用得以实现。
实施例2自絮凝毕赤酵母工程菌株的构建
菌体絮凝指的是菌体在发酵结束时可以自然沉降，与上清液分开，简化了离心的步骤。絮凝有三方面的重要意义：(1)在节能减排上有巨大意义，离心分离等耗时长、耗能高，絮凝可以简化离心步骤；(2)絮凝菌可以通过简单的固液分离装置实现原位发酵-分离耦合，及时解除产物抑制，进一步提高生产强度；(3)絮凝还可以提高菌体密度，单位体积有更高的菌体密度可以进一步增加目的产物的滴度、缩短发酵时间。
菌体的絮凝有两种方式，一种是在发酵结束时加入絮凝剂(如聚丙烯酰胺)或将菌体固定化(如海藻酸盐)；另一种是筛选或改造菌株实现菌体自絮凝、特别是诱导絮凝，这样相比组成型絮凝菌株，絮凝不会更早发生而带来传质阻力影响发酵强度。自絮凝没有额外物质引入，具用更大的应用潜力。不同菌株的絮凝机理不同，如酿酒酵母Flo1p可以与细胞壁的甘露聚糖结合引发絮凝，而有的细菌是纤维素类物质引发絮凝。酿酒酵母的FLO基因家族是研究较为透彻的絮凝基因，可以编码类凝集素蛋白，像其中的FLO1蛋白表达产物可以引发强烈的絮凝性转，FLO5、FLO10等可以引发微弱絮凝性状，FLO11还可以引发丝状生长性状等。模式酵母菌株S288c的Flo1p(YAR050W)具有18个45aa的重复区，且45aa重复单元数量越多、絮凝越强。絮凝是可逆的、无性的和需要钙离子的过程，它的N端可以与甘露糖等结合，C端具有GPI锚定位点。
毕赤酵母尚未由确定可以引发絮凝性状的基因的报导。有文献利用酿酒酵母的Flo1p进行毕赤酵母表面展示异源表达各类酶。但未有完整表达Flo1p、实现毕赤酵母絮凝、特别时诱导絮凝的报道。
本发明采用改进的絮凝基因克隆-二次延长的方法。
(1)常规克隆方法：以前期本团队克隆的已知报导最长的絮凝基因为出发基因。此基因来自于自絮凝酵母SPSC01。使用表1中的引物克隆5.2kb的FLO1片段，分别从毕赤酵母和酿酒酵母中扩增得到DAS2/GAP启动子以及RPS3tt终止子。以pPICZA-Cm1-Cm2为出发载体，通过限制性内切酶AscI消化后，将启动子、FLO1片段、终止子依次通过In-Fusion无缝克隆连接。最后利用抗生素筛选得到pPICZA-Cm1-FLO1-Cm2质粒。若想将絮凝基因整合到基因组其他位点，只需将载体上的AOX1p和AOX1t的片段换位中性位点的上下游同源臂即可。
随后，将pPICZA-Cm1-FLO1-Cm2质粒线性化，通过电转化方式转入酵母中，得到同时表达Cm1、FLO1、Cm2转化子THP-293。转化子进行絮凝基因测序发现长度发生不同程度的截短，最长的片段长度仅有3.1kb。在YPD液体培养基上培养24h，随后转接1％的种子液于50mL的BMG培养基中，培养16-24h，进一步扩大培养。将种子液离心，收集菌体转至75mL的BMM诱导培养基进行表达，观察培养基中菌体的絮凝状态，可发现发酵液依然浑浊，有轻微絮凝性状，说明常规克隆难以实现毕赤酵母中的絮凝基因表达。现有报导类似的方法改造的毕赤酵母絮凝值仅在5％附近。
絮凝值测定方法：菌体离心后用0.1mol/L的柠檬酸钠盐(pH＝5.0)洗涤2次后重悬，OD600调整到1.5，准确OD600值记为A；再次离心，用0.1mol/L CaCl2溶液洗涤1次后等体积重悬，静置5min后，取凹液面下端液体再次测OD600值记为B，则絮凝值＝1-B/2A。
(2)改进的絮凝基因克隆-二次延长方法：分析FLO1序列，共有22个135bp重复区(对应45aa蛋白产物)，同时通过密码子调整使得各个重复区的基因序列尽可能不同。在11和12个重复区中间加入GGAGGAGGTGGTTCC序列(翻译后为GGGGS)，全合成FLO1基因，同上构建表达载体，注意E.coli选用生长缓慢的DH5alpha菌种，可以最大程度保留FLO1的原长。同上转入宿主酵母菌得到GS115-FLO。
之后，设计gRNA,PAM区即为编码GGGGS的最后三个碱基TCC，采用任意CRISPR/Cas9载体均可，构建同源臂靶向GGGGS两端(各400bp)，线性化的供体DNA为上下游同源臂和12个絮凝基因135bp重复区，直接进行基因全合成。将gRNA质粒和Cas9质粒共转化GS115-FLO，同上获得转化子GS115-FLOE，进行菌落PCR扩增絮凝基因，可以得到2.6-4.6kb的絮凝基因，实现不同程度的絮凝。经测定絮凝值在5％-75％之间。最长絮凝基因的阳性转化子出现明显的絮凝性状，絮凝颗粒可达到毫米级以上，振荡后不散。
实施例3诱导发酵培养基优化
培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，培养基组成对菌体生长，代谢产物的生产等都有重要影响。为此本发明人对诱导培养基的组成与培养条件分别进行优化。
以虫草素为例，在以下的实验通过单因素控制变量法进行优化，30℃，180rpm培养168h，以分光光度计测定生物量。3’-脱氧肌苷生产优化可参照进行。
3.1其他成分不变，设置诱导培养基中甲醇添加量为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％。每个组合重复3次。如图4A所示，当甲醇浓度为0.5％，虫草素表达量达到最高。
3.2其他成分不变，设置诱导培养基中腺嘌呤添加量为0g/L、0.1g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L。每个组合重复3次。如图4B所示，在1.0g/L-5.0g/L，虫草素表达量较对照组显著提高，当腺嘌呤添加量为2.0g/L时，虫草素含量达到最高。
3.3其他成分不变，设置诱导培养基中腺苷添加量为0g/L、0.1g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L。每个组合重复3次。如图4C所示，当腺嘌呤添加量为1.0g/L时，虫草素含量达到最高。
3.4其他培养条件不变，设置诱导培养基的初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。每个组合重复3次。如图4D所示，当诱导培养基的初始pH值为4.0-6.0时，虫草素表达量显著高于其余两组，当pH＝5.0时，虫草素的含量达到最高。pH大于等于7.0转换为3’-脱氧肌苷生产模式。
3.5其他培养条件不变，设置诱导培养基初始细胞浓度OD600为1.0、3.0、5.0、7.0。每个组合重复3次。如图4E所示，当诱导培养基初始细胞浓度OD600＝5.0时，虫草素的含量达到最高。
3.6其他培养条件不变，设置培养基装液量为75mL、130mL、200mL。每个组合重复3次。如图4F所示，当装液量为75mL时，虫草素的含量达到最高。
综合上述得到的最优条件，进行发酵后，如图4G所示虫草素含量达到1.78g/L，较未优化体系提高了86.38％。
实施例4正交实验优化产虫草素的非常规酵母菌最适培养条件
以上述实施例3单因素实验中筛选到的最优条件，设计四因素三水平的正交表，进行9次发酵实验，每个组合设置3个平行实验。根据表格(表2)所给的参数进行发酵实验，发酵168h后取发酵液上清进行HPLC定量检测。每组发酵结果如表3所示。最后对实验得到的最适培养条件进行验证，以该组培养条件进行发酵培养。取168h发酵液进行也想检测，结果如图4H所示，此时虫草素产量达到2.68g/L，较未优化体系提高了180.63％。
表2虫草素重组菌株发酵条件正交试验设计
表3正交实验结果
比较不同宿主的虫草素生产情况，如表4所示：
表4不同体系生产虫草素比较
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注：*越多分离难度越大。
实施例5虫草素耐受性实验
为了检测酵母菌株对虫草素的耐受性，为此本发明人提供了一种酵母菌株对虫草素耐受性实验的检测方法。将毕赤酵母GS115菌株活化并接种至含有YPD培养基的96深孔板中接种浓度约为OD600＝0.4左右，加入不同浓度(0.1、1.0、2.0、5.0g·L-1)的虫草素溶液，以不含虫草素的培养菌液为对照组，孔板放入BioScreener中，30℃恒温振荡培养48h，每隔2h测定一次菌株生物量。每组设置3个平行实验，计算三次实验平均值绘制不同浓度虫草素作用下酵母菌株生长曲线。结果如图5所示，酵母菌株在含有2-5g/L虫草素的YPD培养中菌体生长受到了严重的抑制，1g/L的虫草素对酵母菌株的生长有轻微的影响。0-0.1g/L虫草素对酵母菌株生长几乎无影响。而如前所述，虫草素产量已经突破2.0g/L，所以需要考虑菌株的胁迫耐受性。
实施例6虫草素发酵分离耦合
为解决虫草素发酵过程出现的产物抑制以及提高培养基原料的利用率，本发明提供了一种产虫草素发酵分离耦合装置，主要用于发酵罐培养。
所述的装置包括以下部分:
补料瓶1、蠕动泵A2、转子流量计3、加湿器4、发酵罐5、固液分离器6、洗脱剂7、蠕动泵B8、多向阀9、吸附分离柱10、收集瓶A11、多向阀12、蠕动泵C13、收集瓶B14。各装置之间通过硅胶管连接流路(如图6)。
装置运作时，补料瓶1通过蠕动泵A2将含虫草素的发酵液成分传送至发酵罐5进料口，气泵中的空气经加湿器4通向发酵罐5，当虫草素浓度达到1.0g/L，多向阀9开启同时蠕动泵B8开始运作，经过固液分离器6将发酵液与菌体分离，发酵液进入吸附分离柱10；待吸附完成发酵液从吸附分离柱10出料口流出至收集瓶A11中，随后开启多向阀B12利用蠕动泵C13将剩余发酵液传送回发酵罐5中。吸附完成后调节蠕动泵B8与多向阀A9开关使洗脱剂7流向吸附分离柱10进行解析附，最后解析液从吸附分离柱10的出料口流至收集瓶A11。
分离介质选择大孔吸附树脂NKA-II，树脂经过酸、碱、95％乙醇处理后使用。在虫草素浓度超过1g/L时启用上述装备，发酵罐5停止搅拌，静置2min后开启泵系统，保持上清液经固液分离器6进一步分离菌体后开始大孔树脂吸附，调整流速1-10BV/h，恢复搅拌。洗脱采用95％乙醇，1-2BV/h洗脱，旋蒸、结晶获得纯度超过85％的虫草素样品，总虫草素滴度达到5-10g/L。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2379
<212> DNA/RNA
<213> 蛹虫草Cm1(Cm1)
<400> 1
atggccatga acgagaacgc ttatccgact acatgtccat cctttgaacg ggaaaaccac 60
cgtgatgcat tgcgtcaacc ctttgacccg gcgtttcgac gcacctggtc gaatggggtg 120
gccctccgac agctcgtcga cttcccacta ccgaccgtgg ccaaccacac catgtcgtat 180
gccctgattg agtactgtct tagccgcctg ccgatgcagc acctggagcg gctgggacag 240
ctcaagattc ccgtcgagct tcacgcagcc ccctttcagt acctgcagaa gcaccacggc 300
gcctttggct ttgactgggt ggagcgcttc gtctggcgaa cccacgatct gcacaagccc 360
tacaattttc tccgcccgga actgctcctg gcgcaggaat ccggctcaca gaggatcgtc 420
gccctcctca ccatcatgcc tggggaagac tacatccgcc actatgcgag catcctcgag 480
gtcgcgcagc acgacggcgc aatctcctcg catcacggac cgatccgctg cgtgctgtat 540
ccgcacctca cgcagtccat gatggcctgg acaggactga cagagttctc cctcagcgtt 600
gagcctggcg atattctgat tctcggcttc gtcgccgagc tgctccctcg gtttgcttct 660
ctcgtgccca ccgcgcgagt cattgggcga caagacgcgc agtattacgg tcttgtccgg 720
cttgagctcc gcccggggct cgtcttcagc ctcatcggtg ccaagttcag ctactggggc 780
aacctaggcg ggcgcgtcgt ccgggagctg gccgcccgca gaccgcgcgc catctgctat 840
attgctaagc agggcaccct cctgtcgccg ggcgacatcc accgcacaat ctactcgccc 900
acccggtact gcgtctttga caagggccaa gcctgctggc acggagacga tcactcagcc 960
ctgcccatca acccactctc atcgagattc cccacctttg atcgcggcct gcatgtgtcg 1020
acgcccacca tcgtggagca ggatgtcgac tttcggacac aagtggaggc ccatggcgct 1080
tcctccgttg ataacgaatt ggcgcagatg gcaagagctc tcacggacgt gcatgaagag 1140
aacccctcga tggagcgcgt ccagttgctg cctctcatgt tcattaccga ctatctccga 1200
cgcccggaag agctcggaat gacagtgccg ttcgacctta catcgcgcaa cgaaaccgtg 1260
catcgtaaca aggacttgtt cctggctagg tctgcccacc tggttctgga agcatttggt 1320
gtcatcgagc gccccaaggc catcatagtg gggacgggat atggtgtcaa gaccattctg 1380
ccagccctgc agaggcgcgg agttgaagtg gttggattgt gcggcggtcg tgaccgtgcc 1440
aagacggagg ccgtggggaa caaacacggt ataccatgca ttgatgtctc tttggccgaa 1500
gtgcaagcaa ctcacggcgc caatctgctc tttgtcgctt ctccgcacga taagcatgct 1560
gctcttgtcc aggaggccct tgacctcggc ggctttgaca ttgtatgcga gaagccactt 1620
gccttggaca tggcaacgat gcgacatttt gccaatcaat cacaaggctc ctctcagctg 1680
cgcttgatga accaccctct ccgcttctac ccgccgctca ttcagctcaa ggcggcctcc 1740
aaagaaccaa gcaacattct ggccattgaa attcagtact tgactcggcg gctgtccaag 1800
ctcacccatt ggagcgctgg cttctccaaa gccgccggag gaggcatgat gctagccatg 1860
gccactcatt tcctcgatct catcgaatgg ctcacgagtt cgtcactcac cccggcctcg 1920
gtgcaagaca tgtccacatc gaactcgatt ggtccgctac cgaccgaaga tgctggagcc 1980
accaagactc ccgatgccga gtcggccttc cagatgaacg gctgctgcgg cctgtccaca 2040
aagtactcgg tggactgtga cggtgctgca gacactgaac tattttccgt cacgctccgt 2100
cttgacaatg agcacgagct tcgatttatc cagagaaagg gaagccctgt tctgctggaa 2160
cagcgcctcc ctggccgaga atggttgccg ctcaaggttc attgggagca gcgcgtgcga 2220
gagggctcgc cgtggcaaat ctccttccag tactttgcgg aagaacttat cgaggcaatc 2280
tgcatgggaa caaggtcggc gtttgcggaa aaagccacag ggttcagcga ctatgctaga 2340
caagtcggcg tctttggatc caaggtgggc atagcctga 2379
<210> 2
<211> 1038
<212> DNA/RNA
<213> 蛹虫草Cm2(Cm2)
<400> 2
atgtcttgtc ctaccagcgc cggtgtcctc cagactcacc agctcctcaa tgacaacagc 60
atcttgattc gggatgaaat ctacggggag gagctggtct cggagccagt tctcgtagag 120
ctgctccaga gcgcagaggt tcagcgactt cagggcatct gccaacacgg agtcacggga 180
ttcttgggca tcacgccgcg tgtcacacgc ctcgagcatt cggtcggtgc atttatactc 240
gtgcgaagag tcggtgccgc gctcgacgag caagtcgcag ccctactcca tgacatttct 300
cacaccactc tcagtcatgt cattgaccac gccctctcca agcctgggga gggaagctac 360
cacgaggtgc acaaggcgcg gtatctcaag acgacgcggc tgcccgacat tgtcgccaaa 420
cacggcatca gccagaaagt tttcgaagaa gagctgtttc cgctggtgga gatgccgtcg 480
cctcaactgt gcgccgaccg cctcgactac gctctacgcg acgccgtcag ctttggcaag 540
ctggccatgg aagacgccca aaaggttgtc tcgtctctcc gggcatttcc gagtgcgaca 600
acggcccggc gtctgctcgt cctcgacgac gccgaggtcg ctctgacgct gtcccgcgca 660
tatacgacga cggacaagga tgtctggtcg aacccggccc acatcgacat gtacgagcgg 720
acgggccgcg taattggcga gctggtcgag gccggctctg tcgaggacaa ggtgctgtgg 780
caggtctcgg acgccgagtt ttggacaatg ctccgccaag cagcgaaccc ggagcagcga 840
cgcgccattg agcggctgga aacggagggc gtcccagagg acgacggcct cgagctgcca 900
cactgcgcca agatccgcac tcttgaccca gacgtctggc agcgagggga aaagcaaccg 960
gcgccgctgt ccattgtgtt gccgacgtgg ggaacggagc gacagcagta cattctgagc 1020
cgcacgcagc atcgatga 1038

Claims (3)

1.一种产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、按毕赤酵母密码子偏好性优化蛹虫草(Cordycepsmilitaris)L5111的氧化还原酶基因Cm1和金属离子依赖的磷酸水解酶基因Cm2，Cm1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述，Cm2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述，蛹虫草L5111的保藏编号为CCTCCM2022505；
S2、对步骤S1所述的基因Cm1、Cm2进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳回收片段；
S3、克隆毕赤酵母甲醇诱导启动子DAS2p、AOX1p、FLD1p及终止子AOX1t、RPS25At、CYCt片段；
S4、构建毕赤酵母的表达载体然后连入步骤1所述启动子DAS2p、AOX1p、FLD1p、结构基因Cm1、Cm2，随后化转或电转转入毕赤酵母中，通过表达载体所带抗性标记筛选得到毕赤酵母工程菌株，其中，所述毕赤酵母中引入酿酒酵母FLO1基因并通过基因编辑实现基因组上的FLO1二次延长。
2.基于权利要求1所述产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株的制备方法制备的产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株。
3.基于权利要求2所述的产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷的工程菌株的应用，其特征在于，包括生产虫草素及其衍生物3’-脱氧肌苷。
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Application publication date: 20220819

Assignee: Liaoning Yuanshan Lvgu Ecological Agriculture Co.,Ltd.

Assignor: DALIAN University

Contract record no.: X2023210000195

Denomination of invention: An engineering strain for producing cordycepin and its derivative 3 '- deoxynosine, and its preparation method and application

Granted publication date: 20230825

License type: Common License

Record date: 20231124