CN115093420B - 一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度hsaf的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产酶溶杆菌抗真菌活性物质HSAF的制备方法及应用，包括以产酶溶杆菌发酵液为原料，利用有机溶剂萃取或大孔吸附树脂吸附方法获得含有HSAF的粗提物，采用葡聚糖凝胶柱净化合并后，通过逆流色谱分配技术(CCC)进行分离制备，分离系统为一定比例的“正己烷‑乙酸乙酯‑甲醇‑水”组成的混合溶液。本发明操作步骤简单，获得的HSAF产物纯度高，制备量大，稳定性好，成本低廉，具有广阔的发展应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然活性产物分离技术领域，具体涉及一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法。
背景技术
天然抗菌化合物的开发和利用在植物病害生物防治领域发挥着重要作用。产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)是一类重要的生防细菌，对多种重要植物病原物表现有拮抗活性，对人和植物无害，有广阔的深入开发应用潜力。该菌可产生多种抗真菌活性物质，其中HSAF(Heat Stable Antifungal Factor，热稳定抗真菌因子，也称dihydromaltophilin)是主要活性成分，化学结构为16元环内酰胺类化合物。HSAF在0.3～1.5μM浓度下抑制小麦茎基腐病菌、玉米穗腐病菌、梨炭疽病菌、腐烂病菌的生长，在8～20μM时完全抑制小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌的生长。由于抗菌活性强，对非靶标生物及环境安全友好，HSAF具有很好的开发为生物农药的潜力。而农药开发和登记需要大量的标准品，目前的分离纯化手段主要包括制备型高效液相色谱法(HPLC)、大孔树脂吸附法等，前者需要消耗大量的有机溶剂且制备量较低，后者的纯度还达不到90％以上，限制了该化合物的深入研究和应用。
逆流色谱技术(Counter Current Chromatography，CCC)是一种新型的分离纯化手段，它是利用样品在固定相和流动相之间的分配系数差异进行分离，因逆流色谱的固定相和流动相都是液体，因此分离过程没有传统色谱的死吸附，样品的回收率高。与HPLC相比，CCC进样量较大，最多可达数克，是HPLC的数百倍；与常压、低压色谱相比，CCC技术分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。此技术己被广泛应用于中药成分分离、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成等领域。目前尚未有使用CCC技术分离纯化HSAF的报道或专利。
本发明提供了一种采用CCC技术分离纯化产酶溶杆菌抗菌活性物质HSAF的方法，该方法获得的HSAF纯度在95％以上，对样品无损失，分离量大，有较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备高纯度抗菌活性产物HSAF的方法，该方法制备出的流分纯度高，样品回收率高，分离量大，分离成本低，可弥补目前公开专利中溶杆菌活性物质制备方法的不足，在天然活性产物分离技术领域有广泛的应用前景。
一般的，本发明实现的技术步骤：
以可以产生HSAF的野生菌株产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)或其突变体的发酵液为原料，利用乙酸乙酯萃取或大孔吸附树脂吸附获得粗提物，采用葡聚糖凝胶柱初步净化后，通过逆流色谱分配技术(CCC)进行分离制备，流分经吹风静置后获得高纯度HSAF絮状物。
其中，利用的生防细菌菌株为产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)野生菌或其突变体，菌株在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上可对植物病原真菌产生拮抗活性。挑取平板上的菌株接种于液体NB培养基，在28℃、180rpm转速下培养24h，调节OD600＝1.0，以体积比1％的比例接入10％TSB培养基或黄豆粉培养基，发酵培养培养48～72h。NB培养基的组成：蛋白胨5g/L，蔗糖10g/L，酵母粉1g/L，牛肉浸膏3g/L，pH为7.0；黄豆粉培养基组成：葡萄糖8g/L，黄豆粉8g/L，氯化钙0.7g/L；10％TSB培养基组成：市售TSB粉3g/L。培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min。
发酵结束后加入20g/L的大孔吸附树脂NKA，摇培12h进行吸附，后用纱布过滤，在树脂中加入乙醇，摇培2h多次解析，解析液蒸干后为粗提物。或调节发酵液的pH为2.0～4.0，加入体积比1：1的乙酸乙酯，多次萃取，取有机层蒸干后为粗提物。
将粗提物进行初步的净化，净化填料使用市售的葡聚糖Sephadex LH-20凝胶进行装柱，洗脱系统为二氯甲烷：甲醇＝1：1等混合或单一溶剂。湿法上样，含有HSAF的流分段经高效液相色谱法(HPLC)检测合并。
将合并的HSAF流分段采用逆流色谱技术(CCC)制备，其中两相溶剂系统由正己烷或石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水按照体积比2～3：4～5.5：3～5：4～5组成。HSAF在系统中的分配系数为0.5～2。优选的体积比为3：5：4：5。上相为固定相，下相为流动相，正转离心模式。两相系统平衡后进样，根据318nm和235nm紫外波长吸收值分时间区域收集流分，将流分进行吹风静置，析出白色絮状物即为高纯度HSAF。制备的HSAF纯度大于95％，样品回收率大于90％。
与现有技术比，本发明的有益效果是：
提供了一种制备高纯度抗菌活性产物HSAF的方法，该方法制备出的流分纯度高，样品回收率高，分离量大，分离成本低，可弥补目前公开专利中溶杆菌活性物质制备方法的不足，在天然活性产物分离技术领域有广泛的应用前景。
附图说明
图1为产酶溶杆菌及其突变体的平板抗菌活性；
图2为HSAF的化学结构；
图3为逆流色谱分配技术制备HSAF的色谱流出图；
图4为制备出的HSAF色谱图及白色絮状沉淀；
图5为HSAF对炭疽病菌的抑制作用图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但并不限于本发明。若无特殊说明，下述实施例中所用技术方法均为常规方法；若无特殊说明，下述实施例中所用实验材料，均为常规化学试剂和生化试剂。
实施例1：
本实例提供了一种筛选合适的逆流色谱分离系统分离HSAF等化合物的方法。
取产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)野生菌株OH11，在NA平板上划线分离培养，28℃培养2天长出新鲜菌落，取单菌落接种于10％TSB液体培养基中，在28℃、180rpm条件下摇晃培养2天。取出培养液，按照20g/L的比例加入干净的NKA大孔吸附树脂，继续摇晃培养，使化合物吸附在树脂上，摇培12h。之后取出，用纱布过滤得到树脂吸附物，往树脂填料中加入乙醇，摇培2h，使化合物成分解析出来，之后多次采用乙醇进行解吸附。合并乙醇洗脱液，使用旋转蒸发仪将乙醇蒸干，得到OH11的粗提取物。
研究合适的逆流分离系统，测定目标物HSAF及主要干扰物ATB在不同逆流溶剂体系中的分配系数(K值)，其中K值范围0.5～2为合适的。在分液漏斗中加入常用的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水(或者二氯甲烷、甲醇、乙醇、水)作为溶剂，以不同的体积比混合，总体积约20mL，再加入5mg的粗提物成分，摇晃后静置，溶液产生分层现象。过夜静置。之后分别取出上相和下相，分别蒸干，用5mL甲醇定容溶解，分别采用高效液相色谱法(HPLC)分析其中的HSAF和ATB含量，得到各自的峰面积大小。
K值＝化合物在上相的峰面积/化合物在下相的峰面积。
分离度A＝较大的化合物K值/较小的化合物K值。
其中K值在0.5～2之间，两化合物的分离度A>1.5是较为合适的。根据该方法测出的HSAF及ATB在不同溶剂系统中的K和A值如表1。
在表1中，正己烷或石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水按照体积比2～3：4～5.5：3～5：4～5有比较好的K值，优选的，以体积比为3：5：4：5的体系较为合适，可以使用逆流分配方法进行分离。
表1HSAF及ATB在不同溶剂系统中的分配系数和分离度
实施例2：
本实例提供了一种采用逆流色谱分离技术小规模制备HSAF化合物的方法。
取产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)野生菌株OH11，按照实例1的方法进行活化，用10％TSB培养基摇培(10％TSB培养基组成：市售TSB粉状物3g/L，培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min)，加入大孔吸附树脂进行吸附，后加入乙醇解析，蒸干后得到HSAF粗提取物。
将粗提物用凝胶柱净化。净化填料使用市售的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(美国GE公司)进行装柱，柱子大小为直径2cm×80cm，柱体积约为150mL，洗脱系统为二氯甲烷：甲醇＝1：1混合溶剂。取粗提物样品经离心、过滤和浓缩后进行湿法上样，洗脱体积为200mL，按时间共收集流分12段，经高效液相色谱法(HPLC)检测，将含有HSAF的流分段合并浓缩。
逆流色谱分离系统使用高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司，OptiChrome-300PLUS)。使用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝3：5：4：5作为溶剂系统配制溶剂体系，共1.7L，静置后分层，分出上相0.8L，下相0.9L，分别超声脱气。将上相以20mL/min流速泵入分离管路，再以2.5ml/min的流速将下相泵入，同时开启正转离心模式，转速1000rpm使系统达到平衡。
取HSAF流分样品用8mL下相溶解，打入分离系统内，同时开始采集紫外吸收数据。根据318nm和235nm紫外波长的吸收值收集流分，目标流分在60～80min内逐渐流出。将目标流分吹风静置，析出白色絮状物即为高纯度HSAF化合物。将白色絮状物离心得到沉淀，干燥后称重约8mg，纯度为99％。
表2逆流色谱仪OptiChrome-300 PLUS制备HSAF结果
实施例3：
本实例提供了一种采用逆流色谱分离技术较大规模制备HSAF化合物的方法。
取产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)野生菌株OH11，按照实例1的方法进行活化，用黄豆粉培养基(培养基组成：葡萄糖8g/L，黄豆粉8g/L，氯化钙0.7g/L)上发酵罐进行发酵培养2.5t的规模，取20L加入大孔吸附树脂进行吸附，后加入乙醇解析，蒸干后得到HSAF粗提取物。
净化步骤如实例2进行放大。净化填料使用市售的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(美国GE公司)进行装柱，柱子大小为直径5cm×100cm，柱体积约为800mL，洗脱系统为二氯甲烷：甲醇＝1：1混合溶剂。取粗提物样品经离心、过滤和浓缩后进行湿法上样，洗脱体积为1.5L，按时间共收集流分20段，经高效液相色谱法(HPLC)检测，将含有HSAF的流分段合并浓缩。
逆流色谱分离系统使用高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司，OptiChrome-1000)。使用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝3：4.6：4.2：5作为溶剂系统配制溶剂体系，共6.7L，静置后分层，分出上相3.1L，下相3.6L，分别超声脱气。将上相以50mL/min流速泵入分离管路，再以8ml/min的流速将下相泵入，同时开启正转离心模式，转速800rpm使系统达到平衡。
取HSAF流分样品用25mL下相溶解，吸入分离系统内，同时开始采集紫外吸收数据。根据318nm和235nm紫外波长的吸收值收集流分。将目标流分吹风静置，析出白色絮状物即为高纯度HSAF化合物。
第一批样品流分接收接收后，不改变原有平衡体系，另取HSAF样品再次使用25mL下相溶解，再次进样。监测318nm和235nm紫外波长的吸收值收集流分。白色絮状物进行离心收集。如此共进样3～4次，收集白色絮状物沉淀。
使用HPLC检测收集物中HSAF的纯度。经检测，获得化合物的纯度为99％。总质量约为60mg。该实例说明了逆流色谱分配技术具有较好的稳定性，可实现重复进样，有利于大规模制备纯品物质。
表3逆流色谱仪OptiChrome-1000制备HSAF结果
实施例4：
本实例提供了一种利用制备的高纯度HSAF化合物进行抗真菌活性应用的方法。
取实例3或4制备的HSAF化合物1mg，用1mL DMSO溶解配制成1000μg/mL的母液，取不同体积的母液加入DMSO稀释，配制成浓度梯度为500、250、100、50、25、10μg/mL的工作溶液各1mL。取植物病原真菌炭疽病菌Colletotrichum fructicola在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平板上活化5～6天，长出菌落。取50mL新鲜配制的PDA培养基，加热溶化，待其温度降至40～50℃时，加入不同浓度的HSAF工作溶液并摇晃均匀，制成HSAF浓度为10、5、2、1、0.5、0.2μg/mL的含药平板，每个浓度倒3个平板重复。
用打孔器取炭疽病菌边缘菌落，挑取接种于上述培养基中，25℃黑暗培养5～6天。以接种不含有HSAF的培养基为空白对照。后取出，用直尺测量每个皿的菌落直径，求不同浓度HSAF对炭疽病菌的抑制率。
抑制率＝(空白对照菌落直径-HSAF含药菌落直径)/空白对照菌落直径×100％
经测定，HSAF浓度为10、5、2、1、0.5、0.2μg/mL的含药平板对炭疽病菌的抑制率分别为95％、87％、75％、69％、57％、43％。
以上试验仅为本发明的较佳事例，并不以限制本发明的技术扩展，凡在本发明精神和原则之内所做的修改、替换、改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法，其特征在于：以产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)野生菌株OH11为原料，利用乙酸乙酯萃取或大孔吸附树脂吸附获得粗提物，采用葡聚糖凝胶柱初步净化后，通过逆流色谱分配技术CCC进行分离制备，流分经吹风静置后获得高纯度HSAF絮状物；所述发酵液的制备方法为挑取平板上的菌株接种于液体NB培养基，在28℃、180rpm转速下培养24h，调节OD600＝1.0，以体积比1％的比例接入10％TSB培养基或黄豆粉培养基，发酵培养48～72h；NB培养基的组成：蛋白胨5g/L，蔗糖10g/L，酵母粉1g/L，牛肉浸膏3g/L，pH为7.0；黄豆粉培养基组成：葡萄糖8g/L，黄豆粉8g/L，氯化钙0.7g/L；10％TSB培养基组成：市售TSB粉3g/L；培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述粗提物的制备方法为调节发酵液的pH为2.0～4.0，加入体积比1：1的乙酸乙酯多次萃取，取有机层蒸干后为粗提物；或发酵结束后加入20g/L的大孔吸附树脂NKA，摇培12h进行吸附，再加入乙醇，摇培2h多次解吸附，蒸干后为粗提物；
所述粗提物的净化方法为净化填料使用市售的葡聚糖Sephadex LH-20凝胶进行装柱，洗脱系统为二氯甲烷：甲醇＝1：1混合或单一溶剂；湿法上样，含有HSAF的流分段经高效液相色谱法HPLC检测合并；
所述逆流色谱分配技术CCC为将合并的HSAF流分段采用逆流色谱制备，其中两相溶剂系统由正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水按照体积比2～3：4～5.5：3～5：4～5组成。
2.根据权利要求1所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法，其特征在于：所述两相溶剂系统由正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水按照体积比3：5：4：5组成。
3.根据权利要求1所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法，其特征在于：上下相达到平衡状态后注射样品，根据318nm和235nm紫外波长的吸收值收集流分，将目标流分吹风静置，析出白色絮状物即为高纯度HSAF化合物。
4.根据权利要求3所述的一种基于逆流色谱分配技术制备高纯度HSAF的方法，其特征在于：制备的HSAF化合物纯度大于95％，样品回收率大于90％。
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