CN113667705B - 3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3‑苄基‑6‑甲基‑2,5‑哌嗪二酮的制备方法，将脱色芽孢杆菌进行发酵，将得到的发酵液进行固液分离，得到的上清液加入大孔树脂进行吸附，吸附后过滤得到树脂；加入无水乙醇进行洗脱，收集洗脱液，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用滤膜除去不溶物，得到活性成分Ⅰ；将活性成分Ⅰ用硅胶柱进行进一步纯化，上样后先后用4种洗脱液进行洗脱，收集组分10，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用滤膜除去不溶物；进一步用制备液相色谱分离：梯度洗脱后收集11～12min的洗脱液，经旋转蒸发后，进行冻干，得到3‑苄基‑6‑甲基‑2,5‑哌嗪二酮。本发明制备方法简单易行，便于工业化生产，制备得到的3‑苄基‑6‑甲基‑2,5‑哌嗪二酮可用于防治致病性尖孢镰刀菌导致的香蕉枯萎病。
Description
技术领域
本发明涉及微生物代谢产物及应用领域，具体涉及3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法和应用。
背景技术
3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮为哌嗪二酮的一种，有报道表明，曾从药用植物掌叶半夏的块茎中分离鉴定到该种哌嗪二酮，也可通过常规的化学合成途径获得该种哌嗪二酮。但是从代谢产物中获得3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮却尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其首次通过微生物来源制备，制备方法简单易行，便于工业化生产。。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将脱色芽孢杆菌进行发酵，将得到的发酵液进行固液分离，所述的脱色芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020498；在固液分离后将得到的上清液加入大孔树脂进行吸附，时间为6-24h，大孔树脂与上清液的料液体积比为1:10-1： 30，吸附后过滤得到树脂；收集树脂，加入无水乙醇进行洗脱，收集洗脱液，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用滤膜除去不溶物，得到活性成分Ⅰ；
(2)用200～300目硅胶装柱，将活性成分Ⅰ上样，加入洗脱剂进行洗脱：洗脱剂为①石油醚：乙酸乙酯＝3：1；②石油醚：乙酸乙酯＝1：1；③二氯甲烷：甲醇＝3：1；按照所述洗脱剂编号顺序依次洗脱并收集经第三个洗脱剂洗脱后的组分，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用滤膜除去不溶物；
(3)对步骤(2)中除去不溶物后的组分进行制备液相色谱分离：其中，流动相为含0.1％ TFA的乙腈和含0.1％TFA的水，21mL/min梯度洗脱，收集11～12min的洗脱液，经旋转蒸发后，进行冻干，得到3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮。
本发明首次通过微生物来源(通过脱色芽孢杆菌B1032的发酵等步骤)制备得到的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮，这种制备方法尚未见报道，制备方法简单，利于工业化生产；而且制备得到的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮对尖孢镰刀菌具有很强的抑制作用，为新型的尖孢镰刀菌生防制剂的制备提供了新的选择，可用于防治致病性尖孢镰刀菌导致的的香蕉枯萎病。
3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮(C11H12N2O2)的结构式如下所示：
步骤(1)中所述的脱色芽孢杆菌B1032，保藏编号为CCTCC NO:M2020498，已在2020年9月14日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN 112175876A公开。
进一步地，所述步骤(1)中所述的脱色芽孢杆菌发酵所用的培养基为LB培养基。选用 LB培养基，由于成分简单方便，易于规模化的发酵和制备，得于生产的规模化。
进一步地，步骤(1)中所述的发酵条件为30～37℃，200～220rpm/min，36h。在此发酵条件下，脱色芽孢杆菌B1032的OD600可达到2.0以上，菌密度达到1×108cfu/ml以上。由于菌密度高，可使代谢产物含量高。
进一步地，步骤(1)中所述的固液分离方式为离心，条件为6000-12000rpm/min，离心 20min。
进一步地，步骤(1)中所述的无水乙醇的用量与是所述大孔树脂体积的1.5-2.5倍。在这个用量下，无水乙醇可以覆盖大孔树脂，同时能把其中的物质尽可能完全地洗脱下来，而且洗脱液不会太稀。如果用量太多，被洗脱物质在洗脱液中含量就低；如果用量太少，无法将大孔树脂中的物质完全洗脱。
进一步地，步骤(1)中所述无水乙醇的洗脱时间为0.5-3h。合适的洗脱时间能让乙醇更可能多地经过大孔树脂，把吸附物质洗脱下来，同时具有效率。
进一步地，步骤(2)中每种洗脱剂400mL，每100mL为一个收集单位，按照洗脱顺序编号为组分1～12，收集组分10用于旋转蒸发。选用第三个洗脱剂洗脱后的组分，即组分9-12 皆可，如选择组分10，目标物质的含量更高。
进一步地，步骤(1)、(2)中所述的滤膜均为孔径0.22μm的滤膜。使用该孔径的滤膜正好能够截流微生物的通过。
进一步地，步骤(3)中所述的制备液相色谱的柱子为Aglilent Pursuit XRs C18。
本发明还提供所述方法制备的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮在抑制尖孢镰刀菌及防治香蕉枯萎病中的应用。
香蕉枯萎病可对香蕉产业造成毁灭性打击，主要病原菌是尖孢镰刀菌Foc TR4，其首先在中国台湾地区被发现，于上世纪90年代在马来西亚和印度尼西亚爆发，通过香蕉的进出口贸易迅速传播扩散至全球，随后在澳大利亚、我国华南地区、越南、老挝、菲律宾、印度、巴基斯坦、以色列、黎巴嫩、约旦、阿曼、莫桑比克均有发现。而导致香蕉枯萎病的主要病原菌是尖孢镰刀菌。
尖孢镰刀菌是一种可在土壤中生存的植物真菌，能够侵染多种植物，对葫芦科植物、香蕉、棉花、番茄等经济作物造成危害。尖孢镰刀菌的菌丝和孢子可在土壤中存活长达数10年，菌丝、孢子、菌核可在土壤和病株中越冬，成为侵染源，主要通过雨水等途径进行远距离的传播。尖孢镰刀菌入侵植株后会分泌细胞壁降解酶，导致果胶阻塞植株的导管，影响宿主水分运输，严重时造成植物的萎蔫死亡。另外，尖孢镰刀菌可分泌一种镰刀菌酸(5-丁基-2-吡啶甲酸)，这种致病性的毒素对宿主根系的细胞膜造成损伤，导致根系细胞膜的通透性增加，从而让病菌更容易侵染宿主；此种毒素使得宿主线粒体中活性氧的含量降低，ATP的合成受到阻止，进一步阻碍植株的水分吸收从而抑制植株的生长；毒素还会降低植物种子的萌发率和影响种子的形态。除了镰刀菌酸外，尖孢镰刀菌分泌的毒素还有脱氢镰刀菌酸、伏马菌素、恩镰孢毒素、串珠镰刀菌素、白僵菌素、卡毒素等，这些毒素被认为是病原菌对植物造成伤害的主要原因。由于致病性的尖孢镰刀菌对农作物危害大，造成的经济损失尤为严重，因此需要开发高效防治尖孢镰刀菌的方法。
经本发明制备得到的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮对尖孢镰刀菌具有很强的抑制作用，为新型的尖孢镰刀菌生防制剂的制备提供了新的选择，可用于防治致病性尖孢镰刀菌导致的香蕉枯萎病。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
附图说明
图1：实施例1制备的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的气相-质谱图。
图2：实施例1制备的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的傅里叶红外光谱图。
图3：3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮结构式。
图4：实施例1制备的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮对尖孢镰刀菌的抑菌活性(0.5mg/ml) 效果图(注：P为发酵产物3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮，CK为阴性对照甲醇)。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行说明，可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明实施例，而非对本发明实施例的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明实施例相关的部分而非全部。本发明的多个实施例用于使本发明所属技术领域的普通技术人员更完整地理解本发明，以下实施例可以以多种不同的方式变形，这些变形也包括在本发明的保护范围内。
菌种及培养基
尖孢镰刀菌活化：将-25℃保存的尖孢镰刀菌从斜面转接到PDA培养基中，放置于生化培养箱中28℃培养3～7d，至菌丝长满整个平板。
PDA培养基配方如下：20％马铃薯浸出液，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂粉12g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2，121℃灭菌20min。注：先称取马铃薯200g，切成小块，放入1000mL沸水中煮20min，冷却后用400目纱布过滤获得马铃薯浸出液，加入上述试剂后定容至1000mL。
实施例1
本实施例的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法如下：
S1：
S11：脱色芽孢杆菌活化：取-80℃保存的脱色芽孢杆菌B1032在LB平板上划线活化，37℃培养箱过夜培养，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h 获得种子液，按1％(v/v)的接种量接入1000mL LB液体培养基，37℃、220r/min振荡培养36 h，至OD600达到2.0，12000rpm/min离心20min去除菌体，收集上清液。
脱色芽孢杆菌B1032，保藏编号为CCTCC NO:M2020498，已在2020年9月14日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN 112175876 A公开。
LB液体培养基：蛋白胨Tryptone 10g，酵母粉Yeast extract 5g，氯化钠NaCl 7g，蒸馏水 1000mL，pH调至7.2，121℃灭菌20min。
S12：向S11中获得的上清液中，按料液体积比1：30加入大孔树脂HP20进行吸附，时间为24h，吸附提取后过滤得到树脂；过滤收集树脂后，加入无水乙醇进行洗脱，无水乙醇用量是大孔树脂体积的2倍，洗脱时间为3h，收集洗脱液，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用孔径0.22μm滤膜除去不溶物，得到活性成分I。
S2：用200～300目硅胶装柱，柱子高度为30cm，直径为3cm，将活性成分Ⅰ上样，加入洗脱剂进行洗脱：洗脱剂为①石油醚：乙酸乙酯＝3：1；②石油醚：乙酸乙酯＝1：1；③二氯甲烷：甲醇＝3：1；每种洗脱剂400mL，100mL为一个收集单位，按照洗脱顺序进行编号 1～12，收集第10个组分；经旋转蒸发后以甲醇溶解，用孔径0.22μm滤膜除去不溶物。
S3：对实施例二S2中的组分10进行制备液相色谱分离：其中，液相色谱的柱子为Aglilent Pursuit XRs C18，流动相为A乙腈(含0.1％TFA)和B水(含0.1％TFA)，21mL/min梯度洗脱，收集11～12min的洗脱液，经旋转蒸发后，进行冻干，得到3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮。
具体地，梯度洗脱条件如下表所示：
表1制备液相色谱梯度洗脱条件
实施例2：
本实施例的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，与实施例1基本相同，仅S11与S12 有所区别，具体在于：
S11：脱色芽孢杆菌活化：取-80℃保存的脱色芽孢杆菌B1032在LB平板上划线活化，30℃培养箱过夜培养，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养12h获得种子液，按1％(v/v)的接种量接入1000mL LB液体培养基，30℃、200r/min 振荡培养36h，6000rpm/min离心20min去除菌体，收集上清液。
脱色芽孢杆菌B1032，保藏编号为CCTCC NO:M2020498，已在2020年9月14日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN 112175876 A公开。
LB液体培养基：蛋白胨Tryptone 10g，酵母粉Yeast extract 5g，氯化钠NaCl 7g，蒸馏水 1000mL，pH调至7.2，121℃灭菌20min。
S12：向S11中获得的上清液中，按料液体积比1：10加入大孔树脂HP20进行吸附，时间为15h，吸附提取后过滤得到树脂；过滤收集树脂后，加入无水乙醇进行洗脱，无水乙醇用量是大孔树脂体积的1.5倍，洗脱时间为2h，收集洗脱液，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用孔径0.22μm滤膜除去不溶物，得到活性成分I。
实施例3：
本实施例的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，与实施例1基本相同，仅S11与S12 有所区别，具体在于：
S11：脱色芽孢杆菌活化：取-80℃保存的脱色芽孢杆菌B1032在LB平板上划线活化，30℃培养箱过夜培养，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，34℃、210r/min振荡培养12h获得种子液，按1％(v/v)的接种量接入1000mL LB液体培养基，34℃、210r/min 振荡培养36h，10000rpm/min离心20min去除菌体，收集上清液。
脱色芽孢杆菌B1032，保藏编号为CCTCC NO:M2020498，已在2020年9月14日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN 112175876 A公开。
LB液体培养基：蛋白胨Tryptone 10g，酵母粉Yeast extract 5g，氯化钠NaCl 7g，蒸馏水 1000mL，pH调至7.2，121℃灭菌20min。
S12：向S11中获得的上清液中，按料液体积比1：20加入大孔树脂HP20进行吸附，时间为6h，吸附提取后过滤得到树脂；过滤收集树脂后，加入无水乙醇进行洗脱，无水乙醇用量是大孔树脂体积的2.5倍，洗脱时间为0.5h，收集洗脱液，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用孔径0.22μm滤膜除去不溶物，得到活性成分I。
实施例4：对实施例1的产物3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的GC-MS和FTIR检测
将实施例1制备得到的产物溶解于适量色谱甲醇中并过滤，分别进行GC-MS(气相色谱- 质谱联用)分析以及FTIR检测。图1是实施例1制备的产物气相-质谱图，图2是实施例1制备的产物的傅里叶红外光谱图。GC-MS(见图1)和FTIR(见图2)的结果表明，该产物为3-苄基 -6-甲基-2,5-哌嗪二酮，分子式为C11H12N2O2，其结构式如图3中结构式所示。
实施例5：活性检测
将实施例1的S3最后得到的产物3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮以甲醇溶解，调节浓度为0.5mg/mL，以尖孢镰刀菌作为指示菌，检测其抑菌活性，具体方法如下：
1)取培养好的指示菌，制备孢子悬浮液，并调节孢子悬浮液浓度至1.0×104cfu/mL；
2)取100μL孢子悬浮液涂布于PDA平板上；
3)在距离平板中心2cm处的3个位置放灭菌后的直径为6mm滤纸片；
4)在滤纸片上加入10μL3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮，甲醇为阴性对照，每组处理4个重复组，28℃恒温培养3d，测量抑菌圈直径。
结果表明：3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮对尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用，其0.5mg/mL 的抑菌圈直径为9mm，表明其具有较好的抑菌效果(见图4)。
同理，对实施例2-3所述的制备方法得到的产物进行GC-MS和FTIR检测，以及尖孢镰刀菌的抑菌活性检测，结果同样表明，产物为3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮，具有较好的抑菌效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将脱色芽孢杆菌进行发酵，将得到的发酵液进行固液分离，所述的脱色芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020498；在固液分离后将得到的上清液加入大孔树脂进行吸附，时间为6-24h，大孔树脂与上清液的料液体积比为1:10-1：30，吸附后过滤得到树脂；收集树脂，加入无水乙醇进行洗脱，收集洗脱液，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用滤膜除去不溶物，得到活性成分Ⅰ；
(2)用200～300目硅胶装柱，将活性成分Ⅰ上样，加入洗脱剂进行洗脱：洗脱剂为①石油醚：乙酸乙酯＝3：1；②石油醚：乙酸乙酯＝1：1；③二氯甲烷：甲醇＝3：1；按照所述洗脱剂编号顺序依次洗脱并收集经第三个洗脱剂洗脱后的组分，经旋转蒸发后以甲醇溶解，用滤膜除去不溶物；
(3)对步骤(2)中除去不溶物后的组分进行制备液相色谱分离：其中，流动相为含0.1％TFA的乙腈和含0.1％TFA的水，21mL/min梯度洗脱，收集11～12min的洗脱液，经旋转蒸发后，进行冻干，得到3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮。
2.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述的脱色芽孢杆菌发酵所用的培养基为LB培养基。
3.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的发酵条件为30～37℃，200～220rpm/min，36h。
4.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的固液分离方式为离心，条件为6000-12000rpm/min，离心20min。
5.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的无水乙醇的用量是所述的大孔树脂体积的1.5-2.5倍。
6.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述无水乙醇的洗脱时间为0.5-3h。
7.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：步骤(2)中每种洗脱剂400mL，每100mL为一个收集单位，按照洗脱顺序编号为组分1～12，收集组分10用于旋转蒸发。
8.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：步骤(1)、(2)中所述的滤膜均为孔径0.22μm的滤膜。
9.根据权利要求1所述的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的制备液相色谱的柱子为Aglilent Pursuit XRs C18。
10.根据权利要求1～9任一所述方法制备的3-苄基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮在抑制尖孢镰刀菌及防治致病性尖孢镰刀菌导致的香蕉枯萎病中的应用。
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