CN112175876A - 一种脱色芽孢杆菌及其在拮抗果蔬真菌病害中的应用 - Google Patents

一种脱色芽孢杆菌及其在拮抗果蔬真菌病害中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脱色芽孢杆菌菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2020498。本发明所述的脱色芽孢杆菌对尖孢镰刀菌、腐皮镰孢菌和胶孢炭疽菌等病原菌具有显著的拮抗作用，可显著降低草莓种植过程中病害导致的死棵现象。该菌株可用于农业生物防治、微生物菌剂及功能性有机肥的发酵制备。

Description

一种脱色芽孢杆菌及其在拮抗果蔬真菌病害中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种脱色芽孢杆菌及其在拮抗果蔬真菌病害中的应用。
背景技术
目前农业生产面临的是土壤盐渍化板结、理化性状恶化、养分结构性缺少、土壤有害菌群增多等现象导致的植物病害频发、种苗死棵严重、果蔬产量与品质大幅下降等问题，以及诱发农户加大农药、化肥等的使用量，从而带来的环境污染及食品安全问题。而采用以微生物为主的生物防治措施，可以有效解决以上问题，达到减肥减药的目的，引领果蔬健康种植向绿色、环保、高效方向发展。
据统计，目前多数植物的病害是由病原真菌大量传播造成。例如，尖孢镰刀菌(Fusararium oxysporum)是造成番茄枯萎病、香蕉枯萎病、草莓根腐病等的一种重要的土传病害。在植株定植时容易从根部伤口侵入，到达维管束。植株开花结果时期，加上高温高湿的环境导致病害更容易侵入植株，导致病害发生。腐皮镰孢菌(Fusarium solani)可造成花椒、黄芪、草莓等植株的根腐病，胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides penz)导致果蔬炭疽病。目前农业生产上对这类病害的防控主要依赖于农药的大量喷施，导致果蔬等农作物品质下降，造成食品安全和环境污染。
利用病原菌的拮抗细菌进行生物防治是控制植物病害的新途径，目前在果蔬上应用的拮抗细菌的种类主要有芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、假单胞杆菌(Pseudomonsspp)、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等。芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧、产芽孢的革兰氏阳性菌的总称，它的特点是能产生耐热抗逆的芽孢，有利于抑菌剂生产、剂型加工以及繁殖。
发明内容
基于此，本发明的一个目的在于，提供一种新的拮抗果蔬病原真菌的细菌，其属于脱色芽孢杆菌属。
本发明采用的技术方案如下：
一种脱色芽孢杆菌菌株Bacillus decolorationis B1032，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020498。
相对于其他拮抗果蔬病原真菌的细菌，本发明所述脱色芽孢杆菌适宜生存的温度范围和pH范围较广，对多种造成土传病原真菌都有较好的抑制作用，可用于农作物的病害防治。
本发明的另一个目的在于提供所述的脱色芽孢杆菌在抑制果蔬等病原真菌中的应用。
进一步地，所述的脱色芽孢杆菌的培养方法包括以下步骤：
S1接种：所述脱色芽孢杆菌以1.0×105～5.0×108个/ml接种浓度、0.5％～5％接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述脱色芽孢杆菌的培养基，于28℃，恒温培养12～48小时。
进一步地，所述培养基包括以下重量份的原料：氯化钠5份、胰蛋白胨8份、酵母粉2份、葡萄糖20份，无菌水1000份，所述培养基的pH为7.5±0.5。
进一步地，步骤S1中的接种浓度为5.0×108个/ml。
进一步地，步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为5％。
进一步地，步骤S2中的培养时长为48小时。
进一步地，步骤S2中，于28℃培养时，以150～220rpm/min速度摇动。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为本发明所述的脱色胞菌培养48h后的菌落形态图；
图2为本发明所述的脱色芽孢杆菌16S rRNA序列的PCR扩增核酸电泳图；
图3为基于本发明所述的脱色芽孢杆菌与相似菌种的16SrRNA序列条形码构建的进化树；
图4为本发明所述的脱色芽孢杆菌与脱色芽孢杆菌Bacillus decolorationisKMGL1309-AS2的16SrRNA序列比对图；
图5为本发明所述的脱色芽孢杆菌的对尖孢镰刀菌、腐皮镰孢菌和胶孢炭疽菌的抑制效果图；其中，A图为脱色芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的抑制效果，B图为尖孢镰刀菌空白对照，C图为脱色芽孢杆菌对腐皮镰刀菌的抑制效果，D图为腐皮镰刀菌空白对照，E图为脱色芽孢杆菌对胶孢炭疽菌的抑制效果，F图为胶孢炭疽菌空白对照；
图6为本发明所述的脱色芽孢杆菌在草莓种植中的应用效果；其中，A图为空白对照组的效果，B图为实验组(脱色芽孢杆菌菌液处理组)的效果。
具体实施方式
本发明所述的脱色芽孢杆菌，命名为Bacillus decolorationis B1032，于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO:2020498。
实施例一：分离纯化方法
本发明所述的脱色芽孢杆菌的分离纯化方法，步骤如下：
S1：称取10g的土壤样品，所述土壤样品来自广东省海陵岛红树林国家湿地公园；然后，于超净工作台中，向土壤样品中添加90ml无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100ul土壤悬液到900ul无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液，整个过程在超净工作台中进行。
S2：取100ul的10倍稀释液、102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液分别涂布于六个2216E琼脂固体培养板上，然后将培养板置于培养箱28℃恒温培养2～3天，培养板上长出菌斑。
S3：培养结束后，根据菌落生长情况从适当稀释梯度平板一一挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，分离出本发明所述的脱色芽孢杆菌。本发明所述的脱色芽孢杆菌在2216E琼脂固体培养板上的形态如附图1所示，单菌落为黄白色圆形或椭圆形，菌落表面不光滑，边缘整齐并且有凸起褶皱。
S4：从2216E挑取已纯化培养的菌株，接种于内含200ml 2216E液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃，180rpm恒温摇床培养条件下培养32h，制得种子液。
所述2216E琼脂固体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、琼脂15份、无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入20ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。
所述2216E液体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例二：培养方法
S1接种：将实施例一所得的种子液以2×106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml脱色芽孢杆菌培养基的1000ml锥形瓶中；
S2培养：将接种有所述脱色芽孢杆菌的培养基，于28℃，180rpm恒温摇床条件下培养48h，制得本发明所述的脱色芽孢杆菌菌液。
由于本发明所述的脱色芽孢杆菌在自身的生长过程中，一方面会与病原菌竞争营养物质，并且和病原菌竞争植物表面的结合位点，从而降低病原菌的致病能力；另一方面，本发明所述的脱色芽孢杆菌能够分泌出抗菌物质，通过抗菌的物质来抑制病原菌生长，从而达到生物防治的作用。
所述的脱色芽孢杆菌培养基配制方法：氯化钠5份、胰蛋白胨8份、酵母粉2份、葡萄糖20份，无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后调整pH到7.5±0.5，然后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例三：PCR扩增16S rRNA序列并测序
S1：基因组DNA的提取
采用Omega Bacterial DNA Kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA。首先，取实施例一中所述的种子液2ml于无菌的2ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清保留沉淀；然后，向沉淀中加入100ul 1×TE Buffer，涡旋混匀，加入10ul溶菌酶混匀，37℃水浴10min；加入100ul BTL Buffer和20ul蛋白酶K，混匀，55℃温浴1h，中间振荡混匀三次；加入5ulRNaseA酶，混匀，室温静置5min后，10000rpm离心2min，取200ul上清液转移至新的无菌的1.5ml离心管中；加入200ul BTL Buffer，混匀，置于65℃温浴10min；加入200ul无水乙醇，涡旋混匀，将样品全部转移至吸附柱中，10000rpm离心2min，弃上清和吸附柱，将吸附柱放入新的收集管中；向吸附柱中加入500ul HBC Buffer，10000rpm离心2min，弃上清；向吸附柱上加入700ul DNA Wash Buffer，10000rpm离心2min，弃上清，重复两次；将空的吸附柱重新放入收集管中，10000rpm离心2min；向吸附柱中加入用30ul～50ul Elution Buffer(已于65℃预热)溶解DNA沉淀，即得到基因组DNA，-20℃保存备用。
S2：PCR扩增16SrRNA序列
以步骤S1所得基因组DNA为模板，Eubac27F和Eubac1492R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系(50ul)如下：
Figure BDA0002726548750000051
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸的过程反复循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
所述上游引物Eubac27F的序列为：5-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3
所述下游引物Eubac1492R的序列为：5-GGTTACCTTG TTACGACTT-3
S3：PCR产物进行核酸电泳
取5ul步骤S2所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳25min。电泳结果如附图2所示，以本发明所述的脱色芽孢杆菌的基因组DNA为模板扩增出的16SrRNA片段条带单一且亮度高，且16SrRNA序列长度约为1500bp。
S4：16SrRNA序列进行测序
步骤S2所得的PCR产物经纯化回收后，取30ul纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示本发明所述脱色芽孢杆菌的16SrRNA序列长度为1456bp，具体序列如下所示：
Figure BDA0002726548750000052
Figure BDA0002726548750000061
实施例四：构建系统进化树
将实施例三所得的本发明所述脱色芽孢杆菌的16SrRNA序列输入NCBI中，进行BLAST比对，并基于条形码16SrRNA区段序列构建NJ系统进化树。如附图3所示，根据系统进化树本发明所得的菌株，与脱色芽孢杆菌的16SrRNA条形码数据库中大部分序列高度相似但不存在完全重合。因此可知，本发明所得的菌株在分类上属于脱色芽孢杆菌，且为一个新种。
实施例五：近源物种比对
将实施例三所得的本发明所述脱色芽孢杆菌的16SrRNA序列输入NCBI中，与脱色芽孢杆菌Bacillus decolorationis KMGL1309-AS2的16SrRNA序列进行比对，比对结果如附图4所示，本发明所述脱色芽孢杆菌的16SrRNA序列与的16SrRNA序列同源性为99％，但并不完全相同，两者之间存在15个碱基的差异。进一步看出，本发明所得的菌株在分类上属于脱色芽孢杆菌，且为脱色芽孢杆菌的一个新的菌种，暂时命名为BacillusdecolorationisB1032。
实施例六：测定对不同病原菌抑制效果的方法
S1接种：将实施例一所得的种子液以106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml LB液体培养基的1000ml锥形瓶中；
S2培养：将接种有所述脱色芽孢杆菌的培养基，于28℃，180rpm恒温摇床条件下培养48h，制得本发明所述的脱色芽孢杆菌菌液；
S3重悬：培养结束后，12000rpm离心2min收集菌体沉淀，去除上清液，用无菌水重悬沉淀，并且将重悬液的菌密度调节至108个/ml；
S4病原菌的培养：将保存于4℃冰箱中的接种有病原菌的PDA斜面培养基取出，用灭菌后的接种环挑取菌丝于新的PDA培养基上，28℃培养，活化48h，之后再进行二代接种；
S5益生菌的拮抗：在PDA平板中央接种直径为8mm的病原菌菌块，在距离菌块2cm处打三个距离相等的直径为8mm的小孔，小孔中接种20μL S3中所述的重悬液，以接种等量无菌水作为阴性对照，28℃恒温培养5d；
S6计算抑制率：培养5d后测量病原菌的生长直径，抑制率的计算公式为：
抑制率Ir＝(CK－S)÷CK×100％
其中Ir表示抑制率；CK表示阴性对照组病原菌生长直径，S表示实验组病原菌生长直径。
实验结果如附图5所示，本发明所述的脱色芽孢杆菌对尖孢镰刀菌、腐皮镰孢菌、胶孢炭疽菌的抑菌率分别为：80.20％、73％和77％。
实施例七：脱色芽孢杆菌在草莓种植中的应用效果
实验在山东省平度市前楼镇巡栈村漾花湖农业种植基地冬暖草莓大棚进行，该大棚为草莓种植5年重茬大棚，根腐病发病严重，上一季草莓死棵率达35％以上。
实验组，10行，每行50棵，将实施例一所得的种子液稀释100倍得到脱色芽孢杆菌发酵稀释液，定植时草莓苗在脱色芽孢杆菌发酵稀释液中蘸根30秒后定植土中，定植后将稀释500倍的脱色芽孢杆菌菌液通过滴灌灌注到根系，每亩地使用菌液800ml。定植后间隔15天，将稀释500倍的脱色芽孢杆菌菌液通过滴灌灌注到根系，每亩地使用菌液800ml，共灌注5次。盛果期计算成活棵数，计算成活率。
空白对照组，10行，每行50棵，实验过程与实验组平行进行，用水代替脱色芽孢杆菌菌液。
实验结果如附图6所示，实验组500棵草莓最终成活率92％，空白对照组成活率72％。本发明所述的脱色芽孢杆菌菌液的使用，大大提高了草莓的成活率，降低了病死率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0002726548750000081
Figure BDA0002726548750000091
序 列 表
<110> 华南农业大学
<120> 一种脱色芽孢杆菌及其在拮抗果蔬真菌病害中的应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明所述的脱色芽孢杆菌的16SrRNA序列
<400> 1
GGTCTGTGAG TCCCGTCACT TCGGCGGCTG TTCCAAAGGT TACCTCACCG ACTTCGGGTG 60TTACAAACTC TCGTGGTGTG ACGGGCGGTG TGTACAAGGC CCGGGAACGT ATTCACCGCG 120GCATGCTGAT CCGCGATTAC TAGCAATTCC GGCTTCATGC AGGCGAGTTG CAGCCTGCAA 180TCCGAACTGA GAATGGCTTT ATGGGATTCG CTCAACCTCG CGGTTTTGCT GCCCTTTGTA 240CCATCCATTG TAGCACGTGT GTAGCCCAGG TCATAAGGGG CATGATGATT TGACGTCATC 300CCCACCTTCC TCCGGTTTGT CACCGGCAGT CACCTTAGAG TGCCCAACTG AATGCTGGCA 360ACTAAGATCA AGGGTTGCGC TCGTTGCGGG ACTTAACCCA ACATCTCACG ACACGAGCTG 420ACGACAACCA TGCACCACCT GTCACTTCGT CCCCCGAAGG GGAACCTTCT ATCTCTAGAA 480GTAGCGAAGG ATGTCAAGAC CTGGTAAGGT TCTTCGCGTT GCTTCGAATT AAACCACATG 540CTCCACTGCT TGTGCGGGCC CCCGTCAATT CCTTTGAGTT TCAGCCTTGC GGCCGTACTC 600CCCAGGCGGA GTGCTTAATG TGTTAACGTC AGCACTGAGG GTGGAACCCC CCAACACCTA 660GCACTCATCG TTTACGGCGT GGACTACCAG GGTATCTAAT CCTGTTTGCT CCCCACGCTT 720TCGCGCCTCA GCGTCAGTTA CTGGCCAGAG AGCCGCCTTC GCCACTGGTG TTCCTCCATA 780TATCTACGCA TTTCACCGCT ACACATGGAA TTCCACTCTC CTCTCCAGTA CTCAAGTCCC 840CCAGTTTCCA ATGGCCCTCC ACGGTTGAGC CGTGGGCTTT CACATCAGAC TTAAGAGACC 900GCCTGCGCGC GCTTTACGCC CAATAATTCC GGACAACGCT TGCCACCTAC GTATTACCGC 960GGCTGCTGGC ACGTAGTTAG CCGTGGCTTT CTGGTTAGGT ACCGTCAAGG TACCGCCCTA 1020TTCGAACGGT ACTTGTTCTT CCCTAACAAC AGAGCTTTAC GACCCGAAGG CCTTCATCGC 1080TCACGCGGCG TTGCTCGGTC AGGCTTTCGC CCATTGCCGA AGATTCCCTA CTGCTGCCTC 1140CCGTAGGAGT CTGGGCCGTG TCTCAGTCCC AGTGTGGCCG ATCACCCTCT CAGGTCGGCT 1200ACGCATCGTC GCCTTGGTGA GCCCTTACCT CACCAACTAG CTAATGCGCC GCGGGCCCAT 1260CTGTAAGTGA TAGCTAAAAG CCATCTTTCA ACTTTCCACC ATGTGGTGGT CAGTATTATC 1320CGGTATTAGC CCCGGTTTCC CGGAGTTATC CCAGTCTTAC AGGCAGGTTG CCCACGTGTT 1380ACTCACCCGT CCGCCGCTGA TCTCAGGGGA GCAAGCTCCC CATTGATCCG CTCGACTGCA 1440TTACTAGCAC CGACTT 1456
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物Eubac27F
<400> 2
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物Eubac1492R
<400> 3
GGTTACCTTG TTACGACTT 19
序列表
100003 1
2020.10

Claims (8)

1.一种脱色芽孢杆菌菌株(Bacillus decolorationis B1032)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020498。
2.权利要求1所述的脱色芽孢杆菌在抑制果蔬等病原真菌中的应用。
3.权利要求1所述的脱色芽孢杆菌的培养方法，其特征在于包括以下步骤：
S1接种：所述脱色芽孢杆菌以1.0×105～5.0×108个/ml接种浓度、0.5％～5％菌液与培养基体积比接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述脱色芽孢杆菌的培养基，于28℃，恒温震荡培养12～48小时。
4.如权利要求3所述的脱色芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养基包括以下重量份的原料：氯化钠5份、胰蛋白胨8份、酵母粉2份、葡萄糖20份，无菌水1000份，所述培养基的pH为7.5±0.5。
5.如权利要求3所述的脱色芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：步骤S1中的接种浓度为5.0×108个/ml。
6.如权利要求3所述的脱色芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为5％。
7.如权利要求3所述的脱色芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：步骤S2中的培养时长为48小时。
8.如权利要求3所述的脱色芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：步骤S2中，于28℃培养时，以150～220rpm/min转速摇动。
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