CN106566784A - 防治猕猴桃溃疡病的菌株及其应用 - Google Patents

防治猕猴桃溃疡病的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种防治猕猴桃溃疡病的菌株及其应用，其中，所述菌株为链霉菌属(Streptomyces.sp)，所述菌株的保藏号为CCTCC【M 2016561】。本发明的防治猕猴桃溃疡病的菌株是一株具有广谱抑菌活性的链霉菌SY‑ZC，其活性代谢产物具有特殊的功能和结构，而且，该链霉菌SY‑ZC对猕猴桃溃疡病具有明显防治效果，可代替化学农药的使用，具有继续开发潜力，可为猕猴桃溃疡病综合防治提供新的有效防治策略、提供技术支持。

Description

防治猕猴桃溃疡病的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种防治猕猴桃溃疡病的菌株及其在防治猕猴桃溃疡病中的应用。
背景技术
猕猴桃溃疡病(Kiwifruit bacterial canker)是猕猴桃种植中最具毁灭性的病害，主要由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)引起，可连年爆发，给猕猴桃种植业带来严重经济损失，已成为亟待解决的世界难题。
目前，该领域多以化学药剂进行防治，链霉素和铜制剂是主要品种，但是，现有化学药剂在防治该病过程中出现药效降低，抗药性增强等现象，同时还带来食品安全等一系列问题，化学药剂防治不仅效果不显著还会带来环境污染问题。而微生物生防菌则以其安全环保、防治效果好、实际应用方便、病原菌不易产生抗药性等优势成为最具开发潜力的生物保护制剂。
国内外研究者都将研究热点放在了生物制剂上，从微生物内生放线菌、生防芽孢杆菌包括抗菌肽到生物大分子化合物壳寡糖都进行了系列活性研究。如邵宝林分离获得了对溃疡病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌；放线菌研究相对较多，西北农林科技大学分离到内生放线菌株-杨凌青色链霉菌，并对活性结构进行纯化和鉴定；Marco Scortichini等进行了壳寡糖对溃疡病菌的田间防效试验，均取得一定进展。但是，目前这些微生物菌株和生物分子尚未形成商品化应用，因此仍需要研发新的生物制剂综合解决猕猴桃溃疡病的危害问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种新型防治猕猴桃溃疡病的菌株及其在防治猕猴桃溃疡病中的应用。
本发明的目的可通过以下的技术措施来实现：
一种防治猕猴桃溃疡病的菌株，与现有技术相比，其不同之处在于，所述所述菌株为链霉菌属(Streptomyces.sp)，所述菌株的保藏号为CCTCC【M2016561】。所述菌株的基因序列为SEQ ID No.1。
本发明还提供一种链霉菌生物制剂，所述链霉菌生物制剂包括权利要求1或2所述的保藏号为CCTCC【M 2016561】的防治猕猴桃溃疡病的菌株的发酵清液。
优选地，所述链霉菌生物制剂还包括所述发酵清液的稀释液。
优选地，所述稀释液包括针对所述发酵清液分别进行1倍至50倍的稀释所获得的系列稀释液。
优选地，用于培养获得所述发酵清液的培养基包括碳源、有机氮源、无机氮源以及无机盐。
优选地，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉或甘油中的一种或几种；
所述有机氮源选自蛋白胨、鱼粉、大豆粉、玉米粉或麦皮中的一种或几种；
所述无机氮源选自硝酸铵、硫酸铵或氯化铵中的一种或几种；
所述无机盐选自氯化钠、碳酸钙、硫酸镁或磷酸盐中的一种或几种。
优选地，用于培养获得所述发酵清液的培养温度为25-30℃。
优选地，用于培养获得所述发酵清液的培养PH在7.0-8.5之间。
本发明还提供了上述的防治猕猴桃溃疡病的菌株、或上述的链霉菌生物制剂在在防治猕猴桃溃疡病中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本申请的申请人发现一株具有广谱抑菌活性的链霉菌SY-ZC，其活性代谢代谢产物具有特殊的功能和结构，而且，该链霉菌SY-ZC对猕猴桃溃疡病具有明显防治效果，可代替化学农药的使用，具有继续开发潜力，可为猕猴桃溃疡病综合防治提供新的有效防治策略、提供技术支持。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施例提供了一种防治猕猴桃溃疡病的菌株，菌株为链霉菌属(Streptomyces.sp)，所述菌株的保藏号为CCTCC【M 2016561】，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏日期：2016年10月13日。
该菌株属于链霉菌属，命名为SY-ZC，分离自渤海湾海边土壤。该菌株在高氏一号培养基上生长菌落较小，圆形，孢子堆颜色为深灰色，基内菌丝前期白色，培养后期呈鲜红至绛红色，气生菌丝较松散，表面有四周发射状突起。菌株最适生长条件为：pH7.0-8.5，温度25-30℃。链霉菌属(Streptomyces.sp)SY-ZC CCTCC【M 2016561】菌株简称链霉菌SY-ZC。
进一步地，将菌株送至宝生物工程有限公司进行测序，测定其16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1，将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在GenBank中进行核苷酸比对及系统发育树建立，结合菌落形态、颜色，生理生化特征，鉴定SY-ZC菌株为链霉菌属(Streptomyces.sp)。
本发明提供了一种链霉菌生物制剂，该链霉菌生物制剂可为链霉菌SY-ZC的发酵清液；该链霉菌生物制剂也可为链霉菌SY-ZC发酵清液的系列稀释液中的一种稀释液或多种稀释液；该链霉菌生物制剂还可为链霉菌SY-ZC的发酵清液与系列稀释液中的一种稀释液或多种稀释液的混合。
链霉菌生物制剂的具体制备步骤为，首先，发酵链霉菌SY-ZC生产发酵液；其次，将发酵液经过离心去除菌体得到发酵清液。具体的，系列稀释液包括针对发酵清液分别进行各种倍数的稀释所获得的稀释液。优选的实施方式中，系列稀释液包括针对发酵清液分别进行1倍至50倍的稀释所获得的稀释液，对猕猴桃溃疡病菌的抑制率更高。
具体的，用于培养链霉菌SY-ZC菌株的营养源没有特别的限制，碳源可以是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、各种淀粉、甘油其中的一种或几种。有机氮源可以是蛋白胨、鱼粉、大豆粉、玉米粉、麦皮其中的一种或几种。另外添加无机氮源如硝酸铵、硫酸铵、氯化铵，还有无机盐如氯化钠、碳酸钙、硫酸镁、磷酸盐一种或几种。通常采用常规高氏一号培养基。但是用于培养链霉菌SY-ZC菌株的培养基不局限于上述所列举的这些培养基配方。
培养本链霉菌SY-ZC菌株的培养条件优选为，培养温度在25-30℃、pH在7.0-8.5之间，振荡速度在130-180rpm/min、装液量一般250mL装80-120mL培养基，至少培养8d。
在以上培养基营养源及培养条件下生产出的发酵液，经过离心去除菌体得到发酵清液，即得到链霉菌SY-ZC生物制剂。本发明提供了的链霉菌生物制剂可以以发酵清液形式施用，也可以将发酵清液系列稀释进行施用。
本发明另外还提供了链霉菌SY-ZC菌株以及链霉菌SY-ZC生物制剂在防治猕猴桃溃疡病中的应用。具体为，用链霉菌SY-ZC发酵清液稀释1倍至5倍的系列发酵清液涂刷枝干、喷施嫩枝或直接喷施于猕猴桃叶片上，即可有效防治猕猴桃溃疡病。
以下结合具体实施例予以说明。
实施例1、链霉菌SY-ZC菌株的获得和鉴定
链霉菌SY-ZC菌株，由渤海湾海边土壤样品中分离获得。
分离方法：取采集的渤海湾海边土壤样品5g倒入装有50mL无菌水的250mL三角瓶中，补加少量葡萄糖和硫酸铵，30℃摇床振荡1d，取5mL系列稀释，取各稀释液0.2mL涂布于高氏一号基平板(可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，pH 7.5)，28℃培养10d，挑取单菌落反复划线纯化，获得纯系菌株。
发酵液制备方法：将保藏的链霉菌SY-ZC菌株接种于高氏一号平板培养基中，放置于25℃培养箱培养4d进行活化，然后用无菌打孔器打成直径为6mm的菌饼，将菌饼接种于高氏一号液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养8d，获得链霉菌SY-ZC发酵液，3000rpm下离心5min，去除菌体获得链霉菌SY-ZC发酵清液。
筛选方法：采取管碟法皿内抑制试验筛选活性菌株，将浓度为107cfu/mL猕猴桃溃疡病菌PA-203菌悬液与融化后并冷却至40℃的LB培养基充分混匀，倒入培养皿中制成带菌平板，每板中心放1个牛津杯，杯中加入100μL菌株发酵清液，每处理3次重复，放入28℃培养箱中，24h后观察抑菌圈产生情况，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。
鉴定方法：扩增SY-ZC菌株的16S rDNA基因，测出其16S rDNA基因序列，登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站，在GenBank中进行核苷酸比对及系统发育树建立，结合菌落形态、颜色，生理生化特征，鉴定SY-ZC菌株为链霉菌属。
实施例2、链霉菌SY-ZC离体抑菌活性试验
采用液体共培养法，首先将链霉菌SY-ZC发酵清液原液以无菌水依次稀释，分别取1mL发酵清液原液、10倍稀释液、50倍稀释液、100倍稀释液及无菌水对照加入至9mL LB液体培养基中，混合后各吸取200μL加入到96孔板中，每处理3个重复，最后接入2μL浓度为107cfu/mL猕猴桃溃疡病菌悬液，同时设置2μL无菌水加入200μL LB液体培养基处理为调零参比，置于28℃培养箱中，24h后利用酶标仪测定600nm光波下吸光值，计算抑菌率。
表1链霉菌SY-ZC发酵液对猕猴桃溃疡病菌的抑制率
其中，抑菌率＝(对照组OD600—试验组OD600)/对照组OD600。
由表1可知，链霉菌SY-ZC菌株对猕猴桃溃疡病菌生长具有明显抑制作用，共同培养24h后除菌发酵液原液、10倍稀释液及50倍稀释液对猕猴桃溃疡病菌抑制率均达90％以上，猕猴桃溃疡病菌生长达稳定期，发酵液抑菌效果明显，尤其是链霉菌SY-ZC发酵清液原液的抑制效果最佳。
实施例3、链霉菌SY-ZC制剂防治猕猴桃溃疡病温室试验
将链霉菌SY-ZC发酵清液原液、10倍稀释液、50倍稀释液、100倍稀释液均匀喷施于一年生猕猴桃种苗叶片及嫩枝上，每处理5株，1d后针刺造成伤口并接种猕猴桃溃疡病菌PA-203菌悬液，直至水滴滴下，100％保湿48h后放置于75-85％湿度环境中，7d后调查发病情况，调查方法及病情指数划分参考A.Cellini的方法计算相对防效。
表2盆栽试验防治效果
结果见表2所示，发酵清液原液及其10倍稀释液防治效果很好，其中发酵清液原液用于防治猕猴桃溃疡病的防治效果达88.7％，高于现有技术中通常所使用的对照药剂氢氧化铜46％水分散粒剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 沈阳化工研究院有限公司
<120> 一种防治猕猴桃溃疡病的菌株及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> 链霉菌属（Streptomyces. sp）
<400> 1
acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgatga accaccttcg ggtggggatt 60
agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca atctgccctg cactctggga caagccctgg 120
aaacggggtc taataccgga tactgacctg ccaaggcatc ttggcgggtc gaaagctccg 180
gcggtgcagg atgagcccgc ggcctatcag cttgttggtg aggtaatggc tcaccaaggc 240
gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga 360
cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgaa 420
agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcgcg 540
tcggttgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcagt cgatacgggc aggctagagt 600
tcggtagggg agatcgga 618

Claims (10)

1.一种防治猕猴桃溃疡病的菌株，其特征在于，所述菌株为链霉菌属(Streptomyces.sp)，所述菌株的保藏号为CCTCC【M 2016561】。
2.根据权利要求1所述的防治猕猴桃溃疡病的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1。
3.一种链霉菌生物制剂，其特征在于，所述链霉菌生物制剂包括权利要求1或2所述的保藏号为CCTCC【M 2016561】的防治猕猴桃溃疡病的菌株的发酵清液。
4.根据权利要求3所述的链霉菌生物制剂，其特征在于，所述链霉菌生物制剂还包括所述发酵清液的稀释液。
5.根据权利要求4所述的链霉菌生物制剂，其特征在于，所述稀释液包括针对所述发酵清液分别进行1倍至50倍的稀释所获得的系列稀释液。
6.根据权利要求3所述的链霉菌生物制剂，其特征在于，用于培养获得所述发酵清液的培养基包括碳源、有机氮源、无机氮源以及无机盐。
7.根据权利要求6所述的链霉菌生物制剂，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉或甘油中的一种或几种；
所述有机氮源选自蛋白胨、鱼粉、大豆粉、玉米粉或麦皮中的一种或几种；
所述无机氮源选自硝酸铵、硫酸铵或氯化铵中的一种或几种；
所述无机盐选自氯化钠、碳酸钙、硫酸镁或磷酸盐中的一种或几种。
8.根据权利要求3所述的链霉菌生物制剂，其特征在于，用于培养获得所述发酵清液的培养温度为25-30℃。
9.根据权利要求3所述的链霉菌生物制剂，其特征在于，用于培养获得所述发酵清液的培养PH在7.0-8.5之间。
10.一种根据权利要求1或2所述的防治猕猴桃溃疡病的菌株、或权利要求3-9任一项所述的链霉菌生物制剂在防治猕猴桃溃疡病中的用途。
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