CN101486982A - 用于防治猕猴桃细菌性溃疡病的内生链霉菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药技术领域，公开了一种杨凌青色链霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov yangling)TIASA5菌株的鉴定及其活性物质的制备方法和应用，该菌株已于2007年8月16日保藏在中国科学院微生物所菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：GCMCC No.2132。该菌株对猕猴桃细菌性溃疡病具有较好的防治作用。该菌株分离自植物组织内，其产生的活性代谢产物对植物组织没有毒害作用，且性质稳定，喷施方便，便于推广应用。

Description

用于防治猕猴桃细菌性溃疡病的内生链霉菌及其制备方法

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种用于防治猕猴桃细菌性溃疡病的内生链霉菌及其制备方法。

背景技术

猕猴桃细菌性溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae)侵染引起的猕猴桃上的重要病害，该病一旦发生流行，不仅影响猕猴桃的产量和果品质量，严重时常常造成毁园，给猕猴桃产业带来巨大损失。猕猴桃细菌性溃疡病于1980年在美国加利福尼亚州和日本神州景岗县首次发现，而我国湖南的东山峰农场在1985年发现该病，当时造成2000余亩果园濒临毁园。猕猴桃在我国陕西和安徽等省有着广泛的种植，猕猴桃生产也是陕西省的重要水果产业之一，但从1991年起相继在长安、户县、周至以及杨凌等猕猴桃产区发现了猕猴桃溃疡病后，近年来该病有扩大流行的趋势，给陕西省的猕猴桃产业带来严重危机。猕猴桃细菌性溃疡病多发生在春季伤流期至开花末期和秋季，可危害植株的主干、枝蔓、嫩梢、叶片、花蕾和花等部位。猕猴桃溃疡病菌主要在藤蔓病枝上越冬，或随病枝、病叶残体在土壤中越冬，翌年3月开始发病，通过风雨、昆虫、农具和农事操作进行传播，从伤口和自然孔口侵入，3～5天后出现症状并产生菌脓进行再侵染，4月下旬出现发病高峰期。发病部位多从弱枝干的皮孔、芽基、叶痕、枝条分叉处开始，低温高湿利于发病，农事操作和修剪时机械损伤愈多，病害发生愈重。

目前防治猕猴桃溃疡病的药剂主要是农用链霉素和石硫合剂，施纳宁是陕西关中地区各植保站推广的一种防治猕猴桃溃疡病的新农药，但田间防病效果均不理想，因而寻找开发新型、高效及安全的生物农药将对猕猴桃产业的稳定和发展具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的旨在寻求防治猕猴桃细菌性溃疡病的内生链霉菌及活性产物的制备方法。

实现上述发明目的的技术方案具体如下：

杨凌青色链霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov yangling)TIASA5菌株(以下简称为TIASA5菌株)，该菌株已于2007年8月16日保藏在中国科学院微生物所菌株保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2132；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

本发明还有一个目的是提供TIASA5菌株的制备方法，具体包括下列步骤：

1)将采自陕西杨凌的野生黄花蒿茎组织用清水洗净后用吸水纸将水分吸干，在99％乙醇中浸1min，然后在浓度为3.125％的NaClO中浸6min，再次放入99％乙醇中浸30sec，最后用无菌生理盐水冲洗5次；

2)将表面消毒后的待分离的黄花蒿茎组织用灭菌刀片切成0.2mm长的小段，置于高氏一号平板上，28℃培养箱培养21～28d后统计放线菌菌落数并用划线法进行纯化成单菌落；

3)将纯化后的单菌落经过如下发酵：将在黄豆粉平板上活化培养5～7d的菌苔平板用打孔器打成直径为6mm的菌饼，接入黄豆粉培养基中，28℃，150r/min培养36h后，按12％的接种量将种子液接入黄豆粉培养基中，30℃，180r/min发酵72～96h，将培养好的发酵液以10000r/min离心30min，取上清液，将制得的上清液用管碟法进行拮抗性筛选，获得广谱抗菌效果明显的拮抗菌株TIASA5。

所述的高氏一号由可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂粉13g，蒸馏水1000mL组成，且pH为7.2。

所述的黄豆粉培养基：可容性淀粉5g、蔗糖10g、蛋白胨2g、酵母膏2g、NaCl 2g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、CaCO₃ 1g、黄豆粉20g煮沸30min过滤、水1000mL、pH为7.2～7.4。

本发明还有一个目的是提供TIASA5菌株的抗菌活性物质，它是按照下列方法制备的：

1)将TIASA5菌株接在黄豆粉平板上，30℃活化培养5～7d，将菌苔平板用打孔器打成直径为6mm的菌饼，先将菌饼接入种子培养基(黄豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，NaCl 2g，CaCO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0)中，28℃，150r/min培养36h后，按12％的接种量将种子液接入发酵培养基(黄豆粉15g、淀粉7.5g、蔗糖10g、玉米粉15g、酵母粉5g、硫酸铵15g、NaCl 2g、K₂HPO₄ 0.5g、CaCO₃ 1g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.2)中，30℃，180r/min发酵72h；

2)将培养好的发酵液在10000r/min下离心30min，取上清液进行提取前预处理，即先用1M H₂SO₄将发酵上清液调至pH值为2，80℃水浴1h后，再用1M的NaOH调至pH值为7，然后以10000r/min的速度离心30min，收集上清液；

3)将按步骤2)预处理好的上清液过732^#离子交换树脂柱，动态吸附，再用1N的氨水洗脱，根据薄层检测和活性跟踪的结果收集合并活性馏分；

4)将活性馏分减压浓缩后再冷冻干燥即得抗菌活性物质。

本发明还有一个目的是提供TIASA5菌株及其抗菌活性物质在防治猕猴桃细菌性溃疡病中的应用。

本发明的TIASA5菌株具有以下特征：

A培养特征：TIASA5菌株在高氏一号平板上菌落较小，菌落为圆形，凸起，孢子堆颜色为橄榄灰色，气生菌丝发达，基内菌丝前期为白色，3～5d后呈绛红色，不产生可溶性色素，该菌株在各培养基上都不产生可溶性色素。

B形态学特征：通过扫描电子显微镜对该菌株的菌丝形态观察，其气生菌丝呈松散的螺旋状，且菌丝表面有细长的毛发状突起。孢子呈椭圆形，孢子表面亦有毛发状突起。菌丝和孢子的形态见附见图1，方法见实施例1。

C生理生化特征：生理生化测试结果表明，TIASA5菌株能使石蕊牛奶变蓝但不胨化，产淀粉酶能力强，能产生卵磷脂酶和纤维素酶，不产生蛋白酶，不产生硫化氢和黑色素，硝酸盐反应阳性。TIASA5菌株可以利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-果糖、肌醇、甘露糖、山梨醇、羧甲基纤维素、半乳糖和棉籽糖，但是不利用甘油；该菌可以利用的氮源有甘氨酸、D，L-α-丙氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-胱氨酸、L-胍氨酸、尿素和L-天门冬氨酸，但不能利用马尿酸钠、L-色氨酸和D，L-酪氨酸。最适生长温度为30℃，对pH不敏感。

D细胞壁糖型和氨基酸分析：经细胞壁氨基酸和糖分析，结果表明该菌株细胞壁中含有L，L-DAP和甘氨酸等多种氨基酸，无特征性糖，属于胞壁I型。

本发明的TIASA5菌株经菌落培养特征、菌丝形态的显微观察、细胞化学分析、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，属于青色链霉菌类。

本发明的TIASA5菌株来自黄花蒿的茎组织，分离筛选方法简单；TIASA5菌株产生的抑制猕猴桃细菌性溃疡病的主要活性物质为碱性水溶性的巴龙霉素族抗生素，能够抑制细菌细胞蛋白质的合成。该类抗生素水溶性好、性质稳定、抗菌谱广、对葡萄球菌和需氧革兰氏阴性杆菌均具有良好的抗菌活性，该菌株是产生此类抗生素菌株的新来源。该菌株分离自健康植物组织内，因而产生的活性代谢产物对植物组织没有明显毒害作用，且性质稳定，喷施方便，防治猕猴桃溃疡病效果显著。

附图说明

图1为TIASA5菌株的菌丝形态及孢子形态特征图。

图2为TIASA5菌株活性粗提物的捷克八溶剂系统纸层析图谱寄生物显影结果图。

具体实施方式

下面通过发明人给出的具体实验例和试验例来进一步详述本发明的TIASA5菌株及活性物质的制备方法和有益效果。

实施例一：TIASA5菌株的分离和形态鉴定

1)将采自陕西杨凌的健康野生黄花蒿茎组织用清水洗净后用吸水纸将水分吸干，在99％乙醇中浸1min，然后在浓度为3.125％的NaClO中浸6min，再次放入99％乙醇中浸30sec，最后用无菌生理盐水冲洗5次；

2)将表面消毒后的待分离的黄花蒿茎组织用灭菌刀片切成0.2mm长的小段，置于高氏一号平板上，28℃培养箱培养21～28d后统计放线菌菌落数并用划线法进行纯化成单菌落；

3)将纯化后的单菌落经过如下发酵：将在黄豆粉平板上活化培养5～7d的菌苔平板用打孔器打成直径为6mm的菌饼，接入黄豆粉培养基中，28℃，150r/min培养36h后，按12％的接种量将种子液接入黄豆粉培养基中，30℃，180r/min发酵72～96h，将培养好的发酵液以10000r/min离心30min，取上清液，后制得的上清液用管碟法进行拮抗性筛选，获得广谱抗菌效果明显的拮抗菌株TIASA5；

实施例二：TIASA5菌株的抗菌活性物质的制备方法

将在黄豆粉平板上活化培养5d的TIASA5菌株用打孔器打成直径为6mm的菌饼，接入种子培养基中，28℃，150r/min培养36h后，按12％的接种量将种子液接入发酵培养基中，30℃，180r/min发酵培养72h。将培养好的发酵液在10000r/min下离心30min，取上清，即为粗发酵液。将粗发酵液用1M H₂SO4调至pH2，80℃水浴1h，然后用1M的NaOH调至pH7，再离心(10000r/min，30min)，收集上清液，初步除掉发酵液中的蛋白质和CaCO₃。将预处理好的发酵液上732^#离子交换树脂，动态吸附，然后用1N的氨水洗脱，流速为3mL/min，每馏分收集100mL。根据活性跟踪的结果收集合并活性馏分。将活性馏分减压浓缩后再冷冻干燥，得到的固体样品即为抗菌活性物质。

试验例1 TIASA5菌株对猕猴桃溃疡菌皿内抑制作用以及活性粗提物田间防治试验

将在固体黄豆粉培养基上培养5d的TIASA5菌株平板用打孔器打成直径为6mm的菌饼，接入黄豆粉培养液中培养36h后作为种子液，然后分别按12％的接种量接入黄豆粉培养液中，30℃，180r/min条件下培养3d后10000r/min离心30min，取上清液备用。将灭菌牛津杯放入混好猕猴桃溃疡病菌(10⁹/mL)的NA平板中央，杯中加入100μL制备的上清液，置30℃培养18～24h后用十字交叉法测量抑菌圈的大小，试验设2个重复，取其平均值。

田间防治试验采用实施例二中活性粗提物A5，选取发病枝条上病斑大小均匀的病斑作为处理对象，并使每个处理的病斑均匀分布在同一株猕猴桃树的各枝条上。试验设4个处理，即喷施稀释100倍粗提物(A₅100×)，稀释500倍粗提物(A₅500×)，以稀释150倍的施那宁(施那宁150×)(有效成分为代森铵)为对照农药，以清水为空白对照。

将选取的病斑用小刀刮去表皮，量取病斑面积，然后将药剂用喷壶喷洒病斑处，连续喷药2次。然后每隔7天调查，并测量病斑面积，一共调查4次。试验每处理为12个病斑，设3个重复。

TIASA5菌株的无菌发酵滤液对供试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌均有很强的抑制作用，其抑菌效果见表1。

表1 TIASA5菌株发酵液对靶标细菌的抑菌作用

田间试验结果表明，稀释100倍和稀释500倍的A₅粗提物菌对猕猴桃溃疡病表现较好的防治效果，在施药21d后，相对防效达到最大(见表2)，其对猕猴桃溃疡病的相对防效分别为61.5％和42.2％，而用施纳宁处理的相对防效为30.8％，且差异显著。

表2 TIASA5菌株发酵液粗提物对猕猴桃溃疡病的田间防治效果

试验例2：TIASA5菌株的活性物质的性质预试

采用捷克八溶剂系统纸层析试验：取18×0.5cm的滤纸条，在其下端5cm处点上适当的样品(采用实施例二中活性粗提物A₅)，分别挂在装有展开剂的层析缸中，使有样品一端浸入溶剂约1cm深度。待溶剂扩展到纸条上端3cm处取下，风干，平铺在混有枯草芽孢杆菌的NA平板上，置4℃冰箱渗透3h后揭开滤纸条，然后置30℃培养箱培养18～24h，观察结果见(图2a：纸层析图谱，b：生物显影)，记录抑菌圈中心距点样原点的距离，计算各自的Rf值。Rf＝样品由原点到抑菌圈中心的距离/溶剂由原点到溶剂前沿的距离。将各展开剂中展开的Rf值连成的折线图谱与标准图谱进行比较发现，TIASA5发酵液的图谱与标准图谱中的第一大类抗生素图谱，即在第5，6种展开系统中的Rf值较大，因此推断TIASA5菌株发酵液中的抑菌活性物质属于碱性水溶性抗生素-氨基糖苷类抗生素，进一步分离纯化和结构鉴定结果表明主要抗菌活性物质为巴龙霉素。

Claims (5)

1.杨凌青色链霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov yangling)TIASA5GCMCC No.2132。

2.制备权利要求1所述的杨凌青色链霉菌TIASA5菌株的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)将采自陕西杨凌的野生黄花蒿茎组织用清水洗净后用吸水纸将水分吸干，在99％乙醇中浸1min，然后在浓度为3.125％的NaClO中浸6min，再次放入99％乙醇中浸30sec，最后用无菌生理盐水冲洗5次；

2)将表面消毒后的待分离的黄花蒿茎组织用灭菌刀片切成0.2mm长的小段，置于高氏一号平板上，28℃培养箱培养21～28d后统计放线菌菌落数并用划线法进行纯化成单菌落；

3)将纯化后的单菌落经过如下发酵：将在黄豆粉平板上活化培养5～7d的菌苔平板用打孔器打成直径为6mm的菌饼，接入黄豆粉培养液中，28℃，150r/min培养36h后，按12％的接种量将种子液接入黄豆粉培养基中，30℃，180r/min发酵72～96h，将培养好的发酵液以10000r/min离心30min，取上清，将制得的发酵上清液用管碟法进行拮抗性筛选，获得广谱抗菌效果明显的拮抗菌株TIASA5；

所述的高氏一号由可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂粉13g，蒸馏水1000mL组成，且pH为7.2；

所述的黄豆粉培养基可容性淀粉5g、蔗糖10g、蛋白胨2g、酵母膏2g、NaCl 2g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、CaCO₃ 1g、黄豆粉20g煮沸30min过滤、蒸馏水1000ml、pH为7.2～7.4。

3.权利要求1所述的杨凌青色链霉菌TIASA5菌株的抗菌活性物质，其特征在于，它是按照下列方法制备的：

1)将杨凌青色链霉菌TIASA5菌株接在黄豆粉平板上，30℃活化培养5～7d，将菌苔平板用打孔器打成直径为6mm的菌饼，先将菌饼接入种子培养基中，28℃，150r/min培养36h后，按12％的接种量将种子液接入发酵培养基中，30℃，180r/min发酵72h；

2)将培养好的发酵液在10000r/min下离心30min，取上清液进行提取前预处理，即先用1M H₂SO₄将发酵上清液调至pH值为2，80℃水浴1h后，再用1M的NaOH调至pH值为7，然后以10000r/min的速度离心30min，收集上清液；

3)将按步骤2)预处理好的上清液过732^#离子交换树脂柱，动态吸附，再用1N的氨水洗脱，根据薄层检测和活性跟踪的结果收集合并活性馏分；

4)将活性馏分减压浓缩后再冷冻干燥即得抗菌活性物质；

所述的种子培养基由黄豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g，NaCl2g，CaCO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL组成，其pH为7.0；

所述的发酵培养基由黄豆粉15g、淀粉7.5g、蔗糖10g、玉米粉15g、酵母粉5g、硫酸铵15g、NaCl 2g、K₂HPO₄ 0.5g、CaCO₃ 1g、蒸馏水1000mL组成，其pH 7.0-7.2。

4.权利要求1所述的杨凌青色链霉菌TIASA5菌株在防治猕猴桃细菌性溃疡病中的应用。

5.权利要求3所述的杨凌青色链霉菌TIASA5菌株的抗菌活性物质在防治猕猴桃细菌性溃疡病中的应用。

Images