CN103451112A - 一株耐盐碱长枝木霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱长枝木霉及其应用。本发明的耐盐碱长枝木霉的菌株号为29TJ04,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7976。本发明的长枝木霉29TJ04能耐受80g/L以下盐浓度引起的盐胁迫和pH8.0以下的碱胁迫。在盐碱土壤中引进本发明的长枝木霉29TJ04，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡。

Description

一株耐盐碱长枝木霉及其应用

技术领域

本发明涉及一株耐盐碱长枝木霉及其应用。

背景技术

木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌类的丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，广泛存在于土壤中。1932年，Weindling发现木素木霉(Trichoderma lignorum)可以寄生于多种植物病原真菌，建议将该菌用于土传植物病害的生物防治，木霉菌生防研究工作从此开始。20世纪70年代以来，国内外学者对木霉菌的拮抗作用及其机制作了大量深入的研究。K.Rinu(2013)等的研究发现，木霉菌产生的挥发性物质可引起病原菌结构畸变，进而引发形态畸变，从而抑制其孢子生长。李冲伟(2012)等的研究指出木霉菌产生的抑菌活性物质可破坏病原菌的防护系统和代谢途径，从而抑制其生长。除了生防功能外，木霉菌株还可以促进多种植物种子萌发、植株生长和开花、提高作物产量。关于其促生机制的研究也已比较深入，Hexon Angel Contreras-Corne jo等(2009)的研究指出，木霉菌通过生长素依赖机制增加植物的生物产量，刺激侧根生长，从而促进植物生长；还有研究(K.Rinu,2013;戚玮真,2012,等)发现部分木霉菌具有溶解可溶性或微溶性矿物质的能力，促进植物对矿物质的吸收，从而促进植物生长。

烟草猝倒病俗称“倒苗病”、“塌皮烂”，其病原菌主要是由腐霉属真菌引起，猝倒病在幼苗生长的任何时期都可发生，但在三叶期以前幼苗出土至大十字期最易发病，根、茎、叶均可受害。发病初期幼苗基部呈褐色水渍状软腐，真叶局部发生褐色水渍状斑，发病后期茎部似沸水烫过，呈暗绿色；然后病部腐烂并逐渐干缩，病苗猝然萎蔫、折倒、干枯、死亡，苗床通常连片发病，烟苗成片倒伏死亡。天气潮湿时，腐烂部分常产生白色菌丝。烟苗病死后，在苗床上形成“补丁状”病区，严重时整畦烟苗所剩无几。4—6叶期的幼苗也可被害，受病植株停止生长，叶片呈苍黄色，病苗根部发生水渍状腐烂，皮层易自中柱剥离。如病菌从土面侵害烟株，则根不变色，但移栽后如环境条件有利，在茎的近土面处产生褐色水渍伤痕，进而茎部破碎或皱缩干瘪。成株期受害，也多从茎基部开始，病部表现污白色或褐色水腐状病斑，并沿土层向上、下发展，最后使茎基部组织腐烂，引起整株枯萎。特别是在涝害之后，有时在烟株中部也可产生大块褐色块斑。自80年代以来，烟草猝倒病的发生范围、危害程度均迅速扩大，在山东、河南、安徽、云南、贵州、四川、福建、黑龙江和台湾等省都有流行，是全国各烟区普遍发生的一种苗床期主要病害，已成为烟草生产上的严重威胁。

烟草黑胫病俗称“黑根”、“黑秆疯”，多发生于成株期，也有少数苗床期发生。幼苗染病时，茎基部出现污黑色病斑，或从底叶发病沿叶柄蔓延至幼茎，引致幼苗猝倒，湿度大时，病部长满白色菌丝，幼苗成片死亡，茎秆染病时，茎基部初呈水渍状黑斑，后向上下及髓部扩展，绕茎l周时，植株萎蔫死亡。纵剖病茎，可见髓部黑褐色坏死并干缩呈“笋节”状，“节”间长满白色絮状菌丝。叶片染病时，初为水渍状暗绿色小斑，后扩大为中央黄褐色坏死、边缘不清晰隐约有轮纹呈”膏药”状黑斑.潮湿条件下，表面会生白色绒毛状物，是烟草上为害最严重的病害之一。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm²，产量损失2869.26万千克，产值损失超过1.23亿元人民币。

目前生产上多采用化学药剂防治，但是长期大量地使用农药致使病原菌产生抗性，且严重破坏农业生态系统，造成对环境的污染。

发明内容

本发明的目的是提供一株耐盐碱长枝木霉及其应用。

本发明提供的耐盐碱长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，菌株号为29TJ04,已于2013年07月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7976。长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)29TJ04CGMCC No.7976在下文中简称长枝木霉29TJ04。

实验证明长枝木霉29TJ04能耐受80g/L以下（如50g/L以下或20g/L以下、50g/L-80g/L、20g/L-80g/L或20g/L-50g/L）的盐引起的盐胁迫和pH8.0以下的碱胁迫。在本发明的一个实施方式中，所述盐胁迫由含80g/L、50g/L或20g/L的NaCl环境引起。

所述长枝木霉29TJ04可以分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式存在。

本发明所提供的长枝木霉29TJ04的应用为下述任一种：

1、长枝木霉29TJ04在防治植物病害中的应用。

2、长枝木霉29TJ04和/或长枝木霉29TJ04的代谢物在制备植物病原菌抑制剂中的应用。

3、长枝木霉29TJ04和/或长枝木霉29TJ04的代谢物在制备植物病害抑制剂中的应用。

4、植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂，它的活性成分是长枝木霉29TJ04和/或长枝木霉29TJ04的代谢物。

5、防治烟草烟草猝倒病和/或烟草黑胫病的方法，包括用长枝木霉29TJ04菌悬浮液浇灌烟草植株的步骤；每株烟草植株的用量为（5-10）×10⁵cfu长枝木霉29TJ04。

在本发明的一个实施方式中，所述长枝木霉29TJ04菌悬浮是用水悬浮长枝木霉29TJ04得到的液体。

上文中，所述防治植物病害可为防治植物在盐碱胁迫环境中的所述植物病害。所述植物病害可为真菌病害。所述真菌病害可为烟草猝倒病和烟草黑胫病中的至少一种。在本发明的一个实施方式中，所述烟草猝倒病由瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）引起，所述烟草黑胫病由寄生疫霉烟草致病变种(Phytophthora parasiticavar.nicotianae）引起。

上文中，所述防治具体可为预防和/或治疗。所述长枝木霉29TJ04的代谢物可从长枝木霉29TJ04的发酵液中获得。所述长枝木霉29TJ04的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养长枝木霉29TJ04，除去液体培养物（发酵液）中的长枝木霉29TJ04即得到所述长枝木霉29TJ04的代谢物。

上文中，所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中，所述长枝木霉29TJ04可以分生孢子、厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式存在。

所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、稳定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。

本发明制剂中的长枝木霉29TJ04的分生孢子数量随剂型和施用的方法而变化。固体制剂中，分生孢子的数量为（1×10⁴）-（1×10⁸）cfu/克，如（1×10⁶）-（1×10⁷）个cfu/克。对于液体制剂，稀释后的喷洒液中分生孢子的含量通常为（1.0×10⁴）-（5.0×10⁷）cfu孢子/mL，如（1-3）×10⁵cfu/mL。

所述植物病原菌抑制剂和植物病害抑制剂可以与其它适合的化学农药配合使用，从而降低化学农药剂的用量，减少对环境的污染。

实验证明，本发明的长枝木霉29TJ04能耐受80g/L以下盐浓度引起的盐胁迫和pH8.0以下的碱胁迫，对烟草猝倒病和烟草黑胫病的防治效果分别为50%和100%，在盐碱土壤中引进本发明的长枝木霉29TJ04，通过生物防治可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡。

生物材料保藏说明

1、分类命名：哈茨木霉（Trichoderma harzianum），

菌株编号：29HB16，

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏机构简称：CGMCC，

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，

保藏日期：2013年07月31日，

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7975。

2、分类命名：长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，

菌株编号：29TJ04，

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏机构简称：CGMCC，

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，

保藏日期：2013年07月31日，

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7976。

下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

附图说明

图1为编号为29TJ04的木霉菌株对猝倒病病菌和黑胫病病菌的抑制作用。

A为编号为29TJ04的木霉菌株与猝倒病病菌的对峙培养平板；

B为只接种猝倒病病菌的平板；

C为编号为29TJ04的木霉菌株与黑胫病病菌的对峙培养平板；

D为只接种黑胫病病菌的平板。

图2为编号为29TJ04的木霉菌株的菌落形态和显微照片。

图3为编号为29HB16的木霉菌株的菌落形态和显微照片。

图4为编号为29HB16的木霉菌株对猝倒病病菌和黑胫病病菌的抑制作用。

A为编号为29HB16的木霉菌株与猝倒病病菌的对峙培养平板；

B为只接种猝倒病病菌的平板；

C为编号为29HB16的木霉菌株与黑胫病病菌的对峙培养平板；

D为只接种黑胫病病菌的平板。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中所用的黑胫病致病菌为寄生疫霉卵菌纲真菌寄生疫霉烟草致病变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae），在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC38065，收藏日为2011年8月10日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株，下述实施例中均简称为黑胫病病菌。

实施例中所用的根腐病（猝倒病）致病菌为瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum），在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC38064，收藏日为2011年8月10日，自收藏之日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株，下述实施例中均简称为猝倒病病菌。

实施例中所用的编号为ACCC32522的木霉菌株（长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)），在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC32522，收藏日为2013年3月23日，自收藏之日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。

实施例中所用的编号为ACCC32524的木霉菌株（哈茨木霉（Trichodermaharzianum）），在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC32524，收藏日为2013年3月23日，自收藏之日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。

实施例1、哈茨木霉29HB16和长枝木霉29TJ04的特性及鉴定

1.1土壤样品来源采自天津、河北地区的盐碱地。

1.2培养基

马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，得到不含氯化钠的PD液体培养基。

马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，20g琼脂，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，得到不含氯化钠的PDA培养基。

耐盐碱木霉菌选择性固体培养基：分别向上述不含氯化钠的PDA培养基中加入氯化钠至氯化钠的含量为20g/L（0.34mol/L），50g/L（0.86mol/L）或80g/L（1.4mol/L），均调节pH为8.0，得到氯化钠含量为20g/L的耐盐碱木霉菌选择性培养基（简称20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基）、氯化钠含量为50g/L的耐盐碱木霉菌选择性培养基（简称50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基）和氯化钠含量为80g/L的耐盐碱木霉菌选择性培养基（简称80g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基）。

耐盐碱木霉菌选择性液体培养基：分别向上述不含氯化钠的PD液体培养基中加入氯化钠至氯化钠的含量为20g/L（0.34mol/L），50g/L（0.86mol/L）或80g/L（1.4mol/L），均调节pH为8.0，得到氯化钠含量为20g/L的耐盐碱木霉菌选择性液体培养基（简称20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基）、氯化钠含量为50g/L的耐盐碱木霉菌选择性液体培养基（简称50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基）和氯化钠含量为80g/L的耐盐碱木霉菌选择性液体培养基（简称80g/L NaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基）。

以上培养基菌种115℃条件下灭菌20分钟。

1.3耐盐碱木霉菌株的分离筛选及基本生物学特性分析

1.3.1耐盐碱木霉菌株的分离筛选采用稀释涂布法由上述耐盐碱木霉菌选择性固体培养基分离菌株，挑取不同形态的木霉菌菌落进行纯化，转接至上述20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基斜面保存。

结果共得到可耐受80g/LNaCl浓度、pH8.0的木霉菌株20株。其中，编号为29HB16、29TJ04、ACCC32522和ACCC32524的四株木霉菌的土样信息如表1所示。

表1 四株木霉菌土样信息

编号	土样采集地	土壤类型
			29TJ04	天津市静海县大丰堆镇丰普村	芦苇地
29HB16	河北省海兴县赵毛陶乡后尤庄村	小麦地
			ACCC32522	德州市平原县三唐乡官道郑村	玉米地
ACCC32524	河北省沧州市黄骅市中捷11队	果树地

1.3.2不同NaCl浓度下菌株形态学特征(pH8.0)将所选木霉菌株分别转接到上述不含氯化钠的PDA培养基、20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基、50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基和80g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基的平板中央，28℃恒温培养箱培养3-7d，观察菌株产孢情况并测量菌落直径。每处理重复3次，每个重复设3个平板。该实验中所有的平板完全相同（直径和厚度均相同）。

结果表明培养基中NaCl的存在对菌株的生长速度、产孢量及孢子颜色都有较大影响，随着盐浓度的升高，菌株生长受到抑制，产孢量下降，孢子颜色也发生变化，但是NaCl对不同菌株抑制作用的表现形式并不完全相同，有的菌株生长速度受抑制程度轻，有的菌株生长速度受抑制程度重。在所测试的20株木霉菌株中，编号为29HB16和29TJ04的两株木霉菌对盐胁迫的耐受力较强。编号为29TJ04的木霉菌株在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基和其在不含氯化钠的PDA培养基中的生长情况一致，培养3天，菌落直径均为8.5cm，孢子均为绿色，产生的孢子均能覆盖整个平板；在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基培养5天，菌落直径为8.5cm，孢子为绿色，产生的孢子覆盖3/4个平板；在80g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基培养7天，菌落直径为5.9cm，孢子为绿色，产生的孢子覆盖3/4个平板。编号为29HB16的木霉菌株在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基和其在不含氯化钠的PDA培养基中的生长情况一致，培养3天，菌落直径均为8.5cm，孢子均为浅绿色，产生的孢子均能覆盖整个平板；在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基培养5天，菌落直径为7.2cm，孢子为黄色，产生的孢子覆盖3/4个平板；在80g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基培养7天，菌落直径为3.0cm，孢子为白色，产生的孢子覆盖1/2个平板。编号为ACCC32522的木霉菌株在不含氯化钠的PDA培养基中培养3天，菌落直径为8.5cm，孢子为绿色，产生的孢子能覆盖整个平板；在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养3天，菌落直径为7.8cm，孢子为黄色，产生的孢子能覆盖3/4个平板；在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养5天，菌落直径为6.9cm，孢子为黄色，产生的孢子能覆盖1/2个平板；在80g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养7天，菌落直径为3.0cm，孢子为白色，产生的孢子能覆盖1/2个平板。编号为ACCC32524的木霉菌株在不含氯化钠的PDA培养基中培养3天，菌落直径为8.5cm，孢子为黄绿色，产生的孢子能覆盖整个平板；在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养3天，菌落直径为4.6cm，孢子为白色，产生的孢子能覆盖1/2个平板；在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养5天，菌落直径为4.6cm，孢子为白色，产生的孢子能覆盖1/2个平板；在80g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养7天，菌落直径为1.7cm，孢子为白色，产生的孢子能覆盖1/2个平板（表2）。

表2 不同NaCl浓度下所选菌株的形态学特征

表2中，“无NaCl”表示在不含氯化钠的PDA培养基中培养，“20g/LNaCl”表示在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养，“50g/LNaCl”表示在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养，“80g/LNaCl”表示在80g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基中培养；“+++”表示产生的孢子覆盖整个平板，“++”表示产生的孢子覆盖3/4个平板，“+”表示产孢，产生的孢子覆盖1/2个平板；“G”表示绿色，“LG”表示浅绿色，“Y”表示黄色，“W”表示白色，“YG”表示黄绿色。

1.3.3NaCl浓度对菌株菌丝干重的影响(pH8.0)分别挑取一个所选木霉菌株菌饼(直径6mm)转接到装100mL含不同NaCl浓度的液体培养基——上述不含氯化钠的PD液体培养基、20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基、50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基的三角瓶中，28℃,180r/min摇床震荡培养3d，过滤收集菌丝体，无菌水洗涤2次，70℃烘干过夜，称取菌丝干重。每处理重复3次，每个重复设3个三角瓶。

结果表明培养基中NaCl的存在对菌株的生物量有较大影响，随着盐浓度的升高，菌株生长受到抑制，但是NaCl对不同菌株抑制作用的表现形式并不完全相同，有的菌株生物量受抑制程度轻，有的菌株生物量受抑制程度重。在所测试的20株木霉菌株中，编号为29HB16和29TJ04的两株木霉菌对盐胁迫的耐受力较强。编号为29TJ04的木霉菌株在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性培养基和其在不含氯化钠的PD液体培养基中的生物量差别较小，在不含氯化钠的PD液体培养基中的菌丝干重是0.835克/100mL，在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基中的菌丝干重是0.802克/100mL，在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基中的生物量较低，菌丝干重是0.501克/100mL。编号为29HB16的菌株对盐胁迫的耐受力低于编号为29TJ04的木霉菌株，编号为29HB16的菌株在不含氯化钠的PD液体培养基中的菌丝干重是0.490克/100mL，在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基中的菌丝干重是0.286克/100mL，在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基中的生物量较低，菌丝干重是0.171克/100mL。

表3 不同NaCl浓度下培养3d后所选菌株的菌丝干重

表3中，“无NaCl”表示在不含氯化钠的PDA培养基中培养，“20g/LNaCl”表示在20g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基中培养，“50g/LNaCl”表示在50g/LNaCl耐盐碱木霉菌选择性液体培养基中培养。

1.4菌株抗病效果分析

平板对峙培养分别以上述猝倒病病菌和黑胫病病菌单独作为病原菌，分别以编号为29HB16和29TJ04的两株木霉菌单独作为待测木霉菌，参照陈志敏（陈志敏,吴昊鑫,等.烟田瓜果腐霉的分离鉴定及其拮抗木霉菌株的筛选.福建农林大学学报,2009,38(1):11-15）的方法，用打孔器(直径为6mm)打取培养4-7d的待测木霉菌和病原菌的菌饼，在距离上述不含氯化钠的PDA培养基的平板中心4.0cm的相对2点上，分别接种待测木霉菌和病原菌（猝倒病病菌或黑胫病病菌），置于28℃恒温培养箱中培养，测量两接种点连线上病原菌的菌落半径，计算抑菌率。以不接木霉菌、只接病原菌（猝倒病病菌或黑胫病病菌）的平板为对照。每处理重复3次，每个重复设3个平板。

当两菌接触后，观察记录木霉菌对病原菌的抑制、包围、侵入情形，及其占领病原菌生长空间的过程。

菌株发酵液抑菌活性测定分别以上述猝倒病病菌和黑胫病病菌单独作为病原菌，分别以编号为29HB16和29TJ04的两株木霉菌单独作为待测木霉菌，参照文献（陈志敏,吴昊鑫,等.烟田瓜果腐霉的分离鉴定及其拮抗木霉菌株的筛选.福建农林大学学报,2009,38(1):11-15；郑小波.疫霉菌及其研究技术.北京:中国农业大学出版社,1997）的方法，分别将待测木霉菌接于上述不含氯化钠的PDA培养基的平板上培养4-5d，用直径为6mm的打孔器打取菌饼；将上述菌饼接入装有100mL上述不含氯化钠的PD液体培养基的250mL三角瓶中，在28℃、180r/min的摇床中培养4d；过滤去除菌丝体，滤液用无菌的滤膜(直径为0.22μm)过滤除菌，将无菌滤液与上述不含氯化钠的PDA培养基按l:9的比例混匀后倒入平板，每皿15mL左右；在平板中央接种培养4-7d的病原菌菌饼(直径为6mm)，置于28℃恒温培养箱中培养，测量菌落直径，计算抑菌率。以加上述不含氯化钠的PD液体培养基为对照。每处理重复3次。

结果表明20株木霉菌对瓜果腐霉菌和烟草疫霉菌具有不同程度的抑制作用。编号为29HB16和29TJ04的两株木霉菌的总体抑制效果相对较好，接种初期，木霉菌与病原菌均正常生长，两菌接触后，病原菌生长受到抑制，木霉菌持续生长，侵入病原菌菌落中，最终病原菌整个菌落被木霉菌吞噬，并形成大量的绿色孢子。这可能是由于其生长快，迅速占领营养空间，并产生具有抑菌活性的代谢物质，从而阻止了病原菌的进一步扩展。但13、16号菌株对两种病原菌的抑制效果较差，当它们与病原菌接触后，病原菌也停止生长，但这两株菌侵入病原菌菌落的能力较差，无法覆盖病原菌继续生长，原因可能是菌株本身生长较为缓慢，不能很好的占领营养空间。编号为29TJ04的木霉菌株对猝倒病病菌和黑胫病病菌的抑制照片如图1所示,编号为29HB16的木霉菌株对猝倒病病菌和黑胫病病菌的抑制照片如图4所示。如表4所示，编号为29TJ04的木霉菌株对猝倒病病菌和黑胫病病菌的抑制率均高于编号为29HB16的木霉菌株。

所选木霉菌的发酵液对同一病原菌的抑制效果存在差异，同一株木霉菌的发酵液对不同病原菌的抑制效果也存在差异。如表4所示，编号为29TJ04的木霉菌株发酵液对猝倒病病菌的抑制率高于编号为29HB16的木霉菌株发酵液，编号为29TJ04的木霉菌株发酵液对黑胫病病菌的抑制率低于编号为29HB16的木霉菌株发酵液。

平板对峙培养和菌株发酵液抑菌活性测定结果不完全一致，可能是因为两者作用机制的侧重点不同，平板对峙主要依靠菌丝生长速率、占领营养空间的能力，而发酵液抑菌主要依靠菌株产生的抑菌活性物质，菌株的抗病性是两者综合作用的结果，需要盆栽试验来进一步验证。

表4 所选木霉菌对病原菌的抑制作用

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，CK表示不接木霉菌、只接病原菌的对照。

1.5盆栽防治试验

根据平板对峙和菌株发酵液抑菌活性结果，分别以上述猝倒病病菌和黑胫病病菌单独作为病原菌，分别以编号为29HB16和29TJ04的两株木霉菌单独作为生防菌，进行盆栽防治试验。

病原菌孢子悬浮液的制备：将猝倒病病菌或黑胫病病菌接于燕麦培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养7-10d，用灭菌水洗下，分别配成10⁴cfu·mL^-1的猝倒病病菌孢子悬浮液和10⁴cfu·mL^-1的黑胫病病菌孢子悬浮液。

编号为29HB16的菌悬浮液的制备：取在不含氯化钠的PDA培养基培养好的有编号为29HB16的木霉菌株培养皿，用接种环刮取孢子，加入20mL无菌水，并加入1mL的1%吐温80，将孢子悬液倾入装有石英砂玻璃珠的孢子分散瓶内，振荡20-30min。将孢子悬液经过灭菌的纱布过滤，用血球计数板测定孢子数，用无菌水将滤液调至10⁵cfu·mL^-1，得到编号为29HB16的木霉菌株的菌悬浮液。

编号为29TJ04的菌悬浮液的制备：取在不含氯化钠的PDA培养基培养好的有编号为29TJ04的木霉菌株培养皿，用接种环刮取孢子，加入20mL无菌水，并加入1mL的1%吐温80，将孢子悬液倾入装有石英砂玻璃珠的孢子分散瓶内，振荡20-30min。将孢子悬液经过灭菌的纱布过滤，用血球计数板测定孢子数，用无菌水将滤液调至10⁵cfu·mL^-1，得到编号为29TJ04的木霉菌株的菌悬浮液。

实验设三次重复，每次重复取生长50d左右、生长较为一致的105株烤烟烟苗（品种为K326，种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供），植载于装有灭菌营养土的花钵中，每钵1株，每钵800g灭菌营养土，分别均分为7组，每组15株，分别进行如下处理：对照1（CK₀）：每钵灭菌营养土中只加10ml的无菌水，不接种病原菌，也不接种生防菌；对照2（CK_猝倒病）：每钵灭菌营养土中加5ml的无菌水和5ml猝倒病病菌孢子悬浮液（10⁴cfu·mL^-1）；对照3（CK_黑胫病）：每钵灭菌营养土中加5ml的无菌水和5ml黑胫病病菌孢子悬浮液（10⁴cfu·mL^-1）；29TJ04防治黑胫病处理：每钵灭菌营养土中加5ml的编号为29TJ04的菌悬浮液（10⁵cfu·mL^-1）和5ml黑胫病病菌孢子悬浮液（10⁴cfu·mL^-1）；29TJ04防治猝倒病处理：每钵灭菌营养土中加5ml的编号为29TJ04的菌悬浮液（10⁵cfu·mL^-1）和5ml猝倒病病菌孢子悬浮液（10⁴cfu·mL^-1）；29HB16防治黑胫病处理：每钵灭菌营养土中加5ml的编号为29HB16的菌悬浮液（10⁵cfu·mL^-1）和5ml黑胫病病菌孢子悬浮液（10⁴cfu·mL^-1）；29HB16防治猝倒病处理：每钵灭菌营养土中加5ml的编号为29HB16的菌悬浮液（10⁵cfu·mL^-1）和5ml猝倒病病菌孢子悬浮液（10⁴cfu·mL^-1）。

待CK_猝倒病发病后调查猝倒病发病情况并计算猝倒病防效，待CK_黑胫病发病后调查黑胫病发病情况并计算黑胫病防效。

两株木霉菌对烟草猝倒病和烟草黑胫病均具有不同程度的防治效果。其中，编号为29HB16的木霉菌株对两种病害的防治效果最好，分别为75%和100%，编号为29TJ04的木霉菌株对烟草黑胫病的防效高达100%，但对烟草猝倒病的防治效果相对较差，为50%（表5），这两株木霉菌的温室盆栽防效与室内拮抗效果存在一定差异，编号为29TJ04的木霉菌株对猝倒病病菌的室内拮抗效果显著高于编号为29HB16的木霉菌株，但盆栽试验效果却比编号为29HB16的木霉菌株差，其机制还需要进一步研究。

表5两株木霉菌株对烟草猝倒病、黑胫病的防治效果

表5中，CK_病表示CK_猝倒病或CK_黑胫病。

1.6菌株鉴定

1.6.1菌落形态观察对编号为29HB16、29TJ04、ACCC32522和ACCC32524的四株木霉菌进行分类鉴定，将菌株分别接种于PDA、SNA培养基上，23℃标准培养架上培养7d，观察菌落形态并镜检其产孢结构和孢子形态，参照文献（魏景超.真菌鉴定手册.上海科学技术出版社,1979:132-134；李世贵,顾金刚等.木霉属及其相关有性型属菌种资源描述规范.2007(1):47-66）进行。

1.6.2分子生物学鉴定用CTAB法提取菌株基因组DNA，用引物ITSl

(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和EFl-728F(5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’)、EF1-986R

(5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’)分别进行ITS和TEF序列分析（IrinaS.Druzhinina,Alexei G.Kopchinskiy,et al.An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea.Fungal Genetics and Biology,2005(42):813～828）。ITS扩增体系为10倍缓冲液(含15mmol/LMgCl₂)5μL，dNTP1μL，引物I1μL，引物II1μL，Taq酶1μL，DNA5μL，用ddH₂0补足到50μL。扩增反应程序为95℃5min，95℃30s，55℃45s，72℃1min，35个循环，72℃5min。TEF序列扩增体系为10倍缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl₂1.5μL，dNTP0.5μL，引物I1μL，引物II1μL，Taq酶0.5μL，DNA1μL，用ddH₂0补足到25μL。扩增反应程序为97℃1min，96℃30s，60℃1min，72℃1min，35个循环，72℃10min。

1.6.3鉴定结果

编号为29HB16的木霉菌株在PDA上培养，23℃培养2天出现分生孢子，菌落直径85mm，菌丝白色絮状，分生孢子绿色，经常有白色菌丝分布在大量分生孢子的表面，产生黄色扩散性色素；SNA培养基上产孢较少，孢子青绿色；分生孢子梗轮生，直或者弯曲，有复杂分枝，整个结构类似金字塔形状，分生孢子亚球形至卵圆形或短的椭球形（图3）。其ITS序列如SEQ ID No.1所示，其TEF序列如SEQ ID No.2所示。根据上述特征将编号为29HB16的木霉菌株鉴定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）29HB16已于2013年07月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7975。

编号为29TJ04的木霉菌株在PDA上培养，23℃培养56h菌落直径85mm，30h内出现分生孢子。分生孢子大量，黑绿色，有时杂色，有白色斑点；在SNA上分生孢子产生较晚；PDA上经常有不明显的黄色菌丝分布在大量分生孢子的表面，产生黄色的扩散性色素，菌丝白色絮状，菌落浓密，绿色孢子上产生淡黄绿色渗出液；瓶梗单生，经常不是轮生，中部膨大，平直或弯曲至不规则，分生孢子椭圆形或细长椭圆形（图2），其ITS序列如SEQ ID No.3所示，其TEF序列如SEQ ID No.4所示。根据上述特征将编号为29TJ04的木霉菌株鉴定为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)。长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)29TJ04已于2013年07月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7976。

编号为ACCC32522的木霉菌株在PDA上23℃培养56h菌落直径85mm，48h后出现分生孢子。分生孢子大量，绿色；在SNA上分生孢子产生较少，分布在集中在平板中央；PDA上有大量白色菌丝分布在分生孢子的表面，产生黄色的扩散性色素，菌丝白色絮状，菌落浓密；瓶梗单生，经常不是轮生，中部膨大，平直或弯曲至不规则，分生孢子椭圆形或细长椭圆形，其ITS序列如SEQ ID No.5所示，其TEF序列如SEQ IDNo.6所示。根据上述特征将编号为ACCC32522的木霉菌株鉴定为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)。长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)ACCC32522已于2013年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心（简称ACCC），保藏号为ACCC32522。

编号为ACCC32524的木霉菌株在PDA上，23℃培养2天出现分生孢子，72h后菌落直径85mm，菌丝白色絮状，分生孢子黄绿色，有白色菌丝分布在大量分生孢子的表面，产生黄色扩散性色素；SNA培养基上产孢较少，孢子青绿色，分布在平板边缘，形成同心圆；分生孢子梗轮生，直或者弯曲，有复杂分枝，整个结构类似金字塔形状，分生孢子亚球形至卵圆形或短的椭球形，其ITS序列如SEQ ID No.7所示，其TEF序列如SEQ ID No.8所示。根据上述特征将编号为ACCC32524的木霉菌株鉴定为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）ACCC32524已于2013年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心（简称ACCC），保藏号为ACCC32524。

Claims (10)

1.长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，其特征在于：所述长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的菌株号为29TJ04,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7976。

2.根据权利要求1所述的长枝木霉，其特征在于：所述长枝木霉耐受80g/L以下盐浓度引起的盐胁迫。

3.根据权利要求1或2所述的长枝木霉，其特征在于：所述长枝木霉耐受pH8.0以下的碱胁迫。

4.权利要求1-3中任一所述的长枝木霉在防治植物病害中的应用。

5.权利要求1-3中任一所述的长枝木霉和/或所述长枝木霉的代谢物在制备植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂中的应用。

6.植物病原菌抑制剂或植物病害抑制剂，它的活性成分是权利要求1-3中任一所述的长枝木霉和/或所述长枝木霉的代谢物。

7.如权利要求4或5所述的应用或权利要求6所述的抑制剂，其特征在于：所述植物病害为真菌病害。

8.如权利要求7所述的应用或抑制剂，其特征在于：所述真菌病害为烟草猝倒病和/或烟草黑胫病。

9.根据权利要求4-8中任一所述的应用，其特征在于：所述防治植物病害为防治植物在盐碱胁迫环境中的所述植物病害。

10.防治烟草烟草猝倒病和/或烟草黑胫病的方法，包括用权利要求1-3中任一所述的长枝木霉的菌悬浮液浇灌烟草植株的步骤；每株烟草植株的用量为（5-10）×10⁵cfu所述长枝木霉。

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