CN103122317A

CN103122317A - 一种长枝木霉菌株及其用途

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Publication number: CN103122317A
Application number: CN2012105216304A
Authority: CN
Inventors: 葛永怡; 李祝; 张传平; 庄培林; 黄化刚; 黄青明; 申燕; 孙希文; 刘阳
Original assignee: Guizhou University; Guizhou Tobacco Co Ltd Bijie Branch
Current assignee: Guizhou University; Guizhou Tobacco Co Ltd Bijie Branch
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: CN103122317B

Abstract

本发明公开了一长枝木霉菌株（Trichoderma longibrachiatum GF-10）及其用途，其形态特征：在PDA上生长迅速，背面无色至黄绿色，在28℃培养72h小时可产生分生孢子，分生孢子梗次级分枝少，常直角伸出；瓶梗直接从次级分枝上伸出，单生，对生、极少轮生，葫芦状或烧瓶型，长5.3～11.6μm，宽2.0～3.2μm，终极瓶梗圆锥状；孢子灰绿或绿色，卵圆形或椭圆形，长3.4～6.6μm，宽2.3～3.5μm。本发明对不良环境的耐受力强，耐突变，容易培养和保存，抑制烟草黑胫病菌及烟草赤星病菌的效果好。

Description

一种长枝木霉菌株及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一长枝木霉菌株，同时还涉及其长枝木霉菌株在抑制烟草黑胫病菌和烟草赤星病菌方面的用途。

背景技术

烟草黑胫病是烟叶生产过程中最为重要的根茎病害，而烟草赤星病是烟叶生产过程重要的叶部病害，二者的防治对烟叶生产尤为重要。

目前，对烟草黑胫病菌和烟草赤星病菌的防治方法很多，有栽培抗病品种、化学防治、作物轮作和生物防治。种植抗病品种是防治两种病害是最为经济有效的方式，但采用抗病品种防治两种病害时，不但要考虑品种抗性水平与稳定性，还需要顾及产量、质量和品种对不同环境的适应能力，这增大了品种选育的难度；其次，以上两种病害常与其它病害混合发病，常导致抗病品种的抗性丧失，从而影响烟草的稳定生产。而化学防治虽可以达到快速防治两种病害的目的，但这种方法成本高，长期反复使用会导致农药残留而污染土壤环境并造成病原菌抗药性的提高，同时农药的施用还会杀死土壤中大量对植物生长有益的微生物，一旦病原菌入侵将造成严重后果。此外，烟草黑胫病侵染期长，化学防治难以长期奏效。而烟草赤星病属叶面病害，施用化学农药后会影响烟叶品质，从而阻碍了烟草的可持续发展。作物轮作是防治两种病害的另一个措施。在烟草生产过程中，采用作物轮作可以避免病原菌积累，在栽培范围内减少病原菌的数量，从而降低病菌对栽培烟草的危害。但采用作物轮作只能在一定程度上对两种病菌进行控制而无法彻底消除。

生物防治是利用拮抗菌与病原菌之间的相互拮抗作用，通过抑制病原菌的生长、孢子的萌发和病菌产生有毒的代谢产物，或是寄生于病原菌、与病原菌进行营养竞争等方式防治病害，因而具有无毒、无害、无残留等优点，对农业的可持续发展具有重要意义，也因此得到了世界各国研究者的广泛关注。但生防真菌在田间应用时，在高温、高湿下不易产孢。并且长枝木霉菌对以上两种病害的生物防治目前还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种对不良环境的耐受力强，耐突变，容易培养和保存，抑制烟草黑胫病菌及烟草赤星病菌效果好的长枝木霉菌株。

本发明的另一目的在于提供该长枝木霉菌株在抑制烟草黑胫病菌和烟草赤星病菌方面的用途。

一种长枝木霉菌GF-10（Trichoderma longibrachiatum GF-10），其形态特征：在PDA上生长迅速，背面无色至黄绿色，在28℃培养72h小时可产生分生孢子，分生孢子梗次级分枝少，常直角伸出；瓶梗直接从次级分枝上伸出，单生，对生、极少轮生，葫芦状或烧瓶型，长5.3～11.6μm，宽2.0～3.2 μm，终极瓶梗圆锥状；孢子灰绿或绿色，卵圆形或椭圆形，长3.4～6.6 μm，宽2.3～3.5 μm。

该菌种已于2012 年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号：CCTCC M 2012383，名称为：长枝木霉GF-10（Trichoderma longibrachiatum GF-10）。

对烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌有抑制作用的长枝木霉菌GF-10（Trichoderma longibrachiatum GF-10）的分离步骤：

（1）拮抗菌的分离与纯化：准确称取采自中国贵州省毕节市黔西县10.0g烟株根系土样，借助无菌操作技术，将土样加入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10min，使土样均匀地分散为稀释液，再吸取1mL土壤稀释液到9mL无菌水中，充分混匀，成为土壤悬液。采用混菌法接种，吸取1mL悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷却到45℃的双抗马丁氏培养基，充分混匀，待凝固后倒置，28℃保温培养5天，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，移入PDA平板上，恒温培养，直至纯化得到单菌落，转移至斜面试管保存。

（2）拮抗菌的筛选

　　先用打孔器（直径0.5cm）在已培养的病原菌菌落（烟草疫霉菌、链格孢菌）上分别打孔，用无菌牙签挑取菌饼分别置于PDA平板中央，使有菌丝的一侧接触培养基，倒置于28℃的恒温培养箱中培养5～7d，用于抗菌作用检测。采用平板对峙法，分别在接有烟草疫霉、链格孢病原菌的PDA平板上，用牙签取待测菌株的菌体，分别点种于距离病原菌约5cm处。使它们位于培养皿的正三角形的3个顶角位子上。倒置于28℃下培养观察，5～7天后观测，在烟草疫霉病原菌的PDA平板上和链格孢病原菌的PDA平板上都有一株真菌产生了很明显的抑菌作用，将此菌株编号为GF-10；

（3）拮抗菌的鉴定：将GF-10菌株接种于PDA平板，其形态特征为：在PDA上生长迅速，背面无色至黄绿色，在28℃培养72h小时可产生分生孢子，分生孢子梗次级分枝少，常直角伸出；瓶梗直接从次级分枝上伸出，单生，对生、极少轮生，葫芦状或烧瓶型，长5.3～11.6μm，宽2.0～3.2 μm，终极瓶梗圆锥状；孢子灰绿或绿色，卵圆形或椭圆形，长3.4～6.6 μm，宽2.3～3.5 μm。

根据Gams&Bissett（1998）关于木霉属的分类标准，该菌株的主要形态特征与他们所描述的长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum ）的标准形态基本相同，因而认为GF-10菌株属于木霉属长枝木霉组的长枝木霉。

另外，将GF-10菌株接种于PDA平板，28℃，培养7天，将培养物（包含有菌丝及孢子）从平板上刮取到试管中，利用CTAB法进行基因组DNA的抽提，然后用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增，通过对PCR产物的测序和序列的比对，进一步确定了该菌属于木霉属长枝木霉组的长枝木霉，记为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum GF-10）。

通过抑菌试验来说明本发明使用的长枝木霉菌株（Trichoderma longibrachiatum GF-10）在抑制烟草黑胫病菌和赤星病菌中的用途：

1）菌种活化

将长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum GF-10）菌种接于PDA斜面（马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000mL，自然pH，121℃，灭菌30min）上，28℃静置培养5天，活化3次，备用；

2）孢子悬液的制备

将活化好的菌株，用含0.05% 吐温80（Toween-80）无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠的装有100 mL无菌水的250 mL三角瓶中，用玻棒搅拌后再在旋涡震荡器上震荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成均匀分布的孢子悬液。

3）发酵培养

以麸皮为基质，初始含水率55%，葡萄糖10%，(NH₄)₂SO₄ 0.5%， KH₂PO₄5%，pH7.0的基质为培养基质，接种量为1×10⁵个/mL的菌株孢子悬液1mL， 28℃，培养7天 ,收集固体发酵菌体及孢子，45℃烘干、备用。

（4）拮抗效果的测定

将GF-10菌种的孢子转接至PDA培养基，活化7天，将烟草疫霉菌菌株的菌丝接种于V8汁培养基，活化7天，用打孔器（直径0.5cm）从长枝木霉菌及烟草疫霉菌的菌落边缘取生长旺盛的菌丝块接种于PDA培养皿，点种点间相距5～7cm，28℃倒置培养7天，长枝木霉菌对烟草疫霉菌产生的抑菌率为91.1%。

将GF-10菌种和链格孢菌菌种的孢子分别转接至PDA培养基，活化7天，用打孔器（直径0.5cm）从长枝木霉菌及链格孢菌的菌落边缘取生长旺盛的菌丝块接种于PDA培养皿，点种点间相距5～7cm，28℃倒置培养5天，长枝木霉菌对链格孢菌产生的抑菌率为92.2%。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明的长枝木霉菌株GF-10对烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌具有较好的防效，均达90%以上。并且，该菌种耐高温、高湿，37℃以上也能生长产孢，克服了在田间应用时所受气候条件影响的限制因素。对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，能维持生态平衡，能适应病害生态系统，而且耐突变，容易培养和保存，在农业方面有很大的应用前景。该技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，实现固体发酵工业化生产长枝木霉菌GF-10（Trichoderma longibrachiatum GF-10），为开发相关生物制剂奠定基础。

具体实施方式

对烟草黑胫病菌、赤星病菌有抑制作用的长枝木霉菌株GF-10的分离步骤：

（1）供试菌株：烟草黑胫病菌——烟草疫霉（Phytophthora nicotianae Gzufp-25）、烟草赤星病菌——链格孢（Aiternaria alternate Gzufc-18）分离于毕节市，保存于贵州大学生命科学院真菌资源研究所。

（2）拮抗菌的分离与纯化：准确称取采自贵州省毕节市黔西县的10.0g烟株根系土样，借助无菌操作技术，将土样加入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10min，使土样均匀地分散为稀释液，再吸取1mL土壤稀释液到9mL无菌水中，充分混匀，成为土壤悬液。采用混菌法接种，吸取1mL悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷却到45℃的双抗马丁氏培养基，充分混匀，待凝固后倒置，28°C保温培养5天，挑取真培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，移入PDA平板上，恒温培养，直至纯化得到单菌落，转移至斜面试管保存。

（3）拮抗菌的筛选：先用打孔器（直径0.5cm）在培养的病原菌菌落（烟草疫霉、链格孢）上分别打孔，用无菌牙签挑取菌饼分别置于PDA平板中央，使有菌丝的一侧接触培养基，倒置于28℃的恒温培养箱中培养5～7d，用于抗菌作用检测。采用平板对峙法，分别在接有烟草疫霉、链格孢病原菌的PDA平板上，用牙签取待测菌株的菌体，分别点种于距离病原菌约5cm处。使它们位于培养皿的正三角形的角顶点上。倒置于28℃下培养观察， 7天后观测，发现有一株真菌同时对烟草疫霉菌和链格孢菌产生了很明显的抑菌作用，命名为GF-10。

通过对抑菌试验来说明本发明的长枝木霉菌株（Trichoderma longibrachiatum GF-10）的抑制烟草黑胫病菌和赤星病菌的用途：

（1）菌种活化

将GF-10菌种接于PDA斜面（马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000mL，pH自然，121℃，灭菌30min）上，27℃静置培养5天，活化3次，备用。

（2）孢子悬液的制备

将活化好的GF-10菌株，用含0.05% 吐温80（Toween-80）无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠的装有100 mL无菌水的250 mL三角瓶中，用玻棒搅拌后再在旋涡震荡器上震荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成均匀的孢子悬液。

（3）发酵培养

以麸皮为基质，初始含水率55%，葡萄糖10%，(NH₄)₂SO₄ 0.5%， KH₂PO₄5%，pH7.0，接种量为1×10⁵个/mL的菌株孢子悬液1mL，28℃，培养7天，收集固体发酵菌体及孢子，45℃烘干、备用。

（4）拮抗效果的测定

将GF-10菌种的孢子转接至PDA培养基，活化7天，将烟草疫霉菌菌株菌丝接种于V8汁培养基（10mL V8加去离子水90 mL，CaCO₃ 0.02g，琼脂2g，pH自然，121℃，灭菌30min），活化7天，用打孔器（直径0.5cm）从长枝木霉菌及烟草疫霉菌的菌落边缘取生长旺盛的菌丝块接种于PDA培养皿，点种点间相距5～7cm，28℃倒置培养7天，长枝木霉菌对烟草疫霉菌产生的抑菌率为91.1%。

将GF-10菌种和链格孢菌菌种的孢子转接至PDA培养基，活化7天，用打孔器（直径0.5cm）从长枝木霉菌及链格孢菌的菌落边缘取生长旺盛的菌丝块接种于PDA培养皿，点种点间相距5～7cm，28℃倒置培养120h，长枝木霉菌对链格孢菌产生的抑菌率为92.2%。

Claims

1. 一长枝木霉菌GF-10（Trichoderma longibrachiatum GF-10），其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCC M 2012383。

2.如权利要求1所述的长枝木霉菌GF-10在抑制烟草黑胫病菌菌和烟草赤星病菌菌方面的用途。