CN112409100A - 一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥及其制备方法。该微生物有机功能肥由如下重量份组分组成：牛粪20‑50份，羊粪20‑50份，甘蔗渣10‑30份，粉碎秸秆10‑30份，泥炭土10‑30份，复合微生物菌剂发酵液1‑5份。所述微生物菌剂包括来源于红树林土壤的解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M 2020497)和枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)。通过使用上述微生物有机功能肥，可有效预防南姜、山东大姜根腐病、姜瘟病、根结线虫病等的发生，病死率由40％以上降低至5％以下，同时，姜的产量提高了30％以上。

Description

一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥及其制备方法
技术领域
本发明涉及有机肥领域，特别涉及一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥及其制备方法。
背景技术
生姜属于姜科姜属多年生单子叶的草本植物。生姜不仅是我们日常的调味品，而且还具有极高的药用价值，可用来治疗盗汗，胃痛，咳嗽，中毒等病症。同时还具有极高的营养价值，富含蛋白质、脂肪、纤维素、胡萝卜素等物质；另外还有报道指出生姜提取物不仅可以抑制肿瘤突变生长，还能预防胆结石以及延缓衰老。
近几年来，随着人类对于生姜需求量的提升，生姜种植规模也逐步扩大。但是，生姜重茬种植后土壤传播病害严重，成为了制约生姜产业发展的关键因素。比较常见的生姜土传病害主要是由病原性细菌引起的姜瘟病、病原性真菌引起的根腐病以及由病原性细菌和真菌共同引起的枯萎病。发病严重时可导致大面积种植地甚至全部田地的生姜枯萎而死造成颗粒无收。这种情况严重影响了生姜的产量与质量。
姜根腐病主要是由群结腐霉引起的，而枯萎病的主要致病性真菌是腐皮镰孢。目前对于姜土传病害的防治方法主要是物理防治、化学防治和生物防治。但物理和化学防治效果甚微，难以扭转疾病转播的严重情况，且带来大量的污染问题。而生物防治可以采取有益的拮抗菌来抑制病原菌的繁殖与生长，达到控制病菌传播的效果，既可以减少化肥、农药的使用量，又可以有效的改良土壤板结的状况，有利于生姜生产绿色、可持续发展的要求。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥，由如下重量份组分组成：牛粪20-50份，羊粪20-50份，甘蔗渣10-30份，粉碎秸秆10-30份，泥炭土10-30份，复合微生物菌剂发酵液1-5份。
相对于现有技术，本发明利用微生物有机功能肥，可以防治姜腐霉根腐病、枯萎病、姜瘟病等土传病害导致死棵现象的发生。
进一步，所述复合微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M2020497)和枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)。
通过使用上述复合微生物菌剂发酵液，对牛粪、羊粪、甘蔗渣、秸秆、泥炭土进行发酵处理，形成复合微生物有机功能肥，不仅能预防姜土传病害的发生，还可以为姜的生长提供营养需求。上述两种菌的发酵液，对姜土传病害的群结腐霉、腐皮镰孢菌等具有拮抗作用，应用该微生物菌剂制备的微生物有机功能肥，可达到抑制土壤中病原菌的繁殖，减少植物土传病害发生的作用；此外，复合微生物有机功能肥有机质丰富，通过根部施肥的方法，还可以调节植物根系生态环境，平衡土壤pH值、改善土壤团粒结构、改良土壤，极大的提高土壤肥效，促进作物生长、成熟。
进一步，所述复合微生物菌剂中的解淀粉芽孢杆菌B86(CCTCC M 2020497)，分离自广东阳江海陵岛红树林沉积物，对姜土传病害的致病菌群结腐霉、腐皮镰孢菌具有显著的抑制作用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在生长过程中可分泌包括纤维素酶在内的多种生物酶，有效促进纤维素的分解和利用，此外，枯草芽孢杆菌分泌的代谢物可有效的抑制病原菌的生长或溶解病原菌，以致杀死病菌。
进一步，所述防治姜土传病害的微生物有机功能肥，由如下重量份组分组成：牛粪30份，羊粪20份，甘蔗渣10份，粉碎秸秆10份，泥炭土10份，复合微生物菌剂发酵液5份，所述复合微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M 2020497)和枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)，按照培养液体积1：1的比例混合制成。
本发明还提供了一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥的制备方法，包括如下步骤：
S1复合微生物菌剂发酵液的制备：采用两种以上的微生物菌株，分别对各菌株进行发酵使每种菌株发酵液活菌数在5亿以上，获得发酵培养液，将各培养液按照1：1的体积比例混合，获得复合微生物菌剂发酵液，所述混合微生物菌剂发酵液活菌数在2亿以上；
S2微生物有机功能肥的制备：按照重量份数，将20-50份牛粪、20-50份羊粪、10-30份甘蔗渣、10-30份粉碎秸秆、10-30份泥炭土混匀，将1-5份复合微生物菌剂稀释10-100倍，均匀喷施到混匀的物料上，并翻堆混匀，发酵5-10天，每天早晚各翻堆一次。
相对于现有技术，本发明所述的微生物有机功能肥制备方法中解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的发酵时间较短，只需要15-24小时，发酵密度较大。将其对牛粪、羊粪、甘蔗渣、秸秆、泥炭土进行发酵后，可制备出有机质丰富、微生物均衡、具有预防病原菌功能的微生物有机功能肥。
进一步，步骤S1中，所述微生物菌株包括解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCCM2020497)和枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)，分别用LB液体培养基培养，按照一级种子、二级种子、发酵放大的三级培养步骤，37℃下培养15-24h，使发酵液活菌数在5亿以上，获得发酵培养液，将两种培养液按照1：1的体积比例混合，获得复合微生物菌剂发酵液，混合微生物菌剂发酵液活菌数在2亿以上。
本发明还提供了上述的防治姜土传病害的微生物有机功能肥在防治姜的土传病害以及改善土壤方面的应用。
相对于现有技术，本发明将复合微生物菌剂施用在姜植株上，可以抑制土壤中病原菌的繁殖，减少植物土传病害的发生。同时，还可以改良土壤，平衡土壤pH值、提高土壤蓄水、蓄能和地温，缓解重茬障碍。本发明所述的微生物有机功能肥能促进姜植株的生长，增强姜的抗病性，提高姜的产量和品质。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86培养24h后的菌落形态图；
图2本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86与解淀粉芽孢杆菌Bacillusdecolorationis KMGL1309-AS2的16SrRNA序列比对图；
图3为本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86对腐皮镰孢菌和群结腐霉的抑制效果图；其中，A图为腐皮镰孢对照组，B图为B86对腐皮镰孢菌的抑制效果，C图为群结腐霉对照组，D图为B86对群结腐霉的抑制效果。
具体实施方式
本发明提供一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥，按照重量份比例，由以下组分组成：牛粪20-50份，羊粪20-50份，甘蔗渣10-30份，粉碎秸秆10-30份，泥炭土10-30份，复合微生物菌剂发酵液1-5份；所述复合微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCCM 2020497)、枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)分别进行液态发酵获得培养液后，按照各培养液体积1：1的比例混合制成。其中，解淀粉芽孢杆菌B86分离自广东阳江海陵岛红树林沉积物，已于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020497。枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)可从广东省微生物菌种保藏中心购得，其为革兰氏阳性菌，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
优选的，按照重量份比例，所述微生物有机功能肥牛粪30份，羊粪20份，甘蔗渣10份，粉碎秸秆10份，泥炭土10份，复合微生物菌剂发酵液5份。
下面通过具体实施例进一步说明。
实施例一：一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥的制备方法
本实施例提供一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥的制备方法，包括如下步骤：
S1：复合微生物菌剂发酵液的制备
解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M 2020497)、枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)、分别用LB培养基培养，按照一级种子、二级种子、发酵放大的三级培养步骤，培养温度37℃，培养时间15-24h，发酵液活菌数5亿以上；各菌株分别进行发酵后获得发酵培养液，将各培养液按照1：1的体积比例混合，获得复合微生物菌剂发酵液，混合微生物菌剂发酵液活菌数2亿以上。
S2：微生物有机功能肥的制备
按照重量份数，将牛粪30份，羊粪20份，甘蔗渣10份，粉碎秸秆10份，泥炭土10份混匀，将5份上述微生物菌剂稀释50倍，均匀喷施到混匀的物料上，并翻堆混匀，发酵5-10天，每天早晚各翻堆一次。即得到可用于防治姜土传病害的微生物有机功能肥。
实施例二：解淀粉芽孢杆菌B86的分离、纯化及鉴定
(1)本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86的分离纯化方法，步骤如下：
S1：称取10g的土壤样品，所述土壤样品来自广东省海陵岛红树林国家湿地公园；然后，于超净工作台中，向土壤样品中添加90ml无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100ul土壤悬液到900ul无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液，整个过程在超净工作台中进行。
S2：取100ul的10倍稀释液、102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液分别涂布于2216E琼脂固体培养板上，然后将培养板置于培养箱28℃恒温培养2～3天，培养板上长出菌斑。
S3：培养结束后，根据菌落生长情况从适当稀释梯度平板一一挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，分离出本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86。
S4：从2216E挑取已纯化培养的菌株，接种于内含200ml 2216E液体培养基的500ml锥形瓶中，在37℃，180rpm恒温摇床培养条件下培养32h，制得种子液。
所述2216E琼脂固体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、琼脂15份、无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入20ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。
所述2216E液体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
(2)本发明所述解淀粉芽孢杆菌B86的培养方法
S1接种：将实施例一所得的种子液以2×106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml权利要求4所述解淀粉芽孢杆菌B86液体培养基的1000ml锥形瓶中；
S2培养：将接种有所述解淀粉芽孢杆菌B86的培养基，于28℃，180rpm恒温摇床条件下培养48h，制得本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86菌液。
由于本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86在自身的生长过程中，一方面会与病原菌竞争营养物质，并且和病原菌竞争植物表面的结合位点，从而降低病原菌的致病能力；另一方面，本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86能够分泌出抗菌物质，通过抗菌的物质来抑制病原菌生长，从而达到生物防治的作用。
所述的解淀粉芽孢杆菌B86的LB培养基配制方法：氯化钠7份、胰蛋白胨10份、酵母粉5份，无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后调整pH到7.5±0.5，然后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
(3)本发明所述解淀粉芽孢杆菌B86的16S rRNA序列扩增及测序
S1：基因组DNA的提取
采用Omega Bacterial DNA Kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA。首先，取实施例一中所述的种子液2ml于无菌的2ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清保留沉淀；然后，向沉淀中加入100ul 1×TE Buffer，涡旋混匀，加入10ul溶菌酶混匀，37℃温浴10min；加入100ul BTL Buffer和20ul蛋白酶K，混匀，55℃温浴1h，中间振荡混匀三次；加入5ulRNaseA酶，混匀，室温静置5min后，10000rpm离心2min，取200ul上清液转移至新的无菌的1.5ml离心管中；加入200ul BTL Buffer，混匀，置于65℃温浴10min；加入200ul无水乙醇，涡旋混匀，将样品全部转移至吸附柱中，10000rpm离心2min，弃上清和吸附柱，将吸附柱放入新的收集管中；向吸附柱中加入500ul HBC Buffer，10000rpm离心2min，弃上清；向吸附柱上加入700ul DNA Wash Buffer，10000rpm离心2min，弃上清，重复两次；将空的吸附柱重新放入收集管中，10000rpm离心2min；向吸附柱中加入用30ul～50ul Elution Buffer(已于65℃预热)溶解DNA沉淀，即得到基因组DNA，-20℃保存备用。
S2：PCR扩增16SrRNA序列
以步骤S1所得基因组DNA为模板，Eubac27F和Eubac1492R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系(50μl)如下：
Figure BDA0002788111730000061
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸的过程反复循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
所述上游引物Eubac27F的序列为：5-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3
所述下游引物Eubac1492R的序列为：5-GGTTACCTTG TTACGACTT-3
S3：PCR产物进行核酸电泳
取5ul步骤S2所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳25min。电泳结果如附图2所示，以本发明所述的解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA为模板扩增出的16SrRNA片段条带单一且亮度高，且16SrRNA序列长度约为1500bp。
S4：16SrRNA序列进行测序
步骤S2所得的PCR产物经纯化回收后，取30ul纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示本发明所述解淀粉芽孢杆菌的16SrRNA序列长度为1453bp，具体序列如下所示：
Figure BDA0002788111730000071
(4)本发明所述解淀粉芽孢杆菌16SrRNA序列的比对及鉴定
将实施例三所得的本发明所述解淀粉芽孢杆菌B86的16SrRNA序列输入NCBI中，与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BA17的16SrRNA序列进行比对，比对结果如附图2所示，本发明所述解淀粉芽孢杆菌的16SrRNA序列与的16SrRNA序列同源性为99％，但并不完全相同，两者之间存在3个碱基的差异。进一步看出，本发明所得的菌株在分类上属于解淀粉芽孢杆菌，且为解淀粉芽孢杆菌的一个新的菌种，命名为Bacillusamyloliquefaciens B86。
实施例三：本发明所述解淀粉芽孢杆菌B86对群结腐霉和腐皮镰孢菌的抑制作用
S1接种：将实施例二所得的种子液以106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml LB液体培养基的1000ml锥形瓶中；
S2培养：将接种有所述解淀粉芽孢杆菌B86的培养基，于37℃，180rpm恒温摇床条件下培养24h，制得本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86菌液；
S3病原菌的培养：将保存于4℃冰箱中的接种有群结腐霉和腐皮镰孢菌的NA斜面培养基取出，用灭菌后的接种环挑取菌丝于新的NA培养基上，28℃培养，活化24h；
S4解淀粉芽孢杆菌对病原菌的抑制作用：采用平板对峙生长法，将新鲜培养的病原真菌菌饼(直径0.8cm)接种于空白PDA平板上(PDA平板直径9cm)，在距离菌柄2cm处，点接5uL解淀粉芽孢杆菌B86发酵液，以点接5uL无菌水作为对照，置于28℃恒温培养箱中5～7d，观察病原真菌菌饼生长情况。实验结果如附图3所示，解淀粉芽孢杆菌B86对群结腐霉和腐皮镰孢菌的分别为83％和81.6％，抑制效果良好。
实施例四：微生物有机功能肥的大姜种植田间试验
大姜田间种植试验在位于山东省青岛市平度市的前楼镇巡栈村进行，该地块连续5年种植大姜，为大姜重茬地块，土壤传播病害和根结线虫严重，上一年度收获前姜的病死率50％以上。
(1)空白对照组：未使用基肥，直接在田间种植。0.5亩为1组，设三个重复，共1.5亩。
(2)实验处理组(微生物有机功能肥)：以微生物有机功能肥做基肥，用量1000kg/亩。0.5亩为1组，设三个重复，共1.5亩。
(3)阳性对照组(普通有机肥)：以未加微生物菌剂发酵的普通有机肥做基肥，用量1000kg/亩。0.5亩为1组，设三个重复，共1.5亩。
定植后三组实验处理相同：按照常规进行灌溉处理，定植1个月、2个月、3个月后均冲施常规水溶肥。收获前调查姜的死颗率、发病率，收获后计算产量，重复三次取平均值，实验结果如表1所示。
表1大姜种植试验统计表
Figure BDA0002788111730000091
由表1的结果可以看出，施用本发明所述的微生物有机功能肥实验组与使用普通有机肥组比较，能有效的降低了重茬种植导致的大姜发病率和死棵率，产量提高了37％。表明本发明所述的复合微生物有机功能肥应用于姜的种植，可有效防止重茬导致的发病及死颗问题，由于发病率低，从而降低了农药的使用量。具有很大的应用价值和经济及社会效益。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0002788111730000101
Figure BDA0002788111730000111
序 列 表
<110> 广东唯新生物科技有限公司，深圳市唯新生物科技有限公司
<120> 一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥及其制备方法
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明所述的解淀粉芽孢杆菌B86的16SrRNA序列
<400> 1
ACACTCTCTG TCACTTCGGC GGCTGGCTCC TAAAGGTTAC CTCACCGACT TCGGGTGTTA 60CAAACTCTCG TGGTGTGACG GGCGGTGTGT ACAAGGCCCG GGAACGTATT CACCGCGGCA 120TGCTGATCCG CGATTACTAG CGATTCCAGC TTCACGCAGT CGAGTTGCAG ACTGCGATCC 180GAACTGAGAA CAGATTTGTG GGATTGGCTT AACCTCGCGG TTTCGCTGCC CTTTGTTCTG 240TCCATTGTAG CACGTGTGTA GCCCAGGTCA TAAGGGGCAT GATGATTTGA CGTCATCCCC 300ACCTTCCTCC GGTTTGTCAC CGGCAGTCAC CTTAGAGTGC CCAACTGAAT GCTGGCAACT 360AAGATCAAGG GTTGCGCTCG TTGCGGGACT TAACCCAACA TCTCACGACA CGAGCTGACG 420ACAACCATGC ACCACCTGTC ACTCTGCCCC CGAAGGGGAC GTCCTATCTC TAGGATTGTC 480AGAGGATGTC AAGACCTGGT AAGGTTCTTC GCGTTGCTTC GAATTAAACC ACATGCTCCA 540CCGCTTGTGC GGGCCCCCGT CAATTCCTTT GAGTTTCAGT CTTGCGACCG TACTCCCCAG 600GCGGAGTGCT TAATGCGTTA GCTGCAGCAC TAAGGGGCGG AAACCCCCTA ACACTTAGCA 660CTCATCGTTT ACGGCGTGGA CTACCAGGGT ATCTAATCCT GTTCGCTCCC CACGCTTTCG 720CTCCTCAGCG TCAGTTACAG ACCAGAGAGT CGCCTTCGCC ACTGGTGTTC CTCCACATCT 780CTACGCATTT CACCGCTACA CGTGGAATTC CACTCTCCTC TTCTGCACTC AAGTTCCCCA 840GTTTCCAATG ACCCTCCCCG GTTGAGCCGG GGGCTTTCAC ATCAGACTTA AGAAACCGCC 900TGCGAGCCCT TTACGCCCAA TAATTCCGGA CAACGCTTGC CACCTACGTA TTACCGCGGC 960TGCTGGCACG TAGTTAGCCG TGGCTTTCTG GTTAGGTACC GTCAAGGTGC CGCCCTATTT 1020GAACGGCACT TGTTCTTCCC TAACAACAGA GCTTTACGAT CCGAAAACCT TCATCACTCA 1080CGCGGCGTTG CTCCGTCAGA CTTTCGTCCA TTGCGGAAGA TTCCCTACTG CTGCCTCCCG 1140TAGGAGTCTG GGCCGTGTCT CAGTCCCAGT GTGGCCGATC ACCCTCTCAG GTCGGCTACG 1200CATCGTCGCC TTGGTGAGCC GTTACCTCAC CAACTAGCTA ATGCGCCGCG GGTCCATCTG 1260TAAGTGGTAG CCGAAGCCAC CTTTTATGTC TGAACCATGC GGTTCAGACA ACCATCCGGT 1320ATTAGCCCCG GTTTCCCGGA GTTATCCCAG TCTTACAGGC AGGTTACCCA CGTGTTACTC 1380ACCCGTCCGC CGCTAACATC AGGGAGCAAG CTCCCATCTG TCCGCTCGAC TGCATTATAG 1440ACCCGCCTCC AAT 1453
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物Eubac27F
<400> 2
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物Eubac1492R
<400> 3
GGTTACCTTG TTACGACTT 19

Claims (7)

1.一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥，其特征在于，由如下重量份组分组成：牛粪20-50份，羊粪20-50份，甘蔗渣10-30份，粉碎秸秆10-30份，泥炭土10-30份，复合微生物菌剂发酵液1-5份。
2.根据权利要求1所述的一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥，其特征在于：所述复合微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M 2020497)和枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)。
3.根据权利要求2所述的一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥，其特征在于：复合微生物物菌剂中的解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M 2020497)，分离自广东阳江海陵岛红树林沉积物，对姜土传病害的致病菌群结腐霉、腐皮镰孢菌具有显著的抑制作用。
4.根据权利要求1所述的一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥，其特征在于，由如下重量份组分组成：牛粪30份，羊粪20份，甘蔗渣10份，粉碎秸秆10份，泥炭土10份，复合微生物菌剂发酵液5份，所述复合微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M2020497)和枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)，按照培养液体积1：1的比例混合制成。
5.如权利要求1所述的一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1复合微生物菌剂发酵液的制备：采用两种以上的微生物菌株，分别对各菌株进行发酵，使每种菌株发酵液活菌数在5亿以上，获得发酵培养液，将各培养液按照1：1的体积比例混合，获得复合微生物菌剂发酵液，所述混合微生物菌剂发酵液活菌数在2亿以上；
S2微生物有机功能肥的制备：按照重量份数，将20-50份牛粪、20-50份羊粪、10-30份甘蔗渣、10-30份粉碎秸秆、10-30份泥炭土混匀，将1-5份复合微生物菌剂稀释10-100倍，均匀喷施到混匀的物料上，并翻堆混匀，发酵5-10天，每天早晚各翻堆一次。
6.根据权利要求5所述的一种防治姜土传病害的微生物有机功能肥的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述微生物菌株包括解淀粉芽孢杆菌B86(保藏编号CCTCC M 2020497)和枯草芽孢杆菌(GDMCC 1.372)，分别用LB液体培养基培养，按照一级种子、二级种子、发酵放大的三级培养步骤，37℃下培养15-24h，使发酵液活菌数在5亿以上，获得发酵培养液，将两种培养液按照1：1的体积比例混合，获得复合微生物菌剂发酵液，混合微生物菌剂发酵液活菌数在2亿以上。
7.如权利要求1所述的防治姜土传病害的微生物有机功能肥在防治姜的土传病害以及改善土壤方面的应用。
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