CN104846043B - 一种从发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺，包括：放线菌桔橙指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085菌株发酵结束后，极性有机溶剂浸提菌丝体；浸提液浓缩后过大孔吸附树脂柱，收集含有非达霉素的解析液；解析液浓缩后用有机溶剂萃取；萃取液浓缩后经正向柱层析，得到非达霉素粗品；该粗品经高压制备液相色谱设备，用含水的极性溶剂作为流动相、并添加酸或酸性盐调节pH，收集含有高纯度非达霉素的流出液；该洗脱液过聚苯乙烯微球树脂柱；洗脱液浓缩、萃取、萃取液干燥后浓缩，真空干燥，得白色粉末状非达霉素纯品。通过本发明分离提纯工艺，非达霉素的提取纯度较高，收率高；因此既适用于实验室研发，又适用于工业化大生产。

Description

一种从发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺

技术领域

本发明属于微生物制药领域，具体涉及一种从发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺。

背景技术

台勾霉素是由放线菌桔橙指孢囊菌NRRL 18085产生的一系列18元大环内酯类抗生素的总称；目前根据取代基的具体结构定义了6种(台勾霉素A-F)。台勾霉素B(Tiacumicin B)，也称为非达霉素(Fidaxomicin)，其分子式为C₅₂H₇₄Cl₂O₁₈。

非达霉素具有抗革兰氏阳性菌的活性，尤其是针对艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、产气夹膜梭菌(C.perfringens)和肠球菌的抗菌效果显著，同时还有抗肿瘤活性，对革兰氏阴性菌的抗菌效果极弱。对于艰难梭菌感染，目前的标准治疗方法为甲硝唑和万古霉素，而采用非达霉素治疗的最大优势是降低了45%的复发率。

现有技术中，非达霉素主要通过发酵法制备：

中国专利CN103320355A公开了一种产生非达霉素的野生游动放线菌菌株，该菌株分离自采集自云南的仙鹤草样品；并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏名称为游动放线菌(Actinoplanes sp.)N12WO3O4；保藏编号为CGMCC No.7043。将该游动放线菌菌株发酵后，用有机溶剂对菌丝体进行浸提、将所得浸提液浓缩去除有机溶剂得浓缩液，上样至大孔树脂，经梯度洗脱、萃取、蒸干得非达霉素粗品。该非达霉素粗品经Daisogel-C18 30×250mm10um制备柱，收集，减压浓缩蒸干得非达霉素精品，含量97%，总收率60%。该专利方法的主要特征是：采用游动放线菌(Actinoplanes sp.)N12WO3O4进行发酵，再将得到的含有非达霉素的菌丝体浸提液通过大孔树脂和C18 30×250mm10um制备柱，得到含量为97%的非达霉素精品。

中国专利CN103275152A公开了一种从非达霉素发酵菌丝体中分离纯化非达霉素的工艺：采用保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.7043的游动放线菌(Actinoplanes sp.)N12WO3O4进行发酵；所得发酵液过滤、浸提，浸提液用水稀释后通过大孔脱色树脂脱色后、所得脱色液通过大孔吸附树脂后吸附、梯度解析，所得解析液经浓缩、萃取、干燥后得非达霉素粗品。然后将非达霉素粗品用极性有机溶剂溶解，注入聚合物微球柱进行柱层析分离，得到非达霉素，纯度95%，总收率45%。该专利方法的主要特征是：采用游动放线菌(Actinoplanes sp.)N12WO3O4进行发酵，再将得到的含有非达霉素的菌丝体浸提液通过大孔脱色树脂进行脱色以及大孔吸附树脂进行吸附、解析，得到非达霉素。

中国专利CN102993251A公开了一种纯化非达霉素粗品的柱层析方法；通过从该专利文本的附图2可得知该非达霉素粗品的纯度大致为75-80%；纯化层析柱中采用Uni30BPC树脂作为填料，Uni30BPC为吡咯烷酮与苯乙烯共聚体的聚合物微球，流动相为乙腈/水(水溶液含0.1%甲酸)，分段收集。非达霉素粗品(纯度75-80%)经此纯化后纯度达98%，收率为89%。该专利方法的特征是仅仅限于已经有较高纯度的粗品的后期精制纯化。此外，由于填料成本较高，仍然不利于工业化大生产。

综上，对于通过发酵法制备非达霉素，从具有复杂组分的发酵菌丝体中分离纯化得到高纯度的非达霉素仍然是一个亟待解决的难题。

发明内容

本发明提供了一种从放线菌桔橙指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacumhamdenensis亚种NRRL18085发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺，该工艺包括：发酵结束后，极性有机溶剂浸提菌丝体；浸提液浓缩后过大孔吸附树脂柱，收集含有非达霉素的解析液；解析液浓缩后用有机溶剂萃取；萃取液浓缩后经正向柱层析，得到非达霉素粗品；该粗品经高压制备液相色谱设备，用含水的极性溶剂作为流动相、并添加酸或酸性盐调节pH，收集含有高纯度非达霉素的流出液；该洗脱液过聚苯乙烯微球树脂柱；洗脱液浓缩、萃取、萃取液干燥后浓缩，真空干燥，得白色粉末状非达霉素纯品。

具体地，本发明工艺包含以下步骤：

a.将放线菌桔橙指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085菌株发酵，发酵结束后，用极性有机溶剂浸提菌丝体得浸提液；

b.步骤a得到的浸提液浓缩后上样至大孔吸附树脂柱，以有机溶剂和水的混合溶剂梯度洗脱，收集含有非达霉素的解析液；

c.步骤b得到的解析液浓缩去除水后用有机溶剂萃取，萃取液用干燥剂干燥后，减压浓缩得浓缩物；

d.步骤c得到的浓缩物过正相柱，梯度洗脱，收集含非达霉素的洗脱液，减压浓缩后得到非达霉素粗品；

e.步骤d得到的粗品经高压制备液相色谱设备，用含水的极性溶剂作为流动相、并添加酸或酸性盐调节pH，收集含有高纯度非达霉素的流出液；

f.步骤e得到的流出液加水降低有机溶剂含量、过聚苯乙烯微球树脂柱，先用水将步骤e得到流出液中调节pH的酸或酸性盐冲洗去除后、再用极性溶剂洗脱，收集含高纯度的非达霉素洗脱液，浓缩后、用乙酸乙酯萃取、萃取液干燥后浓缩，真空干燥，得白色粉末状非达霉素纯品。

在步骤a中，所用极性有机溶剂选自C1-C3醇或C3-C4酮。

在步骤b中，所述的大孔树脂为非极性、弱极性、中等极性大孔树脂；所用洗脱溶剂中的有机溶剂选自C1-C3的醇或C3-C4的酮，含量为0-90%。

在步骤c中，萃取用有机溶剂选自乙酸乙酯或氯仿。

在步骤d中，所述正向柱填料选自硅胶或氧化铝；所用洗脱溶剂为丙酮/非极性溶剂的混合溶剂，其中所述非极性溶剂包括石油醚或C6-C12烷烃。

在步骤e中，所述高压制备液相色谱柱填料为非极性、弱极性或中等极性，所述洗脱用的极性溶剂选自乙腈、甲醇或乙醇，所述酸或酸性盐选自H₃PO₄、NaH₂PO₄、NaHSO₄、CH₃COOH或CF₃COOH。

在步骤f中，所得的非达霉素纯度在96%以上。

在一种优选实施方式中，步骤a中，所用极性有机溶剂优选丙酮、甲醇、乙醇或丙醇；更优选丙酮或甲醇。

在一种优选实施方式中，步骤b中，所述的大孔树脂的型号选自X-5、AB-8、SP825、HP-20、D101或ADS-17；更优选X-5、AB-8或D101。

步骤b中，所述洗脱液中的有机溶剂优选丙酮或甲醇。

在一种优选实施方式中，步骤c中，所述萃取用有机溶剂优选乙酸乙酯。

在一种优选实施方式中，步骤d中，所述正向柱填料优选氧化铝。

在一种优选实施方式中，步骤e中，所述高压制备液相色谱柱填料优选硅胶键合碳十八硅烷(简称为C18)，流动相优选乙腈和0.1%磷酸水溶液48:52至57:43；流动相更优选乙腈和0.1%磷酸水溶液53:47至57:43。

在一种优选实施方式中，步骤f中，所述聚合物树脂优选聚苯乙烯微球PS-NM100或聚苯乙烯微球PS25-300。

在一种优选实施方式中，步骤f中，所述向步骤e收集的含非达霉素流出液加水的量为收集液体积的1-3倍。

根据本发明方法可有效地将非达霉素从Dactylosporangium aurantiacumhamdenensis亚种NRRL18085发酵液中分离出来，其中非达霉素纯度可达到96%，收率75%左右。与现有技术相比较，采用Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085菌株进行发酵，可有效产生非达霉素；且通过本发明分离提纯工艺，非达霉素的提取纯度较高，收率高；因此既适用于实验室研发，又适用于工业化大生产。

以下实施例仅仅是进一步阐明本发明，并无将本发明局限于该具体实施例的意图。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。

附图说明

图1显示为本发明实施例1的步骤d所得非达霉素粗品的HPLC纯度。HPLC色谱条件为：色谱柱为C18柱，1.5*200mm,3μ，检测波长为230nm，洗脱溶剂为乙腈:0.1%磷酸水溶液55：45；非达霉素保留时间9.1min，根据面积归一化计算纯度为52.6%。

图2显示为本发明实施例1的步骤g所得非达霉素精品的HPLC纯度。HPLC色谱条件为：色谱柱为C18柱，1.5*200mm,3μ，检测波长为230nm，洗脱溶剂为乙腈:0.1%磷酸水溶液56：44；非达霉素保留时间8.3min，根据面积归一化计算纯度为96.8%。

具体实施方式

在本实施方式中，非达霉素发酵液的获得按如下方式进行：

菌种：Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085；购买自美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)

将经过生产能力验证、生长良好的菌种Dactylosporangium aurantiacumhamdenensis亚种NRRL18085，以脱脂牛奶作为保护剂，用真空冷冻的方式保存。使用时将菌种转接到平板培养基，28℃培养6天，然后分离纯化1次，将合格菌种转接到斜面培养基，28℃培养6天，保存于4℃冰箱，7天内随时可作为发酵培养菌种。发酵种子培养条件30℃，摇瓶培养时间4天，转速为240r/min，种子罐的培养时间随种子罐的大小而变，以种子质量为最终控制标准。在发酵过程中，培养条件为30℃，调控溶氧、搅拌转速、通气量等参数，并补加葡萄糖、蛋白胨和水。当发酵液中的非达霉素效价不再有明显上升趋势、其他发酵参数表现发酵已接近终结阶段时就可以放罐，发酵时间一般为8天左右。

以上工作中所用培养基配方，具体如下：斜面、平板培养基(g/L)：葡萄糖10g，酵母膏10g，麦芽膏10g，琼脂16g，pH7.0-7.2；种子培养基配方(g/L)：葡萄糖1g，可溶性淀粉24g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，CaCO₃ 4g，pH5.0左右；发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖50g，蛋白胨4g，酵母提取物1g，牛肉浸膏4g，黄豆粉10g，NaCl0.3g，CaCO₃ 5g，pH5.5-6。

以下实施例中从发酵液中分离和纯化非达霉素的收率是根据分离纯化得到的目标产物纯品的量占由发酵产生的非达霉素总量的比率得出。

实施例1

Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085发酵液2.8L，加入2.8L丙酮，浸泡过夜，真空抽滤得滤液。所得滤液减压降低丙酮含量，过X-5大孔吸附树脂，以丙酮水溶液梯度洗脱(0%，20%，30%，50%，60%)，流速约6ml/min，收集洗脱液。通过枯草检测板，将含活性产物的洗脱液减压浓缩去除丙酮，以等体积乙酸乙酯萃取2次，得有机相用无水硫酸钠干燥，减压去除乙酸乙酯。过正相硅胶柱，以丙酮：环己烷梯度洗脱(3:6-3:4)，流出液用TLC板检测，收集目标产物洗脱液300ml。减压去除丙酮和环己烷，过高压制备液相，以乙腈溶解样品，以乙腈和0.1%磷酸水溶液(53:47)为流动相，进样体积250μl，流速20ml/min，检测波长为230nm，HPLC全程检测，分段收集。含有非达霉素的收集液用等体积纯净水稀释，过聚苯乙烯微球PS25-300吸附树脂，用水冲净磷酸后用丙酮洗脱，减压去除丙酮，用乙酸乙酯萃取，所得萃取液用无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯得到固体，真空干燥得白色粉末状非达霉素，纯度96.8%，收率约60.7%。

实施例2

Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085发酵液2.8L，加入2.8L甲醇，浸泡过夜，真空抽滤得滤液。所得滤液减压降低甲醇含量，过AB-8大孔吸附树脂，以甲醇水溶液梯度洗脱(0%，20%，30%，50%，60%，70%，80%)，流速约6ml/min，收集洗脱液。通过枯草检测板，将含活性产物的洗脱液减压浓缩去除甲醇，以等体积乙酸乙酯萃取2次，得有机相用无水硫酸钠干燥，减压去除乙酸乙酯。过正相氧化铝柱，以丙酮：环己烷梯度洗脱(3:8-3:5)，流出液用TLC板检测，收集目标产物洗脱液360ml。减压去除丙酮和环己烷，过高压制备液相，以乙腈溶解样品，以乙腈和0.1%磷酸水溶液(56:44)为流动相，进样体积250μl，流速20ml/min，检测波长为230nm，HPLC全程检测，分段收集。含有非达霉素的收集液用等体积纯净水稀释，过聚苯乙烯微球PS25-300吸附树脂，用水冲净磷酸后用丙酮洗脱，减压去除丙酮，用乙酸乙酯萃取，所得萃取液用无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯得到固体，真空干燥得白色粉末状非达霉素，纯度96.3%，收率约73.1%。

实施例3

Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085发酵液2.8L，加入3.5L丙酮，浸泡过夜，真空抽滤得滤液。所得滤液减压降低丙酮含量，过AB-8大孔吸附树脂，以丙酮水溶液梯度洗脱(0%，20%，30%，50%，60%)，流速约6ml/min，收集洗脱液。通过枯草检测板，将含活性产物的洗脱液减压浓缩去除丙酮，以等体积乙酸乙酯萃取2次，得有机相用无水硫酸钠干燥，减压去除乙酸乙酯。过正相氧化铝柱，以丙酮：环己烷梯度洗脱(3:8-3:5)，流出液用TLC板检测，收集目标产物洗脱液280ml。减压去除丙酮和环己烷，过高压制备液相，以乙腈溶解样品，以乙腈和0.1%磷酸水溶液(54:46)为流动相，进样体积250μl，流速20ml/min，检测波长为230nm，HPLC全程检测，分段收集。含有非达霉素的收集液用等体积纯净水稀释，过聚苯乙烯微球PS-NM100吸附树脂，用水冲净磷酸后用丙酮洗脱，减压去除丙酮，用乙酸乙酯萃取，所得萃取液用无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯得到固体，真空干燥得白色粉末状非达霉素，纯度96.4%，收率约74.8%。

实施例4

Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL18085发酵液2.8L，加入3.5L丙酮，浸泡过夜，真空抽滤得滤液。所得滤液减压降低丙酮含量，过D101大孔吸附树脂，以甲醇水溶液梯度洗脱(0%，20%，30%，50%，60%，80%)，流速约6ml/min，收集洗脱液。通过枯草检测板，将含活性产物的洗脱液减压浓缩去除甲醇，以等体积乙酸乙酯萃取2次，得有机相用无水硫酸钠干燥，减压去除乙酸乙酯。过正相氧化铝柱，以丙酮：环己烷梯度洗脱(3:10-3:5)，流出液用TLC板检测，收集目标产物洗脱液300ml。减压去除丙酮和环己烷，过高压制备液相，以乙腈溶解样品，以乙腈和0.1%磷酸水溶液(54:46)为流动相，进样体积250μl，流速20ml/min，检测波长为230nm，HPLC全程检测，分段收集。含有非达霉素的收集液用等体积纯净水稀释，过聚苯乙烯微球PS-NM100吸附树脂，用水冲净磷酸后用丙酮洗脱，减压去除丙酮，用乙酸乙酯萃取，所得萃取液用无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯得到固体，真空干燥得白色粉末状非达霉素，纯度97.2%，收率约73.2%。

Claims (11)

1.一种从发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺，包括以下步骤：a.将放线菌桔橙指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum hamdenensis亚种NRRL 18085菌株发酵，发酵结束后，用极性有机溶剂浸提菌丝体得浸提液；

b.步骤a得到的浸提液浓缩后上样至大孔吸附树脂柱，以有机溶剂和水的混合溶剂梯度洗脱，收集含有非达霉素的解析液；

c.步骤b得到的解析液浓缩去除水后用有机溶剂萃取，萃取液用干燥剂干燥后，减压浓缩得浓缩物；

d.步骤c得到的浓缩物过正相柱，梯度洗脱，收集含非达霉素的洗脱液，减压浓缩后得到非达霉素粗品；

e.步骤d得到的粗品经高压制备液相色谱设备，用含水的极性溶剂作为流动相、并添加酸或酸性盐调节pH，收集含有高纯度非达霉素的流出液；

f.步骤e得到的流出液加水降低有机溶剂含量、过聚苯乙烯微球树脂柱，先用水将步骤e得到流出液中调节pH的酸或酸性盐冲洗去除后、再用极性溶剂洗脱，收集含高纯度的非达霉素洗脱液，浓缩后、用乙酸乙酯萃取、萃取液干燥后浓缩，真空干燥，得白色粉末状非达霉素纯品；其中：

在步骤a中，所用极性有机溶剂选自丙酮、丙醇或甲醇；

在步骤b中，所述的大孔树脂为非极性、弱极性、中等极性大孔树脂；所用洗脱溶剂中的有机溶剂选自C1-C3醇或C3-C4酮，含量为0、20、30、50、60％或0、20、30、50、60、80％；

在步骤c中，萃取用有机溶剂选自乙酸乙酯或氯仿；

在步骤d中，所述正相柱填料选自硅胶或氧化铝；所用洗脱溶剂为丙酮/非极性溶剂的混合溶剂，其中所述非极性溶剂包括石油醚或C6--C12烷烃；

在步骤e中，所述高压制备液相色谱柱填料为非极性、弱极性或中等极性，所述洗脱用的极性溶剂选自乙腈、甲醇或乙醇，所述酸或酸性盐选自H₃PO₄、NaH₂PO₄、NaHSO₄或CH₃COOH；

在步骤f中，所得的非达霉素纯度在96％以上。

2.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤a中，所用极性有机溶剂为丙酮。

3.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤b中，所述的大孔树脂的型号选自X-5、AB-8、SP825、HP-20、D101或ADS-17。

4.根据权利要求3所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤b中，所述的大孔树脂的型号选自X-5、AB-8或D101。

5.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤b中，所用洗脱溶剂中的有机溶剂选自丙酮或甲醇。

6.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤c中，所述萃取用有机溶剂为乙酸乙酯。

7.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤d中，所述正相柱填料为氧化铝。

8.根据权利要求l所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤e中，所述高压制备液相色谱柱填料为硅胶键合碳十八硅烷，流动相为乙腈和0.1％磷酸水溶液48:52至57:43。

9.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤e中，所述流动相为乙腈和0.1％磷酸水溶液53:47至57:43。

10.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中在步骤f中，所述聚苯乙烯微球树脂柱为聚苯乙烯微球PS-NM100或聚苯乙烯微球PS25-300。

11.根据权利要求1所述分离和纯化非达霉素的工艺，其中步骤f中，所述向步骤e收集的含非达霉素流出液加水的量为收集液体积的1-3倍。