CN105441518A - 提高多杀菌素产量的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高多杀菌素产量的发酵方法，其是通过向刺糖多胞菌(Saccharopolyspora？spinosa)的发酵培养基中添加大孔树脂，并在发酵过程中补加全脂奶粉，从而提高多杀菌素的产量。在发酵培养基中添加大孔树脂可以有效快速地降低多杀菌素浓度，减弱代谢产物阻遏现象，并且在发酵过程中通过补料全脂奶粉，有利于菌体继续生长和产物合成，可进一步提高多杀菌素的产量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种提高多杀菌素产量的发酵方法。
背景技术
多杀菌素，是刺糖多孢菌有氧发酵产生的次级代谢产物，属于大环内酯类化合物，其商业化产品中有效的活性组分为多杀菌素A(85％-90％)和多杀菌素D(10％-15％)。多杀菌素没有抑菌活性，却有很好的杀虫活性，对鳞翅目和缨翅目害虫有较广的杀虫谱，对双翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类有很好的防治作用，在防治鳞翅目害虫上，多杀菌素是现有杀虫剂中选择性最高的化合物之一，其活性与氯氰菊酯相当。多杀菌素具有高杀虫活性的同时，对非靶标生物则表现出低毒，它对哺乳动物、鸟类和有益昆虫毒性较低，对水生动物只有轻微的毒性，而且对哺乳动物无致癌、致畸、致突变或神经毒性的作用。多杀菌素在环境中通过多种组合途径降解，主要为光降解和微生物降解，降解产物为对环境无害的碳、氢、氧、氮等自然组分，且降解周期短，在土壤中多杀菌素光降解的半衰期为9-10天，在水中多杀菌素光降解的半衰期则小于1天，在叶面上多杀菌素光降解的半衰期是1.6-16天。与一般杀虫剂相比，多杀菌素具有见效快、无副作用、选择性高、对天敌安全、半衰期短、易降解、不易产生药物抗性等优点，是理想的高效低毒绿色农药，是治理抗性害虫的首选替代农药新品种。
目前在我国，多杀菌素还未实现工业化生产，主要原因是发酵产量偏低，不能满足工业化要求。在微生物发酵过程中，代谢产物的大量积累一般会抑制菌体的生长和目标产物的继续合成，这种现象叫做代谢产物阻遏，在多杀菌素生产的过程中，如果能降低产物浓度，削弱这种产物抑制作用，将成为提高多杀菌素产量的一个突破要点。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高多杀菌素产量的发酵方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种提高多杀菌素产量的发酵方法，其是向刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)的发酵培养基中添加大孔树脂，并在发酵过程中补加全脂奶粉，从而提高多杀菌素的产量。
本发明中涉及的刺糖多胞菌为刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68，该菌已在ZL201110224366.3中公开。
前述的方法，所述发酵培养基中含有如下组分：大豆粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30-50g/L、玉米浆15-20g/L、碳酸钙4-6g/L和大孔树脂5-15g/L(优选10g/L)，以水配制。所述大豆粉是将粉碎后的大豆过20-400目筛后应用于培养基。
优选地，所述发酵培养基中还包括棉籽饼粉10-20g/L和/或酵母浸粉1-5g/L和/或豆油4-6g/L。
本发明中使用的大孔树脂型号为D1300，比表面积550-600m2/g，平均孔径6nm。
前述的方法，发酵的条件为：培养温度26-30℃，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为168-216hr。
优选地，发酵的条件为：培养温度28℃，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为192hr。
前述的方法，发酵开始后第120hr内，第一次补加全脂奶粉至终浓度5-20g/L，优选15g/L。
前述的方法，发酵开始后第120-192hr内，第二次补加全脂奶粉至终浓度5-20g/L，优选5g/L。
优选地，发酵开始后第96hr，第一次补加全脂奶粉至终浓度15g/L，发酵开始后第144hr，第二次补加全脂奶粉至终浓度5g/L。
多杀菌素的发酵产量为发酵液中多杀菌素产量与收集的大孔树脂洗脱下的多杀菌素的产量之和。
发酵液中多杀菌素含量分析：
1)取发酵液1ml，加入9ml甲醇溶液，摇匀；
2)超声波震荡20min，静止10min，使固液分层；
3)取上层有机相，以0.45μm有机滤膜进行过滤；
4)过滤后有机相作为供试液通过高效液相色谱仪进行效价检测；
5)高效液相色谱条件：150×4.6mm(id)，5μm，不锈钢C18反相色谱柱；柱温35℃，流速1.0mL/min，以甲醇∶乙腈∶水(体积比为9∶10∶1)为流动相进行分离，进样量20μl，利用紫外检测器在246nm波长下进行检测。
大孔树脂洗脱液中多杀菌素含量分析：
发酵结束后，将大孔树脂装柱，用90％甲醇洗脱至多杀菌素未检测出为止，将甲醇洗脱液用0.45μm有机滤膜进行过滤，然后采用高效液相色谱仪进行效价检测，检测操作同上述步骤1)～5)。
同等发酵条件下，多杀菌素的产量为：未添加大孔树脂和未补料全脂奶粉，产量达13.44-15.10g/L；添加大孔树脂10g/L且未补料全脂奶粉，产量达17.82-18.94g/L；添加大孔树脂10g/L且补料全脂奶粉，产量达22.42-24.50g/L。
本发明具有以下优点：
在利用刺糖多胞菌发酵生产多杀菌素中，大孔树脂作为一类具有吸附功能的高分子聚合物，对多杀菌素有很好的吸附作用。在发酵培养基中添加大孔树脂可以有效快速地降低多杀菌素浓度，减弱代谢产物阻遏现象，有利于菌体继续生长和产物合成，提高多杀菌素终产量。
在发酵过程中补料全脂奶粉，脂类物质在多杀菌素的合成过程中不仅可以提供能量，还可作为前体，其对抗生素的合成可以起到促进作用。全脂奶粉的主要营养成分为蛋白质25.5％、脂肪26.5％和碳水化合物37.3％，全脂奶粉含有脂类物质的同时还提供了丰富的C、N源，有利于菌体继续生长和产物合成，从而进一步提高多杀菌素的产量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的大孔树脂型号为D1300，比表面积550-600m2/g，平均孔径6nm。
实施例1提高多杀菌素产量的发酵方法
利用刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68发酵生产多杀菌素，使用的发酵培养基为：玉米淀粉30g/L，葡萄糖40g/L，玉米浆18g/L，棉籽饼粉15g/L，酵母浸粉3g/L，大豆粉(过400目筛)20g/L，碳酸钙5g/L，豆油5g/L和大孔树脂10g/L，以水配制。
应用上述培养基，在330吨发酵罐中按如下条件进行发酵：培养温度28℃，搅拌转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期192hr。发酵开始后第96hr，第一次补加全脂奶粉至终浓度15g/L，发酵开始后第144hr，第二次补加全脂奶粉至终浓度5g/L。
发酵192小时后得多杀霉素发酵液，按如下方法提取制备并检测多杀霉素：
发酵液中多杀菌素含量分析：
1)取发酵液1ml，加入9ml甲醇溶液，摇匀；
2)超声波震荡20min，静止10min，使固液分层；
3)取上层有机相，以0.45μm有机滤膜进行过滤；
4)过滤后有机相作为供试液通过高效液相色谱仪进行效价检测；
5)高效液相色谱条件：150×4.6mm(id)，5μm，不锈钢C18反相色谱柱；柱温35℃，流速1.0mL/min，以甲醇∶乙腈∶水(体积比为9∶10∶1)为流动相进行分离，进样量20μl，利用紫外检测器在246nm波长下进行检测。
大孔树脂洗脱液中多杀菌素含量分析：
发酵结束后，离心收集吸附有多杀菌素的大孔树脂，将大孔树脂装柱，用90％甲醇洗脱至多杀菌素未检测出为止，将甲醇洗脱液用0.45μm有机滤膜进行过滤，然后采用高效液相色谱仪进行效价检测，检测操作同上述步骤1)～5)。
使用本实施例中的培养基配方和发酵条件，得到多杀霉素产量为24.47g/L，进行330吨罐发酵时，每罐批原材料成本为28.2435万元(含大孔树脂8万元，可重复使用)。
实施例2提高多杀菌素产量的发酵方法
利用刺糖多胞菌Z68发酵生产多杀菌素，使用的发酵培养基为：玉米淀粉20g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆15g/L，棉籽饼粉10g/L，酵母浸粉1g/L，大豆粉(过400目筛)5g/L，碳酸钙4g/L，豆油4g/L和大孔树脂5g/L，以水配制。
应用上述培养基，在330吨发酵罐中按如下条件进行发酵：培养温度26℃，搅拌转速150rpm，通气比1:0.3，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期168hr。发酵开始后第96hr，第一次补加全脂奶粉至终浓度5g/L，发酵开始后第144hr，第二次补加全脂奶粉至终浓度5g/L。
发酵168小时后得多杀霉素发酵液，按实施例1的方法提取制备并检测多杀霉素。使用本实施例中的培养基配方和发酵条件，得到多杀霉素产量为22.42g/L，进行330吨罐发酵时，每罐批原材料成本为15.5675万元(含大孔树脂4万元，可重复使用)。
实施例3提高多杀菌素产量的发酵方法
利用刺糖多胞菌Z68发酵生产多杀菌素，使用的发酵培养基为：玉米淀粉40g/L，葡萄糖50g/L，玉米浆20g/L，棉籽饼粉20g/L，酵母浸粉5g/L，大豆粉(过400目筛)30g/L，碳酸钙6g/L，豆油6g/L和大孔树脂15g/L，以水配制。
应用上述培养基，在330吨发酵罐中按如下条件进行发酵：培养温度30℃，搅拌转速220rpm，通气比1:0.7，罐压0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期216hr。发酵开始后第96hr，第一次补加全脂奶粉至终浓度20g/L，发酵开始后第144hr，第二次补加全脂奶粉至终浓度15g/L。
发酵216小时后得多杀霉素发酵液，按实施例1的方法提取制备并检测多杀霉素。使用本实施例中的培养基配方和发酵条件，得到多杀霉素产量为24.37g/L，进行330吨罐发酵时，每罐批原材料成本为41.6650万元(含大孔树脂12万元，可重复使用)。
对比例
在与实施例1同等的发酵条件下：未添加大孔树脂和未补料全脂奶粉，多杀菌素的产量为13.44-15.10g/L；添加大孔树脂10g/L且未补料全脂奶粉，产量为17.82-18.94g/L。可见，通过向发酵培养基中添加大孔树脂和后期补料添加全脂奶粉，大大提高了多杀菌素的最终产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种提高多杀菌素产量的发酵方法，其特征在于，其是向刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)的发酵培养基中添加大孔树脂，并在发酵过程中补加全脂奶粉，从而提高多杀菌素的产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺糖多胞菌为刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有如下组分：大豆粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30-50g/L、玉米浆15-20g/L、碳酸钙4-6g/L和大孔树脂5-15g/L，以水配制。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中还包括棉籽饼粉10-20g/L和/或酵母浸粉1-5g/L和/或豆油4-6g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大孔树脂型号为D1300，比表面积550-600m2/g，平均孔径6nm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵的条件为：培养温度26-30℃，转速150-220rpm，通气比1:0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为168-216hr。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵的条件为：培养温度28℃，转速200rpm，通气比1:0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为192hr。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵开始后第120hr内，第一次补加全脂奶粉至终浓度5-20g/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵开始后第120-192hr内，第二次补加全脂奶粉至终浓度5-20g/L。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，发酵开始后第96hr，第一次补加全脂奶粉至终浓度15g/L，发酵开始后第144hr，第二次补加全脂奶粉至终浓度5g/L。
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