CN102286579A

CN102286579A - 制备多杀霉素的方法及其所使用的培养基

Info

Publication number: CN102286579A
Application number: CN2011102243663A
Authority: CN
Inventors: 徐兵; 周贤龙; 晋玉宽; 汪爱群
Original assignee: MUDANJIANG BAIJIAXIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Jiamusi Heilong pesticide Co., Ltd
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2011-08-05
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-08-05
Also published as: CN102286579B

Abstract

本发明公开了一种利用刺糖多胞菌发酵制备多杀霉素的方法，其中发酵所用的培养基中含有大豆粉。本发明还公开了制备多杀霉素的培养基。本发明直接利用全大豆粉进行刺糖多胞菌发酵，既为发酵提供了必要的营养成分，又有效节省了大豆加工过程的成本。

Description

制备多杀霉素的方法及其所使用的培养基

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体涉及制备多杀霉素的方法及其所使用的培养基。

背景技术

多杀霉素(Spinosad)是一种具有触杀及摄食毒性的新型微生物源杀虫剂，其优点为对害虫广谱高效，对人、非靶标动物和环境极为安全，且可生物降解，因此在美国被授予“总统绿色化学品挑战奖”。多杀霉素的作用方式是通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹，同时也作用于γ-氨基丁酸受体，这有可能进一步提高了其杀虫活性。迄今为止，尚未发现能以相同的作用方式影响昆虫神经系统的类似产品，而且尚无有关多杀霉素交叉抗性的报道。

多杀霉素属广谱杀虫剂，能有效地控制鳞翅目、双翅目和缨翅目的害虫，可以很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类。多杀霉素对鳞翅目幼虫的活性显著高于各种有机磷、氨基甲酸酯杀虫剂，与拟除虫菊酯相当。多杀霉素具有高杀虫活性的同时，对捕食性昆虫还表现出较低的毒性，对鳞翅目昆虫而言，多杀霉素是已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。此外，多杀霉素对蓟马、虱、白蚁以及许多膜翅目害虫也有较好的效果。

根据中国农药毒性分级标准，多杀霉素属低毒杀虫剂。它对哺乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是轻微的中等毒性。因此，它是进行害虫综合治理的首选。

多杀霉素是由刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的一种次生代谢物质。根据刺糖多胞菌的生长特性，在发酵过程中，需要利用玉米淀粉、葡萄糖作为碳源，使用豆粕粉、棉籽饼粉、玉米浆等作为氮源，同时几种有机氮源可以为微生物的生长提供各种氨基酸以满足菌体生长需要，另外需提供少量植物脂肪作为发酵碳源。

在发酵过程中，原材料成本约占总成本的50％。通过改变原材料成分及使用量来降低生产升本的策略，在发酵领域具有非常重要的意义。大豆中含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪及其它多种有机酸，而豆粕粉是大豆经过有机溶剂浸出油脂后的残余物。在这一过程中，先将油脂分离出去，在发酵过程中再次外源加入，造成巨大的能量浪费。

因此，需要一种在满足发酵条件的同时，又能节约成本制备多杀霉素的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何实现在满足发酵条件的同时，节约制备多杀霉素的成本。

本发明提供一种利用刺糖多胞菌发酵制备多杀霉素的方法，其中，发酵所用的培养基中含有大豆粉。所用刺糖多胞菌可以为刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，保藏编号为CGMCC No.3460。

所述大豆粉在培养基中所占的重量百分比为0.1-3％；优选的重量百分比为0.5-2.5％；更优选的重量百分比为1.5-2％。

优选地，将大豆粉碎后直接应用于培养基；更优选地，将粉碎后的大豆过20-400目筛后应用于培养基。

本发明制备多杀霉素时的发酵条件为：培养温度26-30℃，转速150-220rpm，通气比1∶0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为168-216hr。

优选地，所述发酵的条件为：培养温度28℃，转速200rpm，通气比1∶0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为192hr。

本发明制备多杀霉素时所用的培养基含有如下重量百分比的组分：大豆粉0.5-3％、玉米淀粉2-4％、葡萄糖3-5％、玉米浆1.5-2％、碳酸钙0.4-0.6％，余量为水。

优选地，所述培养基还包括如下重量百分比的棉籽饼粉1-2％和/或酵母浸粉0.1-0.5％和/或豆油0.4-0.6％。

本发明还提供一种制备多杀霉素的培养基，其含有如下重量百分比的组分：大豆粉0.5-3％、玉米淀粉2-4％、葡萄糖3-5％、玉米浆1.5-2％、碳酸钙0.4-0.6％。

优选地，该培养基还包括如下重量百分比的棉籽饼粉1-2％和/或酵母浸粉0.1-0.5％和/或豆油0.4-0.6％。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种新型的制备多杀霉素的方法，特点在于其使用全大豆粉替代培养基中蛋白质及脂肪，以使培养基中的氮或脂肪全部或部分源自大豆粉。并且根据培养基中碳源、氮源、无机盐等成分的不同配比，使用不同比例的大豆粉，使其营养均衡。在不影响发酵产量的情况下，显著降低了发酵成本。通过直接利用全大豆粉，既为发酵提供了必要的营养成分，又有效节省了大豆加工过程所产生的成本，在工业化大生产中具有相当可观的经济效益。

附图说明

图1为多杀霉素标准品的高效液相色谱图。

图2为多杀霉素供试液的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明使用菌种刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期2009年11月25日，保藏编号CGMCCNo.3460。该菌株在正常培养条件下发酵单位为14g/L。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均为商业获得。

实施例1

大豆粉含量为2％的培养基配比、成本计算及营养成分见表1。

表1

应用上述培养基(大豆粉过400目筛)，在330吨发酵罐中按如下条件进行发酵：培养温度28℃，搅拌转速200rpm，通气比1∶0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期192hr。

发酵192小时后得多杀霉素发酵液，按如下方法提取制备并检测多杀霉素：

1)取发酵液1ml，加入9ml甲醇溶液，摇匀；

2)超声波震荡20min，静止10min，使固液分层；

3)取上层有机相，以0.45um5径有机滤膜进行过滤；

4)过滤后有机相作为供试液通过高效液相色谱仪进行效价检测；

5)高效液相色谱条件：150×4.6mm(id)，5μm，不锈钢C18反相色谱柱；柱温35℃，流速1.0mL/min，以甲醇∶乙腈∶水(体积比为45∶50∶5)为流动相进行分离，进样量20μl，利用紫外检测器在246nm波长下进行检测。

在此色谱条件下多杀霉素标准品高效液相色谱图见图1。供试液高效液相色谱图见图2。根据保留时间计算各组分峰面积值，通过峰面积计算各组分产量。

使用本实施例中的培养基配方和发酵条件，得到多杀霉素产量为14.7g/L，进行330吨罐发酵时，每罐批原材料成本为11.9425万元。

实施例2

大豆粉含量为2.5％的培养基配比、成本计算及营养成分见表2。

表2

应用上述培养基(大豆粉过200目筛)，在330吨发酵罐中按如下条件进行发酵：培养温度26℃，搅拌转速200rpm，通气比1∶0.3，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期168hr。

发酵168小时后得多杀霉素发酵液，按照实施例1的方法检测多杀霉素。结果得到多杀霉素产量为13.58g/L，进行330吨罐发酵，每罐批原材料成本为10.5775万元。

实施例3

大豆粉含量为0.5％的培养基配比、成本计算及营养成分见表3。

表3

应用上述培养基(大豆粉过100目筛)，在330吨发酵罐中按如下条件进行发酵：培养温度30℃，搅拌转速220rpm，通气比1∶0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期192hr。

发酵192小时后得多杀霉素发酵液，按照实施例1的方法检测多杀霉素。结果得到多杀霉素产量为13.86g/L，进行330吨罐发酵，每罐批原材料成本为12.9525万元。

实施例4

大豆粉含量为3％的培养基配比、成本计算及营养成分见表4。

表4

应用上述培养基(大豆粉过20目筛)，在330吨发酵罐中按如下条件进行发酵：培养温度28℃，搅拌转速200rpm，通气比1∶0.7，罐压0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期216hr。

发酵216小时后得多杀霉素发酵液，按照实施例1的方法检测多杀霉素。结果得到多杀霉素产量为13.95g/L，进行330吨罐发酵，每罐批原材料成本为10.0425万元。

对比例1

以豆粕粉代替本发明的大豆粉，发酵制备多杀霉素的培养基配比、成本计算及营养成分见表5。

表5

应用上述培养基，在330吨发酵罐中按实施例1的条件进行发酵。得到的发酵液按照实施例1中的方法进行提取检测，该条件下多杀霉素的产量为14g/L。

本对比例中，装料系数按照330吨发酵罐的75％进行配料，每罐批基础料为250吨，其中有效成分淀粉7.5吨，葡萄糖10吨，豆粕粉3.75吨，玉米浆3.75吨，棉籽饼粉2.5吨，酵母浸粉1.25吨，豆油1.25吨，碳酸钙1.25吨。根据目前市场情况，各种原材料价格为：玉米淀粉3000元/吨，葡萄糖4600元/吨，豆粕粉5200元/吨，玉米浆180元/吨，棉籽饼粉6900元/吨，酵母浸粉38000元/吨，豆油9000元/吨，碳酸钙1000元/吨。

按照以上数据进行统计，每330吨罐批原材料成本为16.5925万元。

将实施例1-4与对比例1进行比较可知：

实施例1中多杀霉素产量为14.7g/L，是对比例1的105％，使用相应培养基配方进行330吨罐发酵，每罐批原材料成本为11.9425万元，节约成本4.65万元，成本降低28％。

实施例2中多杀霉素产量为13.58g/L，是对比例1的97％，使用相应培养基配方进行330吨罐发酵，每罐批原材料成本为10.5775万元，节约成本6.015万元，成本降低36.3％。

实施例3中多杀霉素产量为13.86g/L，是对比例1的99％，使用相应培养基配方进行330吨罐发酵，每罐批原材料成本为12.9525万元，节约成本3.64万元，成本降低21.9％。

实施例4中多杀霉素产量为13.95g/L，是对比例1的99.6％，使用相应培养基配方进行330吨罐发酵，每罐批原材料成本为10.0425万元，节约成本6.55万元，成本降低39.5％。

在上述实施例1-4的多杀霉素发酵过程中，按照对比例1中各种营养成分配比进行碳氮源折算，在保证各种营养成分的配比基本一致的前提下，本发明在发酵培养基中采用大豆粉能得到显著节约生产成本，能使成本降低21.9％-39.5％。

而且，原配方中的发酵产量为14g/L，三个实施例中使用大豆粉替代后的培养基的发酵产量平均值为14.03g/L，没有影响发酵产量，另外，在培养基配方中不含有棉籽饼粉和/或酵母浸粉和/或豆油的情况下(实施例2和4)，意外地发现，多杀霉素的产量也基本未受影响，但发酵成本却因此降低36.3％-39.5％。这不仅大大节约了生产成本，而且提高了产品在市场中的竞争能力。因此，本发明在工业化大生产中具有极大的经济效益。

Claims

1.一种利用刺糖多胞菌发酵制备多杀霉素的方法，其特征在于，发酵所用的培养基中含有大豆粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺糖多胞菌为刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，CGMCC No.3460。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将大豆粉碎后直接应用于培养基，且大豆粉在培养基中所占的重量百分比为0.1-3％。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将粉碎后的大豆过20-400目筛后应用于培养基。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：培养温度26-30℃，转速150-220rpm，通气比1∶0.3-0.7，罐压0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为168-216hr。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：培养温度28℃，转速200rpm，通气比1∶0.5，罐压0.03MPa，溶氧控制在40％以上，发酵周期为192hr。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基含有如下重量百分比的组分：大豆粉0.5-3％、玉米淀粉2-4％、葡萄糖3-5％、玉米浆1.5-2％、碳酸钙0.4-0.6％。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基还包括如下重量百分比的棉籽饼粉1-2％和/或酵母浸粉0.1-0.5％和/或豆油0.4-0.6％。

9.一种制备多杀霉素的培养基，其含有如下重量百分比的组分：大豆粉0.5-3％、玉米淀粉2-4％、葡萄糖3-5％、玉米浆1.5-2％、碳酸钙0.4-0.6％。

10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，其还包括如下重量百分比的棉籽饼粉1-2％和/或酵母浸粉0.1-0.5％和/或豆油0.4-0.6％。