CN101906124A

CN101906124A - 一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺

Info

Publication number: CN101906124A
Application number: CN2010101599854A
Authority: CN
Inventors: 夏立秋; 丁学知; 余子全; 杨尉; 伍维
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: CN101906124B

Abstract

一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其包括以下步骤：(1)发酵液预处理；(2)加入高介电常数极性有机溶剂浸泡提取多杀菌素，进行固液分离，收集浸提清液；(3)通过真空浓缩，挥发除去高介电常数极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；(4)加入低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载有机相；(5)负载有机相中加入酸水进行反萃取，收集反萃取相；(6)挥发除去反萃取相中残留的萃取溶媒，用NaOH溶液调节pH值=8.5~11.5，使多杀菌素沉淀，过滤，用稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1~3次，真空干燥，即得到多杀菌素粉剂。本发明总收率可达80%以上，具有收率高、质量好、成本低、易于工业化等优点。

Description

一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中提取抗生素的工艺，特别是涉及一种从刺糖多孢菌发酵液中利用萃取—反萃取方法提取多杀菌素的工艺。

背景技术

多杀菌素(spinosad，spinosyns)又名刺糖菌素、多杀霉素，是自土壤样品中分离的放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的次级代谢产物，属大环内酯类抗生素，分子结构中含有一个二十二元内酯环、一个鼠李糖及一个福乐糖胺，在水中溶解度很小，易溶于醇类、酯类等多种极性、非极性有机溶剂。经有氧发酵后刺糖多孢菌发酵液中主要含有多杀菌素A(85~90%)、D(10~15%)两种杀虫活性成分，同时还会含有少量B、C、E、F、H、J、K、L等多种结构类似组分。多杀菌素对磷翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)等多种农业害虫均有很强的毒杀作用，其选择毒性远高于其他常用的化学农药、生物农药，显著高于DDT、氯氰菊酯和阿维菌素，而对哺乳类、鱼类、两栖类等的毒性极低，具有毒力高、杀虫谱广、非靶标毒性低、对环境安全等优点，已广泛应用于棉花、茶叶、蔬菜等多种农作物及果树害虫防治。目前，含多杀菌素的农药产品由美国陶氏农业科学公司生产。我国有48%悬浮液(商品名：Tracer，催杀)和2.5%悬浮液(商品名：Success，菜喜)两种产品销售，分别应用于小菜蛾和棉铃虫等害虫的防治。

多杀菌素的杀虫作用机制新颖独特。研究表明，其主要是作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAchR)和γ-氨基丁酸受体(gamma-aminobutyric acid receptor, GABAR)，导致虫体神经细胞超活化以及非功能性的肌肉收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹，迄今没有发现与其他杀虫剂有交叉抗性。

作为一种高效绿色生物农药，多杀菌素的应用前景非常广阔。但是，关于多杀菌素制备工艺的研究，尚没有形成高效、高得率的工业生产技术，在多杀菌素提取制备、纯化方法等方面的研究也极少。

美国专利U.S.P 5227295公开了一种从刺糖多孢菌发酵液中分离多杀菌素（文中称为A83543）的方法：向发酵液中加入等体积的丙酮并充分浸取，过滤后，滤液用NaOH溶液调pH至13，然后上HP-20ss吸附树脂，以甲醇:乙腈＝1:1(含0.1%乙酸钠)溶液0%~95%梯度洗脱多杀菌素A和D组分，利用HPLC进行跟踪检测，并分段收集洗脱液，将多杀菌素洗脱液浓缩后将其用石油醚稀释，稀释液上硅胶层析柱，用石油醚和甲醇梯度洗脱，利用HPLC跟踪检测，分段收集洗脱液，分别得到多杀菌素A和D的洗脱液。中国专利CN 101560231公开了一种大孔树脂吸附提取工艺：低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附，五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质，然后分别用20、10、1倍柱体积的浓度为40%、60%、80%，pH分别为7.0、9.0、7.0的丙酮水溶液洗脱吸附柱，最后用100%丙酮进行洗脱，合并洗脱效价较高的收集单元，进一步精制得到了多杀菌素粗制品，提取总收率达到70.1%，产品纯度为97%。另据国内文献报道，胡西洲等和王琨等也分别对大孔树脂吸附提取工艺进行了初步的研究：胡西洲等选择XAD-4大孔树脂作为吸附材料提取多杀菌素，pH=11，流速1/6 (L/min)，2 %氯化钠条件下，采用丙酮梯度解吸，总收率达到64.7%；王琨等用DM 11树脂吸附提取多杀菌素，最佳吸附pH 9.5，上柱流速6BV/h，丙酮解吸流速1.5BV/h，回收率较高，达到85.8%。

虽然树脂吸附提取法在一定程度上有较好的效果，如纯度较高，但是，大孔树脂吸附提取工艺目前存在吸附量小、解吸附困难、处理量小、对设备要求高、工序多、耗时长、成本较高等缺陷，难以适应大规模工业化生产的要求。

目前，现有技术中，还没有一种收率高、纯度好，且成本低、操作简便、便于工业化生产的多杀菌素提取工艺。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种收率高，产品纯度好，且制造成本低，操作简便，便于工业化生产的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素工艺。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：其包括以下步骤：（1）发酵液预处理：发酵结束后放罐前，加入3~5 mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH=8.0~11.0，然后将发酵液加热升温至60~80℃，保温并以300-800 r/min（优选400-600 r/min）速度搅拌处理30~60 min；（2）浸泡提取：预处理后的发酵液冷却至室温后，按发酵液与极性有机溶剂体积比=1:0.5~2（优选1:1.5）加入高介电常数极性有机溶剂，在10~40℃（优选20-30℃）条件下浸泡、搅拌提取4~20小时（优选10-15小时），得到多杀菌素浸提液；多杀菌素浸提液用固液分离技术处理，弃去菌体固形物沉淀，收集浸提清液；（3）将浸提清液转入旋转蒸发仪或真空浓缩罐中，在40~50℃条件下，通过真空浓缩，将发酵液中的高介电常数极性溶剂挥发除去，得到多杀菌素浓缩液；（4）在多杀菌素浓缩液中加入低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，萃取条件为：萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:1~5（优选1:2.5），温度20~45℃（优选30℃），pH=7.0~11.0（优选10.0），萃取时间3~10min（优选8 min）；萃取完成分层后，收集负载有机相；（5）负载有机相中加入酸水进行反萃取，反萃取条件为：负载有机相与酸水体积比=1~5:1（优选2.5:1），酸水浓度0.1~0.4 mol/L（优选0.15 mol/L），温度10~30℃（优选18℃），反萃取时间1~5 min（优选2 min），反萃取级数为1~5；反萃取分相完成后收集反萃取相，空载有机相回收重复利用；（6）用真空浓缩法或吹气法除去反萃取相中残留的萃取溶媒，用 NaOH溶液调节pH值=8.5~11.5（优选10.0），使多杀菌素以结晶形式沉淀，过滤，用pH=9.0~11.0的稀碱溶液将多杀菌素沉淀洗涤1~3次，真空干燥，即得到多杀菌素粉剂。

所述第（2）步，所述高介电常数极性溶剂是选自甲醇、丙酮、乙醇、乙腈中的一种或二种以上，优选甲醇。所述固液分离技术可为公知固液分离方法如板框过滤、离心过滤、重力离心等方法中的任何一种。

所述第（4）步，所述低介电常数萃取溶媒是选自乙酸丁酯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、正己烷、石油醚、甲苯、二甲苯中的一种，优选乙酸丁酯；所述高碳醇萃取溶媒是选自正辛醇、异辛醇、仲辛醇中的一种，优选正辛醇。

所述第（5）步，所述反萃取用酸水是选自酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、盐酸的水溶液中的一种，优选草酸水溶液。

本发明采用萃取与反萃取相结合的技术路线，所需设备发展相对成熟，很容易实现工业化生产。

本发明工艺与大孔树脂吸附提取工艺及色谱柱分离纯化工艺相比，提取收率相当，但本发明工序少，操作简单，周期短，劳动强度低，成本低，提取的产品质量好，易于放大至工业化生产。

附图说明

图1为多杀菌素标准品HPLC检测图谱；

图2为多杀菌素发酵液样品HPLC检测图谱；

图3为多杀菌素粗产品HPLC检测图谱。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明作进一步说明。但本发明的保护范围不能认为仅局限于下述具体实施方式。在不脱离本发明基本构思的前提下，所属领域的技术人员据此作出的简单推演或同等替换方案，均属于本发明的保护范围。

以下描述的各实施例所述发酵液均指含多杀菌素的刺糖多孢菌发酵液。

实施例1

（1）向发酵罐内的发酵液中加入5 mol/L NaOH溶液，调节发酵液pH=9.5，然后将发酵液加热升温至60℃，保温搅拌处理35min；（2）发酵液冷却至室温后加入甲醇，发酵液与甲醇的体积比为1:1.5，30℃条件下搅拌浸提8小时，放料至板框压滤机，过滤、收集滤液得到浸提清液；（3）浸提清液转入旋转蒸发仪中真空浓缩挥发完全除去甲醇，得到多杀菌素浓缩液，收率98.3%；（4）多杀菌素浓缩液中加入乙酸丁酯萃取，萃取条件为：两相体积比（萃取溶媒/多杀菌素浓缩液）=1:1，温度为室温25℃，pH=9.0，萃取时间10 min；萃取完成分相后收集得到负载有机相，萃取收率为98.6%；（5）负载有机相加入0.15 mol/L的草酸溶液进行反萃取，反萃取条件为：两相体积比（负载有机相/酸水）=1:1，温度25℃，时间2.5 min。反萃取后静置、分相，得到反萃取相，反萃取率为85.1%，空载有机相回收利用（6）反萃取相转入旋转蒸发仪中于45℃挥发除去残留的萃取溶媒，加入5 mol/L的NaOH溶液调节pH=10.0，通过减压过滤得到多杀菌素粗结晶沉淀，将沉淀用pH=10.5的稀碱溶液洗涤3次以除去杂质，然后置于冷冻真空干燥机中经过真空干燥即可得到多杀菌素粉剂，用HPLC（高效液相色谱）检测纯度，提取工艺总收率达到80.3%。

实施例2

（1）向发酵罐内的发酵液中加入3 mol/L NaOH溶液，调节发酵液pH=10.5，将发酵液加热升温至65℃，保温搅拌处理45 min；（2）发酵液冷却至室温后加入甲醇，发酵液与甲醇的体积比为1:1，30℃条件下搅拌浸提12小时，然后放料至板框压滤机，过滤、收集滤液得到浸提清液；(3)浸提清液转入真空浓缩罐中挥发除去甲醇，得到多杀菌素浓缩液，收率98.4%; （4）多杀菌素浓缩液加入乙酸丁酯萃取，采用CTL70-N离心萃取机，转鼓直径70 mm，转速2500 r/min，萃取条件为：两相体积比（萃取溶媒/多杀菌素浓缩液）=1:1，温度30℃，pH=8.5；分相后收集得到负载有机相，萃取收率98.3%；（5）同样用CTL70-N离心萃取机进行反萃取操作，负载有机相加入0.14 mol/L酒石酸溶液进行反萃取，反萃取条件为：两相体积比（负载有机相/酸水）=1:1，温度20℃；分相后收集得到反萃取相，反萃取收率84.7%，空载有机相回收重复利用；（6）反萃取相转入旋转蒸发仪中于40℃挥发除去残留的萃取溶媒后缓慢地加入5 mol/L的NaOH溶液调节pH=10.0，过滤，得到多杀菌素结晶沉淀，将沉淀用pH=10.5的稀碱溶液洗涤3次，除去杂质，然后置于冷冻真空干燥机中经过真空干燥即可得到多杀菌素粉剂，经HPLC检测纯度，提取工艺总收率达到81.3%。

采用HPLC（高效液相色谱）测定多杀菌素含量的具体色谱条件为：采用AKTA Purifier10高效液相色谱系统，反相色谱柱：4.6×120 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc., Mt. Freedom, N.J.)；柱温：室温25℃；流动相：甲醇-乙腈-2%醋酸铵溶液(体积比45:45:10 )；流速：1.5 ml/min；检测波长：250nm；进样体积：10μl。样品具体测定方法为：（1）取发酵液2 mL，加入2~4 mL的甲醇（丙酮、乙醇或其他极性溶剂），充分混合浸泡2小时；（2）浸泡液于4000r/min，4℃条件下离心处理10~15min；（3）收集上清液，经0.22μm微滤膜过滤，滤液上HPLC分析检测（对于多杀菌素粗产品，可直接定量溶解于甲醇中，经0.22μm微孔滤膜过滤后HPLC检测）；（4）根据AKTA Purifier10高效液相色谱系统操作软件测定得出的响应峰面积，结合标准曲线计算可准确得到多杀菌素含量。附图中图1、图2、图3分别为多杀菌素标准品、发酵液、多杀菌素结晶的HPLC检测图谱。在本色谱条件下，多杀菌素C保留时间为3.2~3.3 min，多杀菌素B保留时间为3.7~3.8 min，多杀菌素F保留时间为4.8~4.9 min，多杀菌素E保留时间为5.8~5.9 min，多杀菌素A保留时间为6.7~6.8 min，多杀菌素D保留时间为8.2~8.3 min。

Claims

1.一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，包括以下步骤：（1）发酵液预处理：发酵结束后放罐前，加入3～5 mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH=8.0～11.0，然后将发酵液加热升温至60～80℃，保温并以300-800r/min速度搅拌处理30～60 min；（2）浸泡提取：预处理后的发酵液冷却至室温后，按发酵液与极性有机溶剂体积比=1:0.5～2加入高介电常数极性有机溶剂，在10～40℃条件下浸泡、搅拌提取4～20小时，得到多杀菌素浸提液；多杀菌素浸提液用固液分离技术处理，弃去菌体固形物沉淀，收集浸提清液；（3）将浸提清液转入旋转蒸发仪或真空浓缩罐中，在40～50℃条件下，通过真空浓缩，将发酵液中的高介电常数极性溶剂挥发除去，得到多杀菌素浓缩液；（4）在多杀菌素浓缩液中加入低介电常数或高碳醇类萃取溶媒进行萃取，萃取条件为：萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:1～5，温度20～45℃，pH=7.0～11.0，萃取时间3～10min；萃取完成分层后，收集负载有机相；（5）向负载有机相中加入酸水进行反萃取，反萃取条件为：负载有机相与酸水体积比=1～5:1，酸水浓度0.1～0.4 mol/L，温度10～30℃，反萃取时间1～5 min，反萃取级数为1～5；反萃取分层完成后收集反萃取相；（6）用真空浓缩法或吹气法除去反萃取相中残留的萃取溶媒，用 NaOH溶液调节pH值=8.5～11.5，使多杀菌素以结晶形式沉淀出来，过滤，用pH=9.0～11.0的稀碱溶液将多杀菌素沉淀洗涤1～3次，真空干燥，即得到多杀菌素粉剂。

2.根据权利要求1所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（2）步，所述高介电常数极性溶剂是选自甲醇、丙酮、乙醇、乙腈中的一种或二种以上。

3.根据权利要求1或2所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（4）步，所述低介电常数萃取溶媒是选自乙酸丁酯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、正己烷、石油醚、甲苯、二甲苯中的一种；所述高碳醇萃取溶媒是选自正辛醇、异辛醇、仲辛醇中的一种。

4.根据权利要求1或2所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（5）步，所述反萃取用酸水是选自酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、盐酸的水溶液中的一种。

5.根据权利要求3所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（5）步，所述反萃取用酸水是选自酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、盐酸的水溶液中的一种。

6.根据权利要求1或2所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（2）步，发酵液与极性有机溶剂体积比=1:1.5，浸泡温度为20～30℃，搅拌时间10～15小时。

7.根据权利要求1或2所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（4）步，萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:2.5，萃取温度30℃，萃取pH=10.0，萃取时间8 min。

8.根据权利要求1或2所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（5）步，负载有机相与酸水体积比=1:2.5，酸水浓度0.15 mol/L，温度18℃，反萃取时间2 min。

9.根据权利要求3所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（5）步，负载有机相与酸水体积比=1:2.5，酸水浓度0.15 mol/L，温度18℃，反萃取时间2 min。

10.根据权利要求1或2所述的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（6）步，用 NaOH溶液调节pH值=10.0。