CN103483405A - 从菌丝体中分步萃取阿维菌素B1a和B2a的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种从阿弗曼链霉菌菌丝体中选择性萃取阿维菌素B_1a和B_2a的方法，该方法的突出特征在于从菌丝体中萃取阿维菌素B_1a和B_2a是分两步完成的，先用水/甲醇或水/乙醇共溶剂从菌丝体中选择性萃取出B_2a，然后在用甲醇或乙醇等有机溶剂萃取菌体中的B_1a。采用本方法可将B_1a和B_2a有效的拆分开，便于后续分离纯化B_1a和B_2a，可提高B_1a和B_2a的结晶收率。

Description

从菌丝体中分步萃取阿维菌素B1a和B2a的方法

技术领域

本发明涉及阿维菌素B_1a和B_2a的提取方法，具体涉及从菌丝体中分步萃取B_1a和B_2a组份，采用本萃取方法，可使B_1a与B_2a有效分离。

背景技术

阿维菌素是由阿弗曼链霉菌发酵产生的农用抗生素。它是一组十六元大环内酯类化合物，包括阿维菌素A_1a/A_1b(A₁)、A_2a/A_2b(A₂)、B_1a/B_1b(B₁)、B_2a/B_2b(B₂)，其中阿维菌素B₁已商品化，用于动物寄生虫病防治和农作物害虫防治，其它组份尚未开发应用。我国于1993年商业化开发成功阿维菌素B₁，当时的生产菌种发酵过程同时产生A组份(A₁和A₂)和B组份(B₁和B₂)，自2009年国内生产厂家开始应用仅产生B组份的突变种株，来生产阿维菌素B₁，即发酵产物中仅含有B₁(B_1a/B_1b)和B₂(B_2a和B_2b)，A₁和A₂的含量极少，仅占总量的1～3％。

本发明涉及的阿维菌素B_1a和B_2a的选择性提取是指从仅含B组份的菌丝体中提取B_1a和B_2a。已公开的专利(CN19280758)中描述了有关B_1a和B_2a的提取方法，公开的方法概括为：将菌丝体用有机溶剂萃取，萃取液中同时含有B_1a和B_2a，然后向萃取液中加入盐水，使大部分B_1a结晶析出。现阶段工厂使用的方法是：菌丝体烘干后用甲醇萃取，萃取液经过滤得萃取滤液，经蒸馏除去甲醇，得含B_1a和B_2a的油膏，油膏用甲苯溶解，在经水洗涤后，将甲苯溶液蒸馏浓缩，除去甲苯得油状液，向油状液中加入适量的甲醇或乙醇，从而使B_1a大部分以结晶状态析出，B_1a的收率在75～80％左右。上述工艺存在的共同问题是都不能将B_1a和B_2a完全拆分开，在母液中除含有B_2a，尚含有15％左右的B_1a无法与B_2a拆分开。因此用已有的方法提取B_1a，其收率在75％左右。

本发明是采用分步萃取的方法，将B_1a和B_2a从菌丝体中分别萃取出来，方法的原理是基于B_1a和B_2a在甲醇/水或乙醇/水中溶解度的显著差异，从而选择水/甲醇或水/乙醇共溶剂，先将菌丝体中的B_2a萃取出来，然后用甲醇或其它溶剂去萃取B_1a。本方法过程概括为：第一步用甲醇/水共溶剂或乙醇/水共溶剂浸泡菌丝体，经过滤或离心得菌丝体滤渣和水/甲醇或乙醇浸提滤液，B_1a留在菌丝体中；水/甲醇或乙醇浸提滤液中含B_2a，B_1a的含量极少，仅是B_2a的1/20左右；然后用甲醇或乙醇或其它有机溶剂浸泡已萃取过B_2a的菌丝体滤渣，将B_1a从菌体中萃取出来。本发明采用不同的溶剂通过萃取的方法将B_1a和B_2a拆分开，进一步采用不同的方法将萃取滤液中的B_1a或B_2a结晶出来，该方法的优点是B_1a和B_2a可有效的拆分开，并且B_1a、B_2a各自的收率都可达到90％或更高。拆分出的B_2a可开发成农用杀虫药和动物用驱虫药，具有可观的商业价值。

发明内容

本发明是一种从菌丝体中萃取B_1a和B_2a的方法，该方法的突出特征是先用水/甲醇或水/乙醇共溶剂，从菌丝体中选择性萃取出B_2a，然后在用有机溶剂萃取残留在菌体中的B_1a。本方法要点归纳如下：

1、发酵产生的菌丝体滤饼可干燥或不干燥，用水/甲醇或水/乙醇萃取B_2a。实验表明，发酵液经高压隔膜板框压滤，压至菌丝体滤饼含水量在40～55％时，在用水/甲醇或水/乙醇共溶剂来萃取B_2a，B_2a的萃取率高，甲醇或乙醇的用量少，萃取滤液中杂质少，B_2a易结晶析出，结晶收率高。

2、在萃取液中水与甲醇或乙醇的比例在2～6∶4～8，就是说在萃取液中水的含量是水加甲醇总量的20～60％范围，甲醇或乙醇的含量是水加甲醇或乙醇总量的40～80％(体积比)，实验表明，水含量占水加甲醇或乙醇总量的45～52％时最适合，水在此浓度范围，萃取滤液中B_2a浓度为0.5％左右，B_1a的溶出率较低，仅为0.016％左右。

3、在萃取液中水/甲醇或水/乙醇共溶剂与菌丝体(折干计)的适合比例为5～30∶1(体积/重量比)，以10～20∶1的比例较适宜，在此比例范围，经2次萃取即可将菌丝体中B_2a萃取出95％以上。

4、用水/甲醇或水/乙醇共溶剂萃取过的菌渣，用于进一步从中萃取B_1a，萃取B_1a所用的有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、MIBK、甲苯、甲基叔丁基醚等，实验表明，用甲醇/水共溶剂萃取B_2a时，则用甲醇进一步萃取B_1a合适，有成本最低，便于溶剂回收等优点；如用乙醇/水共溶剂萃取B_2a时，则用乙醇萃取B_1a合适。因此，建议采用本方法分步提取B_1a和B_2a时，提取B_2a用甲醇或乙醇/水共溶剂，提取B_1a时则用甲醇或乙醇。

具体实施方式

实例1、不同含水量对B_1a和B_2a萃取率的影响

实验用阿维菌素菌丝体粉由浙江升华拜克股份公司提供：菌丝体中含水量为13～16％，B_1a含量为14％，B_2a含量为12％；实验分7组，分别编号为NO.1～NO.7，每组一瓶，分别准确称量7份菌丝体粉，每份10.0g，于各组的250ml具塞三角瓶中，然后向每个瓶中分别加入100ml甲醇或水/甲醇共溶剂，具体如下：

NO.1加入纯度为99.5％甲醇100ml

NO.2加入100ml水/甲醇(2∶8，体积比)

NO.3加入100ml水/甲醇(3∶7，体积比)

NO.4加入100ml水/甲醇(4∶6，体积比)

NO.5加入100ml水/甲醇(4.5∶5.5，体积比)

NO.6加入100ml水/甲醇(5∶5，体积比)

NO.7加入100ml水/甲醇(6∶4，体积比)

上述各组经磁力搅拌萃取3小时，萃取温度为26～27℃，萃取液用0.2μm膜过滤得萃取滤液，萃取滤液中B_1a和B_2a浓度分析采用HPLC测定，采用C18柱(250mm)，流动相为水/乙腈＝7∶93，流速为1ml/min，检测波长为245nm，在此条件下B_1a出峰时间在8.4～8.6min，B_2a出峰时间在6.2～6.4min。

实验结果归纳如下：

NO.1萃取滤液中B_1a浓度为1.19％，B_2a浓度为1.032％。

NO.2萃取滤液中B_1a浓度为0.548％，B_2a浓度为1.15％。

NO.3萃取滤液中B_1a浓度为0.21％，B_2a浓度为1.022％。

NO.4萃取滤液中B_1a浓度为0.069％，B_2a浓度为0.76％。

NO.5萃取滤液中B_1a浓度为0.036％，B_2a浓度为0.58％。

NO.6萃取滤液中B_1a浓度为0.0199％，B_2a浓度为0.39～0.425％。

NO.7萃取滤液中B_1a浓度为0.0042％，B_2a浓度为0.101％。

以上实验结果可见：采用含水量40～55％的甲醇/水共溶剂从菌丝体中萃取B_2a具有很好的选择性。

实例2、菌丝体含水量对萃取效果的影响

实验用3种含水量不同的菌丝体，用甲醇/水共溶剂来萃取B_2a，甲醇/水共溶剂的用量是菌丝体量(折干计)的10倍，浸提时间为3小时，实验结果见下表。

注：萃取液是指由菌丝体、水、甲醇三者组成的混合体系。

从以上实验结果可见，用含水50％左右的菌丝体提取B_2a合适。

实例3、从含水量45～50％的菌丝体滤饼中萃取B_1a和B_2a

取100g含水量为45～50％、含B_1a6.12％、B_2a 4.9％的菌丝体滤饼，加入1升甲醇/水(52/48)，搅拌萃取2小时，之后抽滤，得第一次萃取滤液和菌渣A。

HPLC分析：第一次萃取滤液中B_2a浓度为0.51％，滤液中含B_2a总量为3.92g，B_1a浓度为0.016％，滤液中含B_1a总量为0.126g。

菌渣A用10倍体积的甲醇/水(50/50)进行二次萃取、抽滤，得第二次萃取滤液和菌渣B。

HPLC分析：第二次萃取滤液中B_2a浓度为0.12％，总量为1.02g，B_1a浓度为0.0192％，总量为0.1536g。

从以上数据可见，B_2a的萃取率约100％，B_1a的萃取率为4.7％。

菌渣B进一步用10倍量的甲醇萃取B_1a2次，采用HPLC分析萃取滤液中的B_1a含量，B_1a萃取率可达98％，菌渣中残留约60mg的B_1a，仅占B_1a总量的1.22％。

实例4、工业化生产工艺过程

(1)发酵液压滤：发酵结束，发酵液经预处理后，用高压板框压滤，得滤液和菌丝体滤饼，滤液去废水池进行环保处理。工艺要点：控制菌丝体滤饼含水量为40～55％。

(2)第一遍浸提B_2a：将含水量为40～55％的菌丝体滤饼与10倍体积左右的甲醇/水(52∶48)共溶剂混合，常温搅拌浸提2～3小时，得第一遍萃取液。

(3)萃取液压滤：用高压隔膜板框压滤第一遍萃取液得第一遍萃取滤液和菌渣A。

(4)第二遍萃取B_2a：将菌渣A返回到萃取罐，加10倍体积左右的甲醇/水(52∶48)共溶剂，搅拌浸提1～2小时，得第二遍萃取液。

(5)萃取液压滤：将上述第二遍萃取液通过高压板框压滤，得第二遍萃取滤液和菌渣B。

(6)合并第一遍和第二遍含B_2a的萃取滤液，进一步经蒸馏浓缩、结晶等过程可获得纯度大于88％的B_2a结晶。

(7)从菌渣B中萃取B_1a：将菌渣B返回到萃取罐中，加10倍体积左右的甲醇，搅拌浸提2小时，然后压滤，得含B_1a的第一遍萃取滤液和菌渣C。菌渣C进一步用10倍体积的甲醇进行二次萃取，过滤，得含B_1a的第二遍萃取滤液和菌渣D。

将含B_1a的第一遍萃取滤液，进一步经蒸馏浓缩、结晶等过程可获得纯度大于90％的B_1a结晶。

含B_1a的第二遍萃取滤液套用下批次的B_1a萃取。提取B_1a后的菌渣去环保处理。

实例5、不同含水量对B_1a和B_2a萃取率的影响

实验用阿维菌素菌丝体粉由浙江升华拜克股份公司提供：菌丝体中含水量为13～16％，B_1a含量为14％，B_2a含量为12％；实验分7组，分别编号为NO.1～NO.7，每组一瓶，分别准确称量7份菌丝体粉，每份10.0g，于各组的250ml具塞三角瓶中，然后向每个瓶中分别加入100ml乙醇或水/乙醇共溶剂，具体如下：

NO.1加入纯度为99.5％乙醇100ml

NO.2加入100ml水/乙醇(2∶8，体积比)

NO.3加入100ml水/乙醇(3∶7，体积比)

NO.4加入100ml水/乙醇(4∶6，体积比)

NO.5加入100ml水/乙醇(4.5∶5.5，体积比)

NO.6加入100ml水/乙醇(5∶5，体积比)

NO.7加入100ml水/乙醇(6∶4，体积比)

上述各组经磁力搅拌萃取3小时，萃取温度为26～27℃，萃取液用0.2μm膜过滤得萃取滤液，萃取滤液中B_1a和B_2a浓度分析采用HPLC测定，采用C18柱(250mm)，流动相为水/乙腈＝7∶93，流速为1ml/min，检测波长为245nm，在此条件下B_1a出峰时间在8.4～8.6min，B_2a出峰时间在6.2～6.4min。

实验结果归纳如下：

NO.1萃取滤液中B_1a浓度为1.22％，B_2a浓度为1.065％。

NO.2萃取滤液中B_1a浓度为0.496％，B_2a浓度为1.18％。

NO.3萃取滤液中B_1a浓度为0.167％，B_2a浓度为1.014％。

NO.4萃取滤液中B_1a浓度为0.053％，B_2a浓度为0.69％。

NO.5萃取滤液中B_1a浓度为0.034％，B_2a浓度为0.51％。

NO.6萃取滤液中B_1a浓度为0.0182％，B_2a浓度为0.414％。

NO.7萃取滤液中B_1a浓度为0.0038％，B_2a浓度为0.122％。

以上实验结果可见：采用含水量40～55％的乙醇/水共溶剂从菌丝体中萃取B_2a具有很好的选择性。

Claims (6)

1.一种阿维菌素B_1a和B_2a的选择性萃取方法，特征在于从菌丝体中萃取阿维菌素B_1a和B_2a是分两步进行：先用甲醇/水或乙醇/水共溶剂从菌体中萃取出B_2a，然后在用有机溶剂从提取过B_2a的菌体中萃取出B_1a；

2.按权利要求1所述的萃取方法，特征在于用甲醇/水或乙醇/水从菌体中萃取B_2a时，萃取液中水含量是水加甲醇或乙醇总量的20～60％，体积比；在萃取液中甲醇或乙醇含量是水加甲醇或乙醇总量的40～80％，体积比；

3.按权利要求2所述的萃取方法，特征在于用甲醇/水或乙醇/水从菌体中萃取B_2a时，萃取液中水含量是水加甲醇或乙醇总量的40～55％，体积比；在萃取液中甲醇或乙醇含量是水加甲醇或乙醇总量的45～60％，体积比；

4.按权利要求1所述的萃取方法，特征在于从提取过B_2a的菌体中进一步用有机溶剂萃取B_1a，所用的有机溶剂包括：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、甲基叔丁基醚；

5.按权利要求1或4任意一项所述的萃取方法，特征在于从提取过B_2a的菌体中进一步用有机溶剂萃取B_1a，所用的有机溶剂包括甲醇或乙醇；

6.按权利要求1～5项中任意一项所述的萃取方法，特征在于从菌体中分步萃取B_1a和B_2a，萃取方法和操作过程如下：

a.发酵产生的菌丝体滤饼干燥或不干燥，加入甲醇和水，含菌丝体、甲醇和水的混合液称之为萃取液，在萃取液中甲醇与水的体积比为50～55∶45～50，甲醇/水与菌体的比例为5∶1～10∶1，体积/重量比；

b.搅拌萃取2～10小时；

c.压滤，得第一遍萃取滤液和菌渣A；

d.用体积比为50～55∶45～50的甲醇/水对菌渣A进行第二遍萃取，压滤，得第二遍萃取滤液和菌渣B；检测菌渣B中B_2a和B_1a含量，待B_2a含量为B_1a含量的1/30以下时，即完成B_2a的萃取过程；

e.合并含B_2a的萃取滤液，经蒸馏浓缩、结晶等过程，即可获得含B_2a的结晶物；

f.以上萃取过B_2a后剩下的菌渣B用20倍量的甲醇分2～3次萃取B_1a，经过滤得含B_1a的萃取滤液和菌渣，萃取滤液经活性碳脱色或不脱色，然后去除部分甲醇，在5～25℃条件下使B_1a结晶析出，得B_1a粗结晶品，菌渣废弃，去环保处理。