CN105440049A - 一种制备高纯度米尔贝肟的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备高纯度米尔贝肟的方法，将米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4从发酵液中提取并初步纯化后，使用氧化活性较低的氧化剂氧化，经硅胶层析将米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的含量由不到25％提高到了75％以上，并在浓缩过程中自然析出结晶，使米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的含量再次上升到95％以上；然后进行肟化反应，通过树脂层析调整米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的含量比例为1:4，同时能够再次将产品的含量提高到98％以上。整个工艺比较简单，对设备要求较低，通用性好，适用于工业化大生产。

Description

一种制备高纯度米尔贝肟的方法

技术领域

本发明属于动物制药领域，涉及一种动物用抗生素的生产方法，尤其涉及一种制备高纯度米尔贝肟的方法。

背景技术

米尔贝肟(milbemycinoxime)是一种新型的半合成的大环内酯类驱虫药物，是米尔贝霉素A3和A4的肟化衍生物，对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。

米尔贝A3肟和米尔贝A4肟的化学结构式如下：

目前米尔贝肟主要是通过发酵得到的米尔贝霉素半合成来得到，但是米尔贝霉素发酵液单位普遍不高，产品的含量较低，组份杂质多，分离困难。这给制备高纯度的米尔贝肟带来了很大的难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于工业化大生产的高纯度米尔贝肟的制备方法。

本发明的制备高纯度米尔贝肟的方法，包括以下步骤：

1)将含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行固液分离，然后用第一溶媒萃取菌渣，得到含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的提取液；

2)将提取液浓缩后上硅胶柱层析，并用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液进行洗脱，得到含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的解吸液；

3)将解吸液浓缩，去除溶剂，然后用二氯甲烷溶解浓缩物并进行氧化反应，得到含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的二氯甲烷溶液；

4)将步骤3)得到的溶液经活性炭吸附脱色后进行浓缩，浓缩物用第一溶媒溶解，上硅胶柱层析，用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液进行洗脱，得到含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮组份的解吸液，然后浓缩结晶，分离出结晶体；

5)对结晶体进行肟化反应，加入水终止反应后加入二氯甲烷萃取，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的二氯甲烷溶液；

6)将上述的含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的二氯甲烷溶液去除溶剂，用第三溶媒的水溶液溶解，进行树脂层析，然后将解吸液按照米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟含量比例为1:4进行混合，得到解吸混合液；

7)用庚烷萃取解吸混合液，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的庚烷溶液，然后去除溶剂，再用第三溶媒溶解，加水降温进行结晶，固液分离、干燥得到米尔贝肟晶体。

上述步骤1)的发酵液是通过现有技术进行菌种发酵培养得到的含有米尔贝霉素A3和A4组份的发酵液；所述第一溶媒可以是庚烷或甲苯，优选庚烷；萃取溶媒用量优选为菌渣重量的8～10倍；萃取温度以30～40℃为宜。

上述步骤2)将提取液浓缩至米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的浓度为10～15g/L，并通过除菌板除菌后再上硅胶柱；其中所述除菌板的孔径为0.2～0.45μm；所使用的硅胶为工业级层析硅胶，粒径为100～400目，干硅胶粉末的使用重量优选为米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份净含量重量的50～100倍；所述第二溶媒可以是丙酮或丁酮，优选丙酮；第一溶媒和第二溶媒混合的比例优选为第一溶媒体积(V)∶第二溶媒体积(V)＝80:20～95:5。

上述步骤3)氧化反应使用的氧化剂可以是活性二氧化锰、氯铬酸吡啶盐(PCC)、重铬酸吡啶盐(PDC)等；更优选活性二氧化锰。

上述步骤4)中使用的活性炭优选针用活性炭；活性炭的加入量为米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮总量的2～3倍(质量)；活性炭加入后保持二氯甲烷溶液的温度范围为30～35℃搅拌1～2小时，然后通过除菌板去除活性炭粉末，得到澄清的含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的二氯甲烷溶液。将澄清的含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的二氯甲烷溶液浓缩去除溶剂后，用第一溶媒溶解，上硅胶柱层析，所述硅胶为工业级层析硅胶，粒径为100～400目，干硅胶粉末的使用量为米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮组份重量的50～100倍；洗脱所用的混合溶媒中第一溶媒体积(V)∶第二溶媒体积(V)＝5:1～11:1。

上述步骤5)肟化反应可以是：将米尔贝霉素酮结晶体用无水乙醇完全溶解后，将盐酸羟胺的水溶液缓慢加入该米尔贝霉素酮乙醇溶液中，搅拌混合同时保持溶液温度为20～25℃，反应1小时以上，直到米尔贝霉素酮完全转变成米尔贝霉素肟后终止反应。

上述步骤6)中所述第三溶媒优选为乙醇或甲醇，更优选甲醇；树脂层析所使用的上柱液为第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的体积百分含量为55％～60％；树脂层析所使用的解吸液也是第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的体积百分含量为60％～70％且高于上柱液的含量；所使用的树脂优选为苯乙烯-聚苯乙烯系列的非极性大孔树脂。

上述步骤7)先在解吸混合液中加入两倍解吸混合液体积的水，再用庚烷进行萃取，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的庚烷溶液；然后将上述庚烷溶液去除溶剂后加入第三溶媒进行溶解，得到米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟总浓度为20g/L～50g/L的溶液；再缓慢加入体积为第三溶媒体积3～4倍的水，降低溶液温度到10～20℃，缓慢搅拌结晶；最后固液分离、真空干燥得到含高纯度米尔贝肟的结晶体。

本发明提供了一种较简单的纯化方式得到高纯度的米尔贝肟，非常适用于工业化大生产。组份我们在研究过程中惊喜的发现通米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的混合物，在使用氧化活性较低的氧化剂氧化后，通过一次硅胶层析，米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的含量轻松的由不到25％提高到了75％以上，且在氧化酮解吸液的浓缩过程中米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮会自然析出结晶，产品的含量再次上升到95％以上，通过树脂层析调整米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的含量比例的同时能够再次将产品的含量提高到98％以上。整个工艺比较简单，对设备要求较低，通用性好，无需太大的改造，可以快速进行工业化大生产。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

下列实施例中，为了方便描述，将米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4产品之和称为“米尔贝霉素组份”；将米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮产品之和称为“米尔贝酮组份”；将米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟产品之和称为“米尔贝肟组份”。

实施例1

对含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行板框压滤，菌渣用8倍菌渣重量的甲苯萃取，得到的甲苯萃取液经过高压液色谱相检测计算含米尔贝霉素组份100g。浓缩甲苯萃取液，直到甲苯中米尔贝霉素组份的含量为15g/L，甲苯萃取浓缩液通过0.45μm孔径的除菌板过滤。

过滤后的甲苯萃取液进行硅胶上柱。硅胶柱由5kg的干硅胶装填而成，硅胶粒径为100～200目。上柱完成后用甲苯∶丙酮＝95:5(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解析。合并解吸液，得到的解吸液含有米尔贝霉素组份90g，取小部分解吸液浓缩干，通过高压液相色谱检测计算米尔贝霉素组份在浓缩物中的质量含量为20％。

将米尔贝霉素组份的解吸液减压浓缩干，回收溶剂，浓缩物用二氯甲烷溶解，投入活性二氧化锰氧化，直到高压液相色谱检测所有米尔贝霉素组份氧化成米尔贝酮组份后将二氯甲烷中的活性二氧化锰过滤去除。得到二氯甲烷溶液含米尔贝酮组份86g。向二氯甲烷溶液投入针用活性炭258g，水浴35℃下搅拌2小时，通过除菌板过滤去除活性炭。过滤后的二氯甲烷米尔贝酮组份溶液，浓缩干回收二氯甲烷后用甲苯溶解浓缩物。

用8.6kg重量的干硅胶在甲苯中浸泡后装填层析柱。含有米尔贝酮组份的甲苯溶液上柱后，用甲苯∶丙酮＝11:1(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解吸，收集含有米尔贝酮组份的解吸液，得到含有米尔贝酮组份76g的解吸液混合液。浓缩解吸液过程中结晶，离心机分离结晶体68g，高压液相色谱检测后计算其中含米尔贝酮组份65g。

将米尔贝酮结晶体用1760mL无水乙醇溶解，称取163.2g盐酸羟胺用163mL纯化水溶解完全，将盐酸羟胺水溶液缓慢加入米尔贝酮乙醇溶液中，搅拌并保持溶液20℃，加入完1小时后取样，用高压液相色谱检测，米尔贝酮反应完全，立即加入水终止反应，并用二氯甲烷萃取，得到含有米尔贝肟组份的二氯甲烷溶液，通过高压液相色谱检测计算二氯甲烷溶液中含有米尔贝肟63g。

浓缩干二氯甲烷溶液，用甲醇溶液溶解浓缩物，再向其中缓慢加入水，使其甲醇的体积百分比降低为60％，用上海华震色谱-3树脂进行层析，上柱完成后用甲醇的体积百分比为70％的甲醇水溶液进行解析，收集含有米尔贝肟的解吸液，通过高压液相色谱检测调整混合解吸液中米尔贝霉素A3肟色谱含量和米尔贝霉素A4肟组份色谱含量比例＝1:4。解吸液中加入2倍解吸液体积的水，并用庚烷萃取，通过高压液相色谱检测计算庚烷溶液中含有米尔贝肟组份50g

浓缩干并回收庚烷，用2.5L甲醇溶解浓缩物，再向其中缓慢加入10L纯化水，降低温度到20℃结晶。

离心分离结晶物，真空干燥得到米尔贝肟结晶体48g，通过高压液相色谱检测其中米尔贝肟组份质量百分含量为98.3％。

实施例2

对含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行板框压滤，菌渣用10倍菌渣重量的庚烷萃取，得到的庚烷萃取液经过高压液相色谱检测计算含米尔贝霉素组份120g。浓缩庚烷萃取液，直到庚烷中米尔贝霉素组份的含量为10g/L，庚烷萃取浓缩液通过0.2μm孔径的除菌板过滤。

过滤后的庚烷萃取液进行硅胶上柱。硅胶柱由12kg的干硅胶装填而成，硅胶粒径为300～400目。上柱完成后用庚烷∶丁酮＝80:20(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解析。合并解吸液，得到的解吸液含有米尔贝霉素组份110g，取小部分解吸液浓缩干，通过高压液相色谱检测计算米尔贝霉素组份在浓缩物中的质量含量为18％。

将米尔贝霉素组份的解吸液减压浓缩干，回收溶剂，浓缩物用二氯甲烷溶解，投入氯铬酸吡啶盐(PCC)氧化，直到HPLC检测所有米尔贝霉素组份氧化成米尔贝酮组份后将二氯甲烷中的氯铬酸吡啶盐(PCC)过滤去除。得到的二氯甲烷溶液含米尔贝酮组份105g。向二氯甲烷溶液投入针用活性炭210g，水浴35℃下搅拌1小时，通过除菌板过滤去除活性炭。过滤后的二氯甲烷米尔贝酮组份溶液，浓缩干回收二氯甲烷后用庚烷溶解浓缩物。

用5.25kg重量的干硅胶在庚烷中浸泡后装填层析柱。含有米尔贝酮组份的庚烷溶液上柱后，用庚烷∶丁酮＝5:1(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解吸，收集含有米尔贝酮组份的解吸液，得到含有米尔贝酮组份92g的解吸液混合液。浓缩解吸液过程中结晶，离心机分离结晶体81g，高压液相色谱检测后计算其中含米尔贝酮组份77g。

将米尔贝酮结晶体用1620mL无水乙醇溶解，称取194.4g盐酸羟胺用194mL纯化水溶解完全，将盐酸羟胺水溶液缓慢加入米尔贝酮乙醇溶液中，搅拌并保持溶液25℃，加入完1小时后取样，用高压液相色谱检测，米尔贝酮反应完全，立即加入水终止反应，并用二氯甲烷萃取，得到含有米尔贝肟组份的二氯甲烷溶液，通过高压液相色谱检测计算二氯甲烷溶液中含有米尔贝肟75g。

浓缩干二氯甲烷溶液，用乙醇溶液溶解浓缩物，再向其中缓慢加入水，使其乙醇的体积百分比降低为55％，用三菱HP20树脂进行层析，上柱完成后用乙醇的体积百分比为65％的乙醇水溶液进行解析，收集含有米尔贝肟的解吸液，通过高压液相色谱检测调整混合解吸液中米尔贝霉素A3肟色谱含量和米尔贝霉素A4肟色谱含量比例＝1:4。解吸液中加入2倍解吸液体积的水，并用庚烷萃取，通过高压液相色谱检测计算庚烷溶液中含有米尔贝肟组份56g。

浓缩干并回收庚烷，用1.12L乙醇溶解，向其中缓慢加入3.36L纯化水，降低温度到10℃结晶。

离心分离结晶物，真空干燥得到米尔贝肟结晶体54.4g，通过高压液相色谱检测其中米尔贝肟组份质量百分含量为99.3％。

实施例3

对含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行板框压滤，菌渣用9倍菌渣重量的庚烷萃取，得到的庚烷萃取液经过高压液相色谱检测计算含米尔贝霉素组份150g。浓缩庚烷萃取液，直到庚烷中米尔贝霉素组份的含量为13g/L，庚烷萃取浓缩液通过0.2μm孔径的除菌板过滤。

过滤后的庚烷萃取液进行硅胶上柱。硅胶柱由15kg的干硅胶装填而成，硅胶粒径为100～200目。上柱完成后用庚烷∶丙酮＝90:10(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解析。合并解吸液，得到的解吸液含有米尔贝霉素组份128g，取小部分解吸液浓缩干，通过高压液相色谱检测计算米尔贝霉素组份在浓缩物中的质量含量为22％。

将米尔贝霉素组份的解吸液减压浓缩干，回收溶剂，浓缩物用二氯甲烷溶解，投入重铬酸吡啶盐(PDC)氧化，直到HPLC检测所有米尔贝霉素组份氧化成米尔贝酮组份后将二氯甲烷中的氯铬酸吡啶盐(PCC)过滤去除。得到含米尔贝酮组份125g的二氯甲烷溶液。向二氯甲烷溶液投入针用活性炭320g，水浴35℃下搅拌2小时，通过除菌板过滤去除活性炭。过滤后的二氯甲烷米尔贝酮组份溶液，浓缩干回收二氯甲烷后用庚烷溶解浓缩物。

用12.5kg重量的干硅胶在庚烷中浸泡后装填层析柱。含有米尔贝酮组份的庚烷溶液上柱后，用庚烷∶丙酮＝10∶1(V/V)的解吸液对硅胶柱进行解吸，收集含有米尔贝酮组份的解吸液，得到含有米尔贝酮组份106.3g的解吸液混合液。浓缩解吸液过程中结晶，离心机分离结晶体87.1g，高压液相色谱检测后计算其中含米尔贝酮组份84g。

将米尔贝酮结晶体用1742mL无水乙醇溶解，称取209g盐酸羟胺用209mL纯化水溶解完全，将盐酸羟胺水溶液缓慢加入米尔贝酮乙醇溶液中，搅拌并保持溶液25℃，加入完1小时后取样，用高压液相色谱检测，米尔贝酮反应完全，立即加入水终止反应，并用二氯甲烷萃取得到含有米尔贝肟组份的二氯甲烷溶液，通过高压液相色谱检测计算二氯甲烷溶液中含有米尔贝肟81g。

浓缩干二氯甲烷溶液，用乙醇溶液溶解浓缩物，再向其中缓慢加入水，使其乙醇的体积百分比降低为57％，用三菱HP20树脂进行层析，上柱完成后用乙醇的体积百分比为63％的乙醇水溶液进行解析，收集含有米尔贝肟的解吸液，通过高压液相色谱检测调整混合解吸液中米尔贝霉素A3肟色谱含量和米尔贝霉素A4肟色谱含量比例＝1:4。解吸液中加入2倍解吸液体积的水，并用庚烷萃取，通过高压液相色谱检测计算庚烷溶液中含有米尔贝肟组份58g。

浓缩干并回收庚烷，用2.5L乙醇溶解，向其中缓慢加入7.5L纯化水，降低温度到10℃结晶。

离心分离结晶物，真空干燥得到米尔贝肟结晶体56.6g，通过高压液相色谱检测其中米尔贝肟组份质量百分含量为99.3％。

Claims (9)

1.一种制备高纯度米尔贝肟的方法，包括以下步骤：

1)将含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的发酵液进行固液分离，然后用第一溶媒萃取菌渣，得到含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的提取液；

2)将提取液浓缩后上硅胶柱层析，并用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液进行洗脱，得到含有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的解吸液；

3)将步骤2)所得解吸液浓缩，去除溶剂，然后用二氯甲烷溶解浓缩物并进行氧化反应，得到含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的二氯甲烷溶液；

4)将步骤3)得到的溶液经活性炭吸附脱色后进行浓缩，浓缩物用第一溶媒溶解，上硅胶柱层析，用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液进行洗脱，得到含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮组份的解吸液，然后浓缩结晶，分离出结晶体；

5)对结晶体进行肟化反应，加入水终止反应后加入二氯甲烷萃取，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的二氯甲烷溶液；

6)将含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的二氯甲烷溶液去除溶剂，用第三溶媒的水溶液溶解，进行树脂层析，然后将解吸液按照米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟含量比例为1:4进行混合，得到解吸混合液；

7)用庚烷萃取解吸混合液，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的庚烷溶液，然后去除溶剂，再用第三溶媒溶解，加水降温进行结晶，固液分离、干燥得到米尔贝肟晶体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一溶媒为庚烷或甲苯；所述第二溶媒为丙酮或丁酮；所述第三溶媒为乙醇或甲醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)第一溶媒萃取菌渣的用量为菌渣重量的8～10倍，萃取温度为30～40℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将提取液浓缩至米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份的浓度为10～15g/L，并通过除菌板除菌后再上硅胶柱；所用硅胶粒径为100～400目，干硅胶粉末的使用量为米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4组份重量的50～100倍；洗脱所用第一溶媒和第二溶媒的体积比为80:20～95:5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)氧化反应使用的氧化剂是活性二氧化锰、氯铬酸吡啶盐或重铬酸吡啶盐。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)使用针用活性炭，其加入量为米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮总质量的2～3倍；活性炭加入后保持二氯甲烷溶液的温度为30～35℃搅拌1～2小时，然后通过除菌板去除活性炭，得到澄清的含有米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮的二氯甲烷溶液；然后将该澄清溶液浓缩去除溶剂，用第一溶媒溶解，上硅胶柱层析，所述硅胶粒径为100～400目，干硅胶粉末的使用量为米尔贝霉素A3酮和米尔贝霉素A4酮组份重量的50～100倍；洗脱所用第一溶媒和第二溶媒的体积比为5:1～11:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)肟化反应方法为：将步骤4)所得结晶体用无水乙醇完全溶解后，将盐酸羟胺的水溶液缓慢加入该乙醇溶液中，搅拌混合并保持溶液温度为20～25℃，反应1小时以上，直到米尔贝霉素酮完全转变成米尔贝霉素肟后终止反应。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)树脂层析所用树脂为苯乙烯-聚苯乙烯系列的非极性大孔树脂；树脂层析所使用的上柱液为第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的体积百分含量为55％～60％；树脂层析所使用的解吸液为第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的体积百分含量为60％～70％，且高于上柱液中第三溶媒的体积百分含量。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)具体过程是：先在解吸混合液中加入两倍解吸混合液体积的水，再用庚烷进行萃取，得到含有米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟的庚烷溶液；然后将该庚烷溶液去除溶剂后加入第三溶媒进行溶解，得到米尔贝霉素A3肟和米尔贝霉素A4肟总浓度为20g/L～50g/L的溶液；再缓慢加入体积为第三溶媒体积3～4倍的水，降低溶液温度到10～20℃，缓慢搅拌结晶；最后固液分离、真空干燥得到米尔贝肟结晶体。