CN101629203A

CN101629203A - 一种多杀菌素制备工艺

Info

Publication number: CN101629203A
Application number: CN200810143870A
Authority: CN
Inventors: 夏立秋; 丁学知; 张友明; 余子全; 易勇; 胡胜标; 罗玉双; 杨尉; 黄璠
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2008-12-09
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2028-12-09
Also published as: CN101629203B

Abstract

一种多杀菌素制备工艺，其包括放线菌刺糖多孢菌S078－8发酵工艺和利用放线菌刺糖多孢菌S078－8发酵所得含多杀菌素的发酵液提取多杀菌素结晶产品的工艺两部分。本发明的优点，一是产率高，经HPLC测定，多杀菌素产量最终达到2000－4000mg/L以上，特别是，杀虫效价最高的正丁基多杀菌素成分，发酵液内的含量达到1500－2800mg/L；二是多杀菌素结晶产品纯度高，达到95％－98％。

Description

一种多杀菌素制备工艺

技术领域

本发明涉及一种多杀菌素制备工艺，尤其是涉及一种利用放线菌刺糖多孢菌制备多杀菌素的工艺。

背景技术

多杀菌素(spinosad)是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的次级代谢产物，属于大环内脂类化合物，其主要有效成分是多杀菌素spinosyn A(约占85％-90％)和spinosyn D(约占10％-15％)。多杀菌素作为一种新型的高效广谱大环内酯类杀虫活性物质，试验证明其杀虫谱十分广泛，包括鳞翅目(Lepidoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)等害虫。尤其对鳞翅目、缨翅目害虫有极强的选择性与杀虫活性，而对非靶标生物的毒性很低，对人和其他哺乳动物非常安全，迄今为止没有发现与其他杀虫剂有交叉抗性。

多杀菌素通过与烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors，nAchRs)结合，使昆虫神经细胞去极化，引起中央神经系统广泛超活化，导致非功能性的肌收缩、衰竭、并伴随颤抖和麻痹，对昆虫存在快速触杀和摄食毒性，同时也通过抑制γ-氨基丁酸受体(Gamma-amino butyric acid receptors GABARs)而使神经细胞超活化，这可能会进一步加强其杀虫活性。

在多杀菌素衍生物中，正丁基多杀菌素(结构式参见图1)为杀虫效价最高的成分。因此，研究开发产率高，产品纯度高，正丁基多杀菌素成分含量高，生产成本低的多杀菌素制备方法，具有重要易意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产率高，产品纯度高，正丁基多杀菌素成分含量高，生产成本低的多杀菌素制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

其包括放线菌刺糖多孢菌S07g-8(Saccharopolyspora spinosaS078-8，2008年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M208225)发酵工艺和利用放线菌刺糖多孢菌S078-8发酵所得含多杀菌素发酵液提取多杀菌素结晶产品的工艺两部分。

放线菌刺糖多孢菌S078-8发酵工艺部分具体包括以下步骤：(1)将放线菌刺糖多孢菌S078-8菌种接种于装有种子培养液的摇瓶内，在28-34℃条件下，培养2-3天，将该种子液接入种子罐，接种时，该罐培养基pH为6.0～8.0；(2)对种子罐装入培养基，灭菌(可采用公知灭菌方法)后，接入经活化的摇瓶种子液；(3)对发酵罐装入培养基，灭菌(可采用公知灭菌方法)后，冷却至28-34℃，按投料体积的5～15％移入种子液；(4)种子罐培养：在温度28-34℃，罐压0.3-0.6Kg/cm²，通气量1∶0.7-1∶0.9(V/V)，搅拌速率200-300rpm条件下培养2-3天；(5)发酵罐培养：在温度28-34℃，罐压0.3-0.8Kg/cm²，通气量1∶0.4-1∶1.5(V/V)，搅拌速率200-600rpm条件下培养9～12天；用显微镜检查有60～80％的菌丝体裂解时，终止发酵，放罐，即得含多杀菌素的发酵液；

所述种子培养基配方为：葡萄糖10～20g/L，大豆粉30～60g/L，酵母粉6～12g/L，硫酸镁1.8～3.6g/L，泡敌0.02％～0.08％，灭菌前pH为7.0～9.0，灭菌后pH为6.0～8.0；

所述发酵罐培养基配方为：葡萄糖100～200g/L，酵母粉1.0～4.0g/L，豆饼粉6.0～100g/L，玉米粉8～12g/L，油酸甲酯25～100ml/L，碳酸钙3.0～6.0g/L，棉籽粉24～36g/L；泡敌0.02％～0.08％，，灭菌前pH为7.0～9.0，灭菌后pH为6.0～8.0。

在发酵罐发酵菌体进入对数生长期，宜设定联动控制维持发酵液内溶氧水平，即通过调整搅拌转速、通气速率维持溶氧浓度在30～50％，以有效保证菌体正常生长代谢需要。

所述放线菌刺糖多孢菌是本发明者采用Red/ET基因工程技术和结合转移技术获得的。

利用放线菌刺糖多孢菌S078-8发酵所得含多杀菌素发酵液提取多杀菌素结晶产品的工艺具体包括以下步骤：(1)将含多杀菌素的发酵液pH值调节为9-11；(2)将调pH值后的发酵液置于连续离心机中以12000～18000rpm转速离心处理15～30min，弃去上清液，收集离心管底部的菌体固形沉淀物；(3)将所得菌体固形沉淀物用超滤水充分洗涤2～4次，加入与发酵液等体积的甲醇，充分搅拌混合，进行2～3小时的浸提，同时进行充分搅拌；(4)将甲醇浸提液置于离心机中以6000～8000rpm转速离心处理15～30min，弃去菌体固形物沉淀，收集浸提上清液；(5)将浸提上清液通过减压浓缩至1/10～1/30原发酵液体积，加入与发酵液等体积的0.1～0.3mol/L酒石酸溶液，调节pH值为9-11，得到多杀菌素结晶沉淀；(6)将多杀菌素结晶沉淀用超滤水洗涤3～5次，真空干燥，即得多杀菌素结晶产品。

可用HPLC方法测定产品多杀菌素成分和含量：(1)取2ml发酵液加2-4ml甲醇或标准品稀释一定倍数，用超声波处理30秒钟；(2)将稀释液转移至5ml离心管中，30℃恒温箱内放置4-10小时；(3)用4000rpm、2-6℃低温条件下离心10-15分钟；(4)取上清液过微孔滤膜，置于4℃冰箱内待检测；(5)滤液用AKTA purifier10高效液相色谱仪进行色谱分析；(6)根据多杀菌素含量与峰面积标准曲线计算所测发酵样品的正丁基多杀菌素含量

与现有技术相比，本发明的优点，一是产率高，经HPLC测定，多杀菌素产量最终达到2000-4000mg/L以上，特别是，杀虫效价最高的正丁基多杀菌素成分，发酵液内的含量达到1500-2800mg/L；二是多杀菌素结晶产品纯度高，达到95％-98％；三是生产成本相对也低。

放线菌刺糖多孢菌S078-8保藏日期、保藏单位全称及简称、保藏编号

保藏日期：2008年11月22日；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；

保藏编号：CCTCC M208225。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不能认为只局限于下述具体实施方式。对所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的基本前提下，还可以做出若干简单推演或等同替换，这些等同替换方案仍然将被视为在本发明的保护范围之内。

以下所述实施例第(1)至第(5)步为放线菌刺糖多孢菌S078-8发酵得到含多杀菌素发酵液的工艺；第(6)至第(11)步为利用第(5)步发酵所得含多杀菌素的发酵液提取制备多杀菌素结晶产品的工艺。如只需得到含多杀菌素发酵液，则第(6)至第(11)步可以省去。各实施例相关步骤采用的灭菌法均为公知的高压蒸汽灭菌法：压力0.2MPa，温度121℃，保持30分钟。

实施例1

(1)将放线菌刺糖多孢菌S078-8菌种保藏管一支接种于装有种子培养液的摇瓶内，在30℃条件下，培养2.5天，将该种子液接入种子罐，接种时，该罐培养基pH为7.0；(2)对种子罐装入培养基，通入高压蒸汽灭菌，冷却至30℃后，接入经活化的摇瓶种子液；(3)对发酵罐装入培养基，通入高压蒸汽灭菌，冷却至30℃后，按投料体积的10％移入种子液；(4)种子罐培养：在温度30℃，罐压0.5Kg/cm²，通气量1∶0.8(V/V)，搅拌速率250rpm条件下培养2.5天；(5)发酵罐培养：在温度31℃，罐压0.5Kg/cm²，通气量1∶∶1.3(V/V)，搅拌速率350rpm条件下，培养11天；其间，在发酵罐发酵菌体进入对数生长期，通过控制系统自动调整搅拌转速、通气速率维持溶氧浓度在35～40％；用显微镜检查有65％的菌丝体裂解时，终止发酵，放罐；(6)收集发酵罐发酵液，调节pH值为10；(7)将调pH值后的发酵液置于连续离心机中以15000 rpm转速离心处理20min，弃去上清液，收集离心管底部的菌体固形沉淀物；(8)将所得菌体固形沉淀物用超滤水充分洗涤3次，加入与发酵液等体积的甲醇，充分搅拌混合，进行2.5小时浸提，同时进行充分搅拌；(9)将甲醇浸提液置于离心机中以7000 rpm转速离心处理20min，弃去菌体固形物沉淀，收集浸提上清液；(10)将浸提上清液通过减压浓缩至1/20原发酵液体积，加入与发酵液等体积的0.2mol/L酒石酸溶液，调节pH值为10，得到多杀菌素结晶沉淀；(11)将多杀菌素结晶沉淀用超滤水洗涤4次，真空干燥，即得多杀菌素产品。

所述种子培养基配方为：葡萄糖15g/L，大豆粉25g/L，酵母粉9g/L，硫酸镁2.7g/L，泡敌0.05wt％，灭菌前pH为8.0，灭菌后pH为7.0。

发酵罐培养基配方为：葡萄糖140g/L，酵母粉3g/L，豆饼粉5.0g/L，玉米粉9g/L，油酸甲酯50ml/L，碳酸钙2g/L，棉籽粉30g/L，其余为水；泡敌0.05wt％，灭菌前pH为8.0，灭菌后pH为7.0；将固型颗粒成分粉碎，细度为120目/英寸，再将各成分混合均匀即成。

用HPLC方法测定发酵液中多杀菌素含量，达到3950mg/L；其中正丁基多杀菌素成分含量达到1570mg/L；多杀菌素结晶产品纯度达到96％。

实施例2

(1)将放线菌刺糖多孢菌S078-8菌种保藏管一支接种于装有种子培养液的摇瓶内，在32℃条件下，培养2天，将该种子液接入种子罐，接种时，该罐培养基pH为6.0；(2)同实施例1第(2)步；(3)对发酵罐装入培养基，灭菌方法同第(2)步，灭菌后，冷却至28℃，按投料体积的15％移入种子液；(4)种子罐培养：在温度28℃，罐压0.3Kg/cm²，通气量1∶0.7(V/V)，搅拌速率200rpm条件下培养3天；(5)发酵罐培养：在温度28℃，罐压0.8Kg/cm²，通气量1∶0.5(V/V)，搅拌速率200rpm条件下培养12天；用显微镜检查有70％的菌丝体裂解时，终止发酵，放罐；(6)收集发酵罐发酵液，调节pH值为9；(7)将调pH值后的发酵液置于连续离心机中以13000rpm转速离心处理28min，弃去上清液，收集离心管底部的菌体固形沉淀物；(8)将所得菌体固形沉淀物用超滤水充分洗涤4次，加入与发酵液等体积的甲醇，充分搅拌混合，进行2小时的浸提，同时进行充分搅拌；(9)将甲醇浸提液置于离心机中以8000rpm转速离心处理15min，弃去菌体固形物沉淀，收集浸提上清液；(10)将浸提上清液通过减压浓缩至1/10原发酵液体积，加入与发酵液等体积的0.1mol/L酒石酸溶液，调节pH值为9，得到多杀菌素结晶沉淀；(11)将多杀菌素结晶沉淀用超滤水洗涤3次，真空干燥，即可得正丁基多杀菌素或多杀菌素衍生物产品。

所述种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，大豆粉50g/L，酵母粉12g/L，硫酸镁1.8g/L，泡敌0.02wt％，灭菌前pH为7.0，灭菌后pH为6.0；

所述发酵罐培养基配方为：葡萄糖200g/L，酵母粉2.0g/L，豆饼粉10.0g/L，玉米粉8g/L，油酸甲酯90ml/L，碳酸钙6.0g/L，棉籽粉36g/L；泡敌0.08wt％，灭菌前pH为7.0，灭菌后pH为6.0。

用HPLC方法测定发酵液中多杀菌素含量，达到3790mg/L；其中正丁基多杀菌素成分含量达到1820mg/L；多杀菌素结晶产品纯度达到95％。

实施例3

(1)将放线菌刺糖多孢菌S078-8菌种保藏管一支接种于装有种子培养液的摇瓶内，在28℃条件下，培养3天，将该种子液接入种子罐，接种时，该罐培养基pH为8.0；(2)对种子罐装入培养基，灭菌后，接入经活化的摇瓶种子液；(3)对发酵罐装入培养基，灭菌后，冷却至28℃，按投料体积的8％移入种子液；(4)种子罐培养：在温度28℃，罐压0.6Kg/cm²，通气量1∶0.9(V/V)，搅拌速率300rpm条件下培养2天；(5)发酵罐培养：在温度28℃，罐压0.8Kg/cm²，通气量1∶1.5(V/V)，搅拌速率450rpm条件下培养10天；其间，在发酵罐发酵菌体进入对数生长期，通过控制系统自动调整搅拌转速和通气速率，维持溶氧浓度在40～45％；用显微镜检查有75％的菌丝体裂解时，终止发酵，放罐；(6)收集发酵罐发酵液，调节pH值为11；(7)将调pH值后的发酵液置于连续离心机中以17000rpm转速离心处理16min，弃去上清液，收集离心管底部的菌体固形沉淀物；(8)将所得菌体固形沉淀物用超滤水充分洗涤4次，加入与发酵液等体积的甲醇，充分搅拌混合，进行2小时的浸提，同时进行充分搅拌；(9)将甲醇浸提液置于离心机中以6000rpm转速离心处理30min，弃去菌体固形物沉淀，收集浸提上清液；(10)将浸提上清液通过减压浓缩至1/25原发酵液体积，加入与发酵液等体积的0.3mol/L酒石酸溶液，调节pH值为9，得到多杀菌素结晶沉淀；(11)将多杀菌素结晶沉淀用超滤水洗涤5次，真空干燥，即可得正丁基多杀菌素或多杀菌素衍生物产品。

所述种子罐培养基配方为：葡萄糖20g/L，大豆粉40g/L，酵母粉12g/L，硫酸镁3.0g/L，泡敌0.08wt％，灭菌前pH为9.0，灭菌后pH为8.0；

所述发酵罐培养基配方为：葡萄糖100g/L，酵母粉2.0g/L，豆饼粉10.0g/L，玉米粉8g/L，油酸甲酯100ml/L，碳酸钙6.0g/L，棉籽粉30g/L；泡敌0.08wt％，灭菌前pH为9.0，灭菌后pH为8.0。

用HPLC方法测定发酵液中多杀菌素含量，达到3890mg/L；其中正丁基多杀菌素成分含量达到2540mg/L；多杀菌素结晶产品纯度达到98％。

Claims

1.一种多杀菌素制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)将放线菌刺糖多孢菌S078-8菌种接种于装有种子培养液的摇瓶内，在28-34℃条件下，培养2-3天，将该种子液接入种子罐，接种时，该罐培养基pH为6.0～8.0；(2)对种子罐装入培养基，灭菌后，接入经活化的摇瓶种子液；(3)对发酵罐装入培养基，灭菌后，冷却至28-34℃，按投料体积的5～15％移入种子液；(4)种子罐培养：在温度28-34℃，罐压0.3-0.6Kg/cm²，通气量1∶0.7-1∶09(V/V)，搅拌速率200-300rpm条件下培养2-3天；(5)发酵罐培养：在温度28-34℃，罐压0.3-0.8Kg/cm²，通气量1∶0.4-1∶1.5(V/V)，搅拌速率200-600rpm条件下培养9～12天；用显微镜检查有60～80％的菌丝体裂解时，终止发酵，放罐，即得含多杀菌素的发酵液；

所述发酵罐培养基配方为：葡萄糖100～200g/L，酵母粉1.0～4.0g/L，豆饼粉6.0～10.0g/L，玉米粉8～12g/L，油酸甲酯25～100ml/L，碳酸钙3.0～6.0g/L，棉籽粉24～36g/L；泡敌0.02％～0.08％，，灭菌前pH为7.0～9.0，灭菌后pH为6.0～8.0。

2.如权利要求1所述的多杀菌素制备工艺，其特征在于，所述第(5)步，在发酵罐发酵菌体进入对数生长期，通过调整搅拌转速、通气速率，维持溶氧浓度在30～50％。

3.如权利要求1或2所述的多杀菌素制备工艺，其特征在于，还包括以下步骤：(1)将含多杀菌素的发酵液pH值调节为9-11；(2)将调pH值后的发酵液置于连续离心机中以12000～18000rpm转速离心处理15～in，弃去上清液，收集离心管底部的菌体固形沉淀物；(3)将所得菌体固形沉淀物用超滤水充分洗涤2～4次，加入与发酵液等体积的甲醇，充分搅拌混合，进行2～3小时的浸提，同时进行充分搅拌；(4)将甲醇浸提液置于离心机中以6000～8000rpm转速离心处理15～30min，弃去菌体固形物沉淀，收集浸提上清液；(5)将浸提上清液通过减压浓缩至1/10～1/30原发酵液体积，加入与发酵液等体积的0.1～0.3mol/L酒石酸溶液，调节pH值为9-11，得到多杀菌素结晶沉淀；(6)将多杀菌素结晶沉淀用超滤水洗涤3～5次，真空干燥，即得多杀菌素结晶产品。