CN103849661A - 一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法 - Google Patents
一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法。即以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CGMCCNo.2.630为菌种，以蓖麻油为底物，外加猪胰脂肪酶，在有氧条件下，通过批发酵或分批补料发酵的方法制备γ-癸内酯，本发明的天然香料γ-癸内酯的发酵方法降低了蓖麻油转化天然γ-癸内酯的转化周期、提高了蓖麻油转化天然γ-癸内酯的转化率及最终产物γ-癸内酯的产率，蓖麻油的生物转化周期仅为12h～30h、蓖麻油转化率可达95%，γ-癸内酯的生物合成效率可达94.9%，特别是本发明在5L发酵罐上，最终的γ-癸内酯的产率，批发酵可达4.81g/L，分批补料发酵可达6.50g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，特别涉及一种采用可代谢蓖麻油为γ-癸内酯的，本实验室购买的菌种，该菌种现保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC）为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），CGMCC编号为cgmcc 2.630，并通过与外加猪胰脂肪酶的协同作用来进行发酵，生物发酵制备天然香料γ-癸内酯的方法。
背景技术
γ-癸内酯（γ-decalactone，GDL）在标准大气压下沸点为281℃，为无色至淡黄色澄清液体呈愉快桃子和椰子香气，易溶于有机溶剂。γ-癸内酯不仅存在于桃子，椰子，芒果等水果中，也是乳制品的特征呈味物质之一，迄今为止已经在上百种食物的香气成份中发现了γ-癸内酯。
天然γ-癸内酯以其诱人的香气和低香气阈值（水中0.08mg/kg）特征广泛应用于日用香精和食用香精中。在成熟的果子中，含量约为15ppb，其中89%是(R)-异构体，11%是(S)-异构体，研究表明左旋的S型γ-癸内酯香气较为柔和，有令人愉悦的椰奶味香气特征。右旋R型γ-癸内酯为强烈的酯甜水果味类似椰子味。
天然γ-癸内酯除源于植物、果实提取，采用微生物转化或发酵的方法成为极具工业化前景的技术手段，目前天然γ-癸内酯采用的原料多选用廉价易得的蓖麻油，辅助碳源一般采用葡萄糖或蔗糖等糖类物质。在该生物发酵体系中，蓖麻油一般作为油相存在于水相，易形成水包油现象。单独依靠酵母菌自身完成解脂化效果差，从而进一步影响酵母菌合成γ-癸内酯代谢反应中的β氧化过程和内酯化过程，造成产物的生物转化周期长，一般为60～200h、蓖麻油转化不完全，其转化率为10～80%，并且最终产物γ-癸内酯的生物合成效率低，仅为60%左右等不良结果。因此，消除蓖麻油转化过程瓶颈，需要对解脂化过程、β氧化过程和内酯化过程进行高度协调，从而达到目标产物γ-癸内酯的高效转化。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述的生物发酵生产γ-癸内酯过程中，蓖麻油的生物转化周期长、蓖麻油转化不完全以及最终产物γ-癸内酯的生物合成效率低等技术问题而提供了一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，即以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为菌种，加入外源性猪胰脂肪酶进行偶联反应的转化方式，以提高蓖麻油的解脂过程，从而降低蓖麻油的生物转化周期，本发明的蓖麻油的生物转化周期仅为12～30h、蓖麻油转化率可达95.0%，最终产物γ-癸内酯的生物合成效率可达94.9%。
本发明的技术方案
一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，即以酿酒酵母CGMCC No. 2.630为菌种，以蓖麻油为底物，外加猪胰脂肪酶，在有氧的条件下，通过批发酵或分批补料发酵的方法得到天然香料γ-癸内酯；
所述的批发酵或分批补料发酵具体包括如下步骤：
（1）、菌种的选取
即以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为菌种，其保藏编号为CGMCC No. 2.630；
（2）、培养基配制
①、斜面培养基
所述的斜面培养基按每升计算，由10g葡萄糖、12g酵母膏、10g黄豆饼粉、4gNaCl、5gCaCO3、20g琼脂和余量的去离子水组成，pH自然，0.1 MPa,即121℃灭菌30min备用；
②、种子培养液培养基
按每升计算，由1.0g的蓖麻油、20g的葡萄糖、 1.5g的(NH4)2HPO4、3.2g的KH2PO4、1.5g的K2HPO4·3H2O、4.0g的MgSO4·7H2O、3.0g的NaCl、15.0g的酵母膏和余量的水组成，pH自然
③、发酵培养基
所用发酵培养基按每升计算，由10～30g的蓖麻油、0.1～20g的葡萄糖、 0.1～3.5g的(NH4)2HPO4、0.5～3.0g的KH2PO4、0.1～2.5g的K2HPO4·3H2O、0.5～3.0g的MgSO4·7H2O、1.0～7.0g的NaCl、1～20g的酵母膏、0.1～2.0g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然；
④、发酵过程所用的补料培养基
发酵过程所用的补料培养基为蓖麻油，其用量按其与发酵培养基重量比计算，即发酵过程所用的补料培养基为发酵培养基的0.1～2.0%；
（3）、斜面种子培养
往茄子瓶中装入40mL斜面培养基，0.1MPa，即121℃灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的酿酒酵母 CGMCC No.2.630甘油管中取2mL液体菌，在斜面培养基上划线接种，28℃培养24～32h得斜面菌；
（4）、摇瓶种子培养
将步骤（3）所得的斜面菌，用消毒好的接种铲取1cm*2cm大小接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于摇床上控制转速为200-300r/min，温度为28℃培养24h得到种子液；
（5）、发酵罐培养
按2%接种量将步骤（4）所得的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在有氧条件下进行批发酵或分批补料发酵；
所述的批发酵，即控制转速为200-800r/min，温度28～36℃，优选为30℃，pH自然，培养10～30h，发酵结束；
所述的分批补料发酵，即控制转速为200-800r/min，温度控制在28～36℃，优选为30℃，pH自然，培养10～18h后，无菌状态下一次性加入补料培养基，继续控制转速200-800r/min，温度在28～36℃，优选为30℃，再培养8～18h，发酵结束；
所述的有氧条件下，即发酵过程中控制通气速率与发酵液体积的比为0.3-1.5V/V.min。
上述发酵结束后，按体积比计算，即发酵液：乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡1min，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料γ-癸内酯。
本发明的有益效果
本发明的一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，由于以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No. 2.630为菌种，加入外源性猪胰脂肪酶进行偶联反应的转化方式，从而提高了蓖麻油的解脂过程，从而降低了蓖麻油转化天然γ-癸内酯的转化周期、提高了蓖麻油转化天然γ-癸内酯的转化率及最终产物的γ-癸内酯的产率，蓖麻油的生物转化周期仅为12h～30h、蓖麻油转化率可达95.0%，最终产物γ-癸内酯的生物合成效率可达94.9%，特别是本发明在5L发酵罐上发酵20h结束后,最终的γ-癸内酯的产率批发酵可达4.81g/L。
进一步，采用本发明的一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，以分批补料发酵控制的方式，γ-癸内酯的产量比批发酵提高了35.1%，最终的γ-癸内酯产率在5L发酵罐上达到6.50g/L。
进一步，本发明的一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法与产物γ-癸内酯的原位分离技术联合使用，亦可有效解除产物γ-癸内酯对体系产生的抑制，进一步提高γ-癸内酯的产量。
综上所述，本发明的一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，偶联外源性猪胰脂肪酶添加，将酵母菌发酵γ-癸内酯的解脂反应、β-氧化和内酯化反应高效关联，经过多批实验证实了该方法的可行性和稳定性。此外，本发明的天然香料γ-癸内酯的发酵方法，其操作可控性强，生产成本低，具有良好的工业化应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
1、本发明的各实施例中发酵所用的种子液通过如下方式获得：
（1）、斜面种子培养
往茄子瓶中装入40 mL斜面培养基，0.1MPa，即121℃灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的酿酒酵母 CGMCC No.2.630甘油管中取2mL液体菌，在斜面培养基上划线接种，28℃培养24～32h得斜面菌；
所述的斜面培养基按每升计算，由10g葡萄糖、12g酵母膏、10g黄豆饼粉、4gNaCl、5gCaCO3、20g琼脂和余量的去离子水组成，pH自然，0.1MPa,即121℃灭菌30min备用；
（2）、发酵所用种子液的制备
将所得的斜面菌，用消毒好的接种铲取1cm*2cm大小的斜面菌接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于摇床上控制转速为200-300r/min，温度为28℃培养24h得到种子液；
所述的种子培养基按每升计算，由1.0g的蓖麻油、20g的葡萄糖、 1.5g的(NH4)2HPO4、3.2g的KH2PO4、1.5g的K2HPO4·3H2O、4.0g的MgSO4·7H2O、3.0g的NaCl、15.0g的酵母膏和余量的水组成，pH自然。
2、本发明的各实施例中所得的发酵液中γ-癸内酯的含量采用气相分析法，所用仪器为气相色谱仪，即安捷伦6890N，美国安捷伦科技有限公司生产，色谱柱为HP-5柱（30mX0.321mmX0.25μm）；
分析步骤如下：
所得的发酵液加入1:1的乙酸丁酯旋转震荡1min然后进行离心，4000r/min，离心10min，离心后的上清液再用0.22μm 有机相微孔滤膜过滤处理，所得的滤液用于分析；
分析条件为：
进样口T：250℃；检测器T：300℃；进样量：0.1μL；分流比：30:1；色谱柱N2恒流：0.8mL/min；程序升温：100℃保持2min后以20℃/min速率升温到205℃，然后以4℃/min升高到215℃，然后以20℃/min升高的280℃，保持2min。
3、蓖麻油转化率=转化的蓖麻油的量/原料的总量*100%
γ-癸内酯的生物合成效率=γ-癸内酯实际生成量/γ-癸内酯理论生成量*100%
实施例1
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由20g的蓖麻油、10g的葡萄糖、10.0g的酵母膏、0.1g的(NH4)2HPO4、0.5g的KH2PO4、2.5g的K2HPO4·3H2O、1.2g的MgSO4·7H2O、7.0g的NaCl、0.1g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121℃高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25℃下接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为32℃，转速为200r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
发酵结束后，按体积比计算，即发酵液：乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡1min，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料γ-癸内酯。
上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的γ-癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量为1.69g/L。
实施例2
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由10g的蓖麻油、20g的葡萄糖、20g的酵母膏、3.5g的(NH4)2HPO4、3.0g的KH2PO4、1.2g的K2HPO4·3H2O、3.0g的MgSO4·7H2O、3.5g的NaCl、2.0g的脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121℃高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25℃的条件下接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为36℃，转速为300r/min，恒温培养30h后发酵结束。
发酵结束后，按体积比计算，即发酵液：乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡1min，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料γ-癸内酯。
上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的γ-癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量为1.51.g/L。
实施例3
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由30g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、1g的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4、1.5g的KH2PO4、0.1g的K2HPO4·3H2O、0.5g的MgSO4·7H2O、1.0g的NaCl、1.5g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121℃高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25℃条件下按接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为30℃，转速为250r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
发酵结束后，按体积比计算，即发酵液：乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡1min，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料γ-癸内酯。
上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的γ-癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量为2.15g/L。
实施例4
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由15g的蓖麻油、5.8g的葡萄糖、1g的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4、2.4g的KH2PO4、0.8g的K2HPO4·3H2O、0.9g的MgSO4·7H2O、1.0g的NaCl、1.5g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121℃高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25℃条件下按接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为28℃，转速为200r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
发酵结束后，按体积比计算，即发酵液：乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡1min，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料γ-癸内酯。
上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的γ-癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量为2.32g/L。
实施例5
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由15g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、1g的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4、1.5g的KH2PO4、0.1g的K2HPO4·3H2O、0.5g的MgSO4·7H2O、1.0g的NaCl、0.9g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121℃高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25℃条件下按接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为30℃，转速为250r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
发酵结束后，按体积比计算，即发酵液：乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡1min，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料γ-癸内酯。
上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的γ-癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量为3.00g/L。
对照实施例
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由15g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、1g的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4、1.5g的KH2PO4、0.1g的K2HPO4·3H2O、0.5g的MgSO4·7H2O、1.0g的NaCl、0g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121℃高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25℃的条件下接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为30℃，转速为250r/min，恒温培养30h后发酵结束。
发酵结束后，按体积比计算，即发酵液：乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡1min，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用0.22μm的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料γ-癸内酯。
上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的γ-癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量为0.60g/L。
上述实施例1、2、3、4、5中的发酵培养基中分别添加了不同含量的猪胰脂肪酶，而对照实施例的发酵培养基中没有添加猪胰脂肪酶，通过最终发酵液中的天然香料γ-癸内酯的产量进行对比，具体见下表：
通过上表中实施例5和对照实施例进行对比，可以看出，在同等发酵条件下，对于发酵培养基中加入猪胰脂肪酶后，最终发酵液中γ-癸内酯的产量是发酵培养基中没有加入猪胰脂肪酶的γ-癸内酯的产量的5倍，由此表明了发酵培养基中加入猪胰脂肪酶，对于提高γ-癸内酯产量的效果是非常明显。
实施例6
批发酵制备天然香料γ-癸内酯：
5L发酵罐发酵培养基按每升计算，其由15g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、1g的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4、1.5g的KH2PO4、0.1g的K2HPO4·3H2O、0.5g的MgSO4·7H2O、1.0g的NaCl、0.9g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的发酵培养基按发酵罐体积的70%的量装入到发酵罐中，本实施例中将3.5L上述的发酵培养基装入5L机械搅拌发酵罐（NBS BIOFLO 3000型机械搅拌发酵罐）中，121℃高压蒸汽灭菌20min，于火焰保护下接入2%种子液，然后控制温度为30℃，转速为200～800r/min，pH自然,发酵培养20h，发酵过程的通气速率与发酵液体积的比为1.2V/V·min。
于发酵过程20h取发酵液进行气相色谱分析，结果表明发酵20h后，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量分别为4.81g/L。
实施例7
分批补料发酵制备天然香料γ-癸内酯：
5L发酵罐发酵培养基按每升计算，其由10g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、1.0g的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4、1.5g的KH2PO4、0.1g的K2HPO4·3H2O、0.5g的MgSO4·7H2O、1.0g的NaCl、0.9g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
将上述的发酵培养基按发酵罐体积的70%的量装入到发酵罐中，本实施例中将3.5L上述的发酵培养基装入5L机械搅拌发酵罐（NBS BIOFLO 3000型机械搅拌发酵罐）中，121℃高压蒸汽灭菌20min，于火焰保护下接入2%种子液，然后控制温度为30℃，转速为200～800r/min，pH自然,发酵培养12h后，一次性无菌状态下补加5g/L的蓖麻油后，继续控制转速为200-800r/min，温度在30℃再培养8h，发酵过程控制通气速率与发酵液体积的比为1.2V/V·min。
于发酵12h和20h分别取发酵液进行气相色谱分析，结果表明发酵12h和20h后，发酵液中天然香料γ-癸内酯的产量分别为2.60g/L和6.50g/L。
通过上述实施例可知，对γ-癸内酯发酵过程所用的蓖麻油，利用分批补料的方式，如实施例7，最终所得γ-癸内酯的产量比一次性加入到培养基中的批发酵方式,如实施例6提高了35.1%，由此表明分批补料发酵的方式可进一步提高γ-癸内酯的产量。
另外，结合原位分离方法，可以进一步解除γ-癸内酯对其生物转化过程产生的抑制作用，从而可进一步提高γ-癸内酯的产量。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，其特征在于以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No. 2.630为菌种，以蓖麻油为底物，外加猪胰脂肪酶，在有氧的条件下，通过批发酵或分批补料发酵的方法生成天然香料γ-癸内酯；
上述的批发酵或分批补料发酵的方法中：
所用发酵培养基按每升计算，由10～30g的蓖麻油、0.1～20g的 葡萄糖、0.1～3.5g的(NH4)2HPO4、0.5～3.0g的KH2PO4、0.1～2.5g的K2HPO4·3H2O、0.5～3.0g的MgSO4·7H2O、1.0～7.0g的NaCl、1～20g的酵母膏、0.1～2.0g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然；
所用补料培养基为蓖麻油,其用量按其与发酵培养基重量比计算，即发酵过程所用的补料培养基为发酵培养基的0.1～2.0%；
所述的批发酵或分批补料发酵的方法，其发酵过程中，控制参数如下：
批发酵控制转速为200-800r/min，温度28～36℃，pH自然，培养10～30h，发酵结束；
分批补料发酵控制转速为200-800r/min，温度控制在28～36℃，pH自然，培养12～30h后，一次性在无菌状态下加入0.1～2.0%的蓖麻油，继续控制转速为200-800r/min，温度在28～36℃，再培养8～18h，发酵结束。
2.如权利要求1所述的一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，其特征在于所述的批发酵或分批补料发酵具体包括如下步骤：
（1）、菌种的选取
即以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保藏编号为CGMCC No. 2.630的甘油管为菌种；
（2）、培养基配制
①、斜面培养基
所述的斜面培养基按每升计算，由10g葡萄糖、12g酵母膏、10g黄豆饼粉、4gNaCl、5gCaCO3、20g琼脂和余量的去离子水组成，pH自然，0.1 MPa,即121℃灭菌30min备用；
②、种子培养基
所述的种子培养基，按每升计算，由1.0g的蓖麻油、20g的葡萄糖、1.5g的(NH4)2HPO4、3.2g的KH2PO4、1.5g的K2HPO4·3H2O、4.0g的MgSO4·7H2O、3.0g的NaCl、15.0g的酵母膏和余量的水组成，pH自然；
③、发酵培养基
所述的发酵培养基，按每升计算，由10～30g的蓖麻油、0.1～20g的葡萄糖、0.1～3.5g的(NH4)2HPO4、0.5～3.0g的KH2PO4、0.1～2.5g的K2HPO4·3H2O、0.5～3.0g的MgSO4·7H2O、1.0～7.0g的NaCl、1～20g的酵母膏、0.1～2.0g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然；
④、发酵过程所用的补料培养基
发酵过程所用的补料培养基为蓖麻油，其用量按其与发酵培养基重量比计算，即发酵过程所用的补料培养基为发酵培养基的0.1～2.0%；
（3）、斜面种子培养
往茄子瓶中装入40mL斜面培养基，0.1MPa，即121℃灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） CGMCC No.2.630甘油管中取2mL液体菌，在斜面培养基上划线接种，28℃培养24～32h得斜面菌；
（4）、摇瓶种子培养
将步骤（3）所得的斜面菌，用消毒好的接种铲取1cm*2cm大小的斜面菌接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于摇床上控制转速为200-300r/min，温度为28℃培养24h得到种子液；
（5）、发酵罐培养
按2%接种量将步骤（4）所得的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在有氧条件下进行批发酵或分批补料发酵；
所述的批发酵，控制转速为200-800r/min，温度28～36℃，pH自然，培养10～30h发酵结束；
所述的分批补料发酵，控制转速为200-800r/min，温度控制在28～36℃，pH自然，培养10～30h后，在无菌状态下一次性加入补料培养基后，继续控制转速为200-800r/min，温度在28～36℃，再培养8-18h，发酵结束。
3.如权利要求1或2所述的一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，其特征在于所述的有氧条件下，即发酵过程控制通气速率与发酵液体积的比为0.3-1.5V/V.min。
4.如权利要求1或2所述的一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法，其特征在于步骤（5）所述的批发酵，控制转速为200-800r/min，温度控制在28～36℃，pH自然，培养10～30h，发酵结束；
所述的分批补料发酵，控制转速为200-800r/min，温度控制在28～36℃，pH自然，培养10～30h后，在无菌状态下一次性加入补料培养基后，继续控制转速为200-800r/min，温度28～36℃，再培养8～18h，发酵结束。
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