CN104263689B - 一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，涉及一种菌株的驯化方法。热带醋杆菌CHM061701保藏号CGMCC NO.9417。将热带醋杆菌接种至葡萄糖琼脂培养基平板中培养；取较大的单菌落转接至氮源优化琼脂培养基平板中培养，反复转接培养，取较大的单菌落转接至甘油优化琼脂培养基平板中培养；在甘油优化琼脂培养基平板中反复转接培养，取较大的单菌落转接至一级种子葡萄糖液体培养基中培养，得一级种子液；将一级种子液转接至二级种子葡萄糖液体培养基中培养，得二级种子液；将二级种子液转接至发酵培养基中培养，发酵结束后测定发酵液中甘油酸的含量；将获得的甘油酸驯化菌株经连续传代稳定性考察，获得经驯化的菌株。

Description

一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法
技术领域
本发明涉及一种菌株的驯化方法，尤其是涉及一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法。
背景技术
甘油酸可由醋酸杆菌发酵产生，相关报道很少。最早是由1987年12月25日发表的一篇日本专利(JP0751069，Daicel Chemical Industries)报道的，该专利用Gluconobacter cerinus IFO3262经过两天的发酵，将100g/L甘油转化成57g/L D-甘油酸。而后在1994年一篇关于Gluconobacter oxydans菌株转化甘油为二羟基丙酮的文献中，提到了副产物为甘油酸(Juraj Svitel,Ernest Sturdik.1994)。2009年以来，日本Habe教授课题组发表了一系列醋酸杆菌发酵产甘油酸的研究成果(Hiroshi Habe,etc.2009)。国内暂无醋酸杆菌发酵产甘油酸的相关报道。
甘油酸作为一种植物化学成分被发现于一些植物中，如花生、朝鲜蓟叶子、番茄、香蕉、苹果、蚕豆、葡萄等，其中所含甘油酸的对映体组成及其浓度仍是未知。在马、牛、猪、鼠、兔等动物的肝脏中检测出的甘油酸，主要以D-甘油酸的形式存在，是丝氨酸合成的前体(Akira Ichihara,David M.Greenberg.1957)。在人体中也检测出了D-甘油酸，是果糖分解的中间代谢产物。
在人体内存在的D-甘油酸具有促进乙醇和乙醛分解代谢的功能，该功能已在大鼠身上得到证实(Eriksson,etc.2007)。P·海诺在2003年发表的专利中阐述了D-甘油酸作为解酒药的作用机理：将D-甘油酸和酒精同时注入体内，可加速酒精排出体外。酒精在氧化的过程中会产生过量的NADH-乙醛脱氢酶和NADH-酒精脱氢酶复合物。在这两种NADH-复合物的催化作用下，D-甘油酸在酒精代谢组织细胞中会转化为D-甘油醛，再进一步转化为甘油，同时NADH-复合物脱氢转化为NAD-乙醛脱氢酶和NAD-酒精脱氢酶复合物，新生成的NAD-复合物又恢复了氧化酒精的能力，从而加快酒精代谢。D-甘油酸促进乙醛进一步氧化为乙酸的同时，可能能够最大限度地减少乙醛的毒性作用(P.海诺.D-甘油酸或其盐用于制备增强酒精代谢的药物制剂的用途[P].中华人民共和国:200380101412.4,2009)。因此，若能大量生产D-甘油酸或其盐或酯类，用于制备增强酒精代谢的解酒药，不仅能提高它的解酒疗效，而且将带来更大的利润。
有研究表明，从朝鲜蓟叶子中提取出的甘油酸在狗体内具有胆固醇活性和肝兴奋剂功能。甘油酸衍生出的酯类低聚物能表现出抗胰蛋白酶活性(K Lesová,etc.2001)，由于其生物可降解性优于乳酸低聚物，也可能运用于药物运输系统，如制备含有药物的微球粒(Wada,R.,S.-H.Hyon,and Y.Ikada.1996)。
醋酸杆菌是嗜酸性、运动型、好氧的革兰氏阴性菌，在显微镜下呈短杆状，长0.8～4.5μm，宽0.4～1μm，带有周鞭毛或者极鞭毛，不形成孢子，排列方式有：单个、成对、成链状或成簇聚集。在有氧条件下，氧气作为最终的电子受体；在厌氧或低浓度氧的不利条件下，替代氧气的电子受体会降低菌体代谢速率，从而保证菌体生存。醋酸杆菌的最适生长温度是28～30℃，最适pH范围是5～6.5，在pH低于4时仍能存活。一些种类的醋酸杆菌在固体培养基上能产生色素和多种多糖(Dhouha Mamlouk·Maria Gullo.2013)。
发明内容
本发明的目的在于提供一株热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701。
本发明的另一目的在于提供一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法。
所述热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701，已于2014年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，该保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.9417。
所述用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，包括以下步骤：
1)将甘油酸生产菌热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701接种至葡萄糖琼脂培养基平板中培养；
2)取葡萄糖琼脂培养基平板上较大的单菌落，转接至氮源优化琼脂培养基平板中培养；
3)在氮源优化琼脂培养基平板中反复转接培养；
4)取氮源优化琼脂培养基平板上较大的单菌落，转接至甘油优化琼脂培养基平板中培养；
5)在甘油优化琼脂培养基平板中反复转接培养；
6)取甘油优化琼脂培养基平板上较大的单菌落，转接至一级种子葡萄糖液体培养基中培养，得一级种子液；
7)将一级种子液转接至二级种子葡萄糖液体培养基中培养，得二级种子液；
8)将二级种子液转接至发酵培养基中培养，发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中甘油酸的含量；
9)将获得的甘油酸驯化菌株经连续传代稳定性考察，获得经驯化的用于生产甘油酸的热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701。
在步骤1)中，所述葡萄糖琼脂培养基的组成可为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，琼脂15～20g/L，pH 6-7；所述培养的温度可为28～30℃，培养的时间为2～5d。
在步骤2)中，所述氮源优化琼脂培养基的组成可为甘油1～10g/L，酵母粉0.5～2g/L，蛋白胨0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，琼脂15～20g/L，pH 6～7；所述培养的温度可为28～30℃，培养的时间为2～5d。
在步骤3)中，所述反复转接可转接3～5次；所述培养的温度可为28～30℃，培养的时间为2～5d。
在步骤4)中，所述甘油优化琼脂培养基的组成可为甘油10～200g/L，酵母粉0.5～2g/L，蛋白胨0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，琼脂15～20g/L，pH 6-7；所述培养的温度可为28～30℃，培养的时间为2～5d。
在步骤5)中，所述反复转接可转接3～5次；所述培养的温度可为28～30℃，培养的时间为2～5d。
在步骤6)中，所述转接的接种量可为5％～10％；所述葡萄糖液体培养基的组成可为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，pH 6-7；所述培养的条件可为28～30℃，100～200rpm，培养1～4d。
在步骤7)中，所述转接的接种量可为5％～10％；所述培养的条件可为28～30℃，100～200rpm，培养1～4d。
在步骤8)中，所述发酵培养基的组成可为甘油100～200g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，KH2PO3 0.1～2g/L，K2HPO3 0.1～2g/L，pH 6～7；所述转接的接种量可为5％～10％；培养的温度可为28～30℃，转速为100～200rpm，培养的时间可为3～7d。
在步骤9)中，所述连续传代可经5次连续传代。
本发明的技术方案是以热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701为出发菌，以甘油、酵母粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O、琼脂粉作为培养基的主要原料，应用于菌株驯化工作。
经试验，本发明驯化后所得的菌株摇瓶发酵生物量达到2～5g/L，甘油酸产量达到7～13g/L，相对原始菌株生物量提高了104％，甘油酸产量提高了69.0％。目前暂无通过驯化提高醋酸杆菌的甘油酸产量的相关报道，该方法简便、成本低，可进行连续驯化，对于Acetobacter tropicalis CHM061701的甘油酸生产能力有显著的提高。甘油酸作为一种具有高附加值的甘油衍生物，可制备解酒药等，具有很好的商业前景，菌株驯化方法具有显著的经济和社会意义。
附图说明
图1为甘油酸标准品的HPLC图。在图1中，横坐标为时间/min；峰10.023min相应的峰面积为2070650。
图2为发酵液样品的HPLC图。在图2中，横坐标为时间/min；峰9.994min相应的峰面积为169290。
图3为实施例1中驯化后的甘油酸生产菌在初始甘油浓度为200g/L的液体发酵培养基中生产甘油酸的曲线。在图3中，横坐标为时间(h)，纵坐标分别为pH值、生物量、残余甘油浓度(g/L)及甘油酸产量(g/L)。
图4为实施例2中驯化菌株的5次连续传代稳定性研究。在图4中，横坐标为传代次数，纵坐标为甘油酸的浓度(g/L)。
图5为实施例3中甘油酸生产菌在初始甘油浓度为100g/L的液体发酵培养基中生产甘油酸的曲线。在图5中，横坐标为时间(h)，纵坐标分别为pH值、生物量、残余甘油浓度(g/L)及甘油酸产量(g/L)。
图6为实施例4中甘油酸生产菌在初始甘油浓度为150g/L的液体发酵培养基中生产甘油酸的曲线。在图6中，横坐标为时间(h)，纵坐标分别为pH值、生物量、残余甘油浓度(g/L)及甘油酸产量(g/L)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作详细说明。
实施例1
将热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701接种于葡萄糖琼脂培养基，组成为：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，琼脂15g/L，pH 6.5。30℃培养3d。
取葡萄糖琼脂培养基中较大的单菌落于氮源优化琼脂培养基中划线，氮源优化琼脂培养基组成为：甘油10g/L，酵母粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，琼脂15g/L，pH 6.5。30℃培养3d。
取氮源优化琼脂培养基中较大的单菌落于甘油优化琼脂培养基中划线，甘油优化琼脂培养基组成为：甘油50、100、120、150、180、200、220、250g/L，酵母粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，琼脂15g/L，pH 6.5。30℃培养3d。
取甘油优化琼脂培养基中较大的单菌落于一级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；再转接至二级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；最后转接入发酵培养基中，30℃、200rpm培养5d；发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中甘油酸的含量；其中，葡萄糖液体培养基组成为：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH6.5；发酵培养基组成为：甘油200g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO30.9g/L，K2HPO3 0.1g/L，pH 6.5。取1mL甘油酸生产菌株发酵液加入离心管，10000rpm离心5min，取上清液，离心3次，上清液用0.22μm过滤器过滤，滤液用于HPLC。
HPLC流动相：5mM H2SO4；色谱条件：色谱柱：Shodex SH1011；柱温：50℃；检测器：示差检测器；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。
经过以上色谱条件测定，驯化后甘油酸生产菌株发酵液中甘油酸的产量为7～13g/L，其甘油酸生产能力较驯化前提高了69.0％；同时，驯化后发酵液中生物量为2～5g/L，较驯化前提高了104％(参见图1～3)。
实施例2
将实施例1获得的热带醋杆菌经过5次连续传代，每次传代后接入一级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；再转接至二级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；最后转接入摇瓶发酵培养基中，30℃，200rpm培养5d；发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中甘油酸的含量，考察菌株的稳定性；其中，葡萄糖液体培养基组成为：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH 6.5；发酵培养基组成为：甘油150g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO3 0.9g/L，K2HPO3 0.1g/L，pH 6.5。根据实施例1提供的色谱条件，测得发酵液中甘油酸产量为5.0～20.0g/L。其稳定性考察情况见图4。
实施例3
将实施例1获得的热带醋杆菌接入一级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；再转接至二级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；最后转接入摇瓶发酵培养基中，30℃，200rpm培养5d；发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中甘油酸的含量；其中，葡萄糖液体培养基组成为：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH6.5；发酵培养基组成为：甘油100g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO30.9g/L，K2HPO30.1g/L，pH 6.5。根据实施例1提供的色谱条件，测得发酵液中甘油酸产量为6.2g/L。其生产曲线见图5。
实施例4
将实施例1获得的热带醋杆菌接入一级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；再转接至二级种子葡萄糖液体培养基中，30℃、200rpm培养1d；最后转接入摇瓶发酵培养基中，30℃，200rpm培养5d；发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中甘油酸的含量；其中，葡萄糖液体培养基组成为：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH6.5；发酵培养基组成为：甘油150g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO30.9g/L，K2HPO30.1g/L，pH 6.5。根据实施例1提供的色谱条件，测得发酵液中甘油酸产量为6.9g/L。其生产曲线见图6。

Claims (11)

1.热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701，已于2014年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.9417。
2.一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将如权利要求1所述热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701接种至葡萄糖琼脂培养基平板中培养；所述葡萄糖琼脂培养基的组成为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，琼脂15～20g/L，pH 6-7；
2)取葡萄糖琼脂培养基平板上较大的单菌落，转接至氮源优化琼脂培养基平板中培养；所述氮源优化琼脂培养基的组成为甘油1～10g/L，酵母粉0.5～2g/L，蛋白胨0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，琼脂15～20g/L，pH 6-7；
3)在氮源优化琼脂培养基平板中反复转接培养；
4)取氮源优化琼脂培养基平板上较大的单菌落，转接至甘油优化琼脂培养基平板中培养；所述甘油优化琼脂培养基的组成为甘油10～200g/L，酵母粉0.5～2g/L，蛋白胨0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，琼脂15～20g/L，pH 6～7；
5)在甘油优化琼脂培养基平板中反复转接培养；
6)取甘油优化琼脂培养基平板上较大的单菌落，转接至一级种子葡萄糖液体培养基中培养，得一级种子液；所述葡萄糖液体培养基的组成为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，pH 6-7；
7)将一级种子液转接至二级种子葡萄糖液体培养基中培养，得二级种子液；
8)将二级种子液转接至发酵培养基中培养，发酵结束后，通过HPLC测定发酵液中甘油酸的含量；所述发酵培养基的组成为甘油100～200g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，KH2PO3 0.1～2g/L，K2HPO3 0.1～2g/L，pH 6～7；
9)将获得的甘油酸驯化菌株经连续传代稳定性考察，获得经驯化的用于生产甘油酸的热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701。
3.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的温度为28～30℃，培养的时间为2～5d。
4.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养的温度为28～30℃，培养的时间为2～5d。
5.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤3)中，所述反复转接是转接3～5次；所述培养的温度为28～30℃，培养的时间为2～5d。
6.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤4)中，所述培养的温度为28～30℃，培养的时间为2～5d。
7.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤5)中，所述反复转接是转接3～5次；所述培养的温度为28～30℃，培养的时间为2～5d。
8.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤6)中，所述转接的接种量为5％～10％；所述培养的条件为28～30℃，100～200rpm，培养1～4d。
9.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤7)中，所述转接的接种量为5％～10％；所述培养的条件为28～30℃，100～200rpm，培养1～4d。
10.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤8)中，所述转接的接种量为5％～10％；培养的温度为28～30℃，转速为100～200rpm，培养的时间为3～7d。
11.如权利要求2所述一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法，其特征在于在步骤9)中，所述连续传代是经5次连续传代。
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