CN101838614B - 一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用 - Google Patents
一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用，涉及一种微生物菌株及其获取方法。所述一种虾青素生产菌株为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变菌株N1806-04。以红法夫酵母为出发菌株，采用酶法制备红法夫酵母原生质体，再通过NTG诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得虾青素生产菌株，连续传代5次后虾青素的产量稳定。将该虾青素生产菌株用发酵罐放大培养，其虾青素产量和含量分别可达500～600mg/L和5000～6300mg/kg(细胞干重)，生物量可达80～110g/L。虾青素产量和含量以及对应的生物量都满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物菌株及其获取方法，尤其是涉及一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用。
背景技术
虾青素，又名虾黄素、虾黄质、龙虾壳色素等，天然呈紫红色，它广泛存在于生物界中，特别是存在于甲壳类动物及鲑鱼、虹鳟鱼等中，是它们的主要色素(1、Johnson E A，An G H.Anstaxanthin from microbial sources.Critical Reviews in Biotechnology，1991，11：297-326；2、Torrissen O J，Christiansen R.Requirenents for carotenoids in fish diets.J Appl Ichthyol.，1995，11：225-230；3、Pharmaceuticals M.AquaxanTM HD algal meal use in aquaculture diets：Enhancingnutritional performance and pigmentation.Inc.Technical Report TR，1999，2102.001)。其化学名称为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，分子式是C40H52O4。虾青素最初被用作水产业的饲料添加剂，后来人们发现它具有极强的抗氧化活性、增强机体免疫力活性及抗肿瘤活性，在食品、医药和化妆品等领域中有着广阔的应用前景(4、Jyonouchi H，Zhang L，Gross M，Tomita Y.Immunomodulating actions of carotenoids：enhancement of in vivo and in vitro antibodyproduction to T-dependent antigens.Nutrition Cancer，1994，21(1)：47-58；5、Lorenz R T，Cysewski G R.Commercial potential for Heamatococcus microalgae as a natural source ofastaxanthin.Trends in biotechnology，2000，18：160-167)。它作为饲料添加剂除了可以提供动物鲜艳的色泽和促进生长繁殖外，还可极大地促进水产动物的生长繁殖，提高动物产品的市场价值(6、Johnson E A，An G H.Anstaxanthin from microbial sources.Critical Reviews inBiotechnology，1991，11：297-326；7、Torrissen O J，Christiansen R.Requirenents for carotenoidsin fish diets.J Appl Ichthyol.，1995，11：225-230；8、Hansen K B，Tauson A H，Inborr J.Effect ofsupplementation with the antioxidant astaxanthin on reproduction，pre-weaning growthperformance of kits and daily milk intake in mink.J Reprod Fertile Suppl.，2001，57：331-334)。比如，在家禽饲料中添加虾青素，可促进家禽的生长，同时使蛋黄色素含量增加(9、ElwingerK，Lignell A，Wilhelmson M.Astaxanthin rich algae(Heamacoccus Pluvialis)as a carotenoidsource in feed for laying hens.In procceding of the VII European symposium on the quality of eggsand eggs products，Poznan，Poland，52-59)。它可以作为着色剂添加于果酱、果冻、饮料、水产品和肉制品等食物，对于食品尤其含脂类较多的食品，既有着色效果又起到保鲜作用。在化妆品中添加虾青素，可以起到抗衰老、防紫外线的效果(10、Hansen K B，Tauson A H，InborrJ.Effect of supplementation with the antioxidant astaxanthin on reproduction，pre-weaning growthperformance of kits and daily milk intake in mink.J Reprod Fertile Suppl.，2001，57：331-334；11、Anderson M.Method of inhibiting 5α-reductase with astaxanthin，US Patent，2001，Patent No.：US 6277417；12、Kurihara H，Koda H，Asami S，Kiso Y，Tanaka T.Contribution of theantioxidative property of astaxanthin to its protective effect on the promotion of cancer metastasisin mice treated with restraint stress.Life Sdci.，2002，70(21)：2509-2520；13、Jewell C，O’Brien N.Effects of dietary supplementation with carotenoids on xenobiotic metabolizing enzymes in theliver，lung，kidney and small intestine of the rat.Br.J.Nutr.，1999，81：235-342；14、Jyonouchi H，Sun S，Lijima K，Gross M D.Antitumor activity of astaxanthin and its model of action.Nutr.Cancer，2000，36：59-65)。制药及食品工业利用虾青素的抗氧化及免疫促进作用，做成可预防氧化组织损伤的药物及保健食品。目前添加有虾青素的各种饲料、食品、化妆品、保健药品早已面市，并且随着人们对虾青素功能及其产品的进一步了解，虾青素的市场需求已经越来越大了。
到目前为止，虾青素的来源主要有：化学合成、从甲壳类动物的废弃物中提取、雨生红球藻、红法夫酵母。化学合成的虾青素价格相对便宜，在饲料添加剂方面仍有一定的竞争力，但是其结构多为顺式，动物利用率低，且随着人们对环保的认识，它正面临被淘汰的威胁；对于虾蟹加工业发达的国家来说，甲壳类动物的废弃物是虾青素的一个很好的来源，但是其虾青素含量很低，提取过程有机溶剂污染、产品纯度低等问题限制了它的进一步发展；雨生红球藻中虾青素的含量一般占细胞干重的0.2％～2％，最高可达4％，是虾青素极好的来源，因而被广泛的研究和应用，但是由于雨生红球藻的生长条件极其苛刻，对水质、环境以及光照的要求很高，周期长、占地面积大等因素，因此其大规模生产比较困难；红法夫酵母是微生物中虾青素含量第二高的菌种，由于其培养方法简单、周期短、虾青素活性高等优点，在近二十年来人们逐渐把目光从雨生红球藻转移到红法夫酵母上。
红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)，有时也简称红酵母，它是真菌界、真菌门、半知菌亚门、担子菌纲、隐球酵母科、法夫酵母属的唯一一种。1995年被正式命名为Xanthophyllomycesdendrorhous。由于野生型红法夫酵母虾青素的产量很低，无法与化学合成竞争，因此改良菌种以提高虾青素产量成为首要工作，这已经成为近20年来的研究热点了。目前获得高产菌株的方法有物理、化学诱变，原生质体融合等传统方法以及许多转基因技术，但常用而有效的方法还是人工诱变法。倪辉等采用硫酸二乙酯诱变红法夫酵母，得到一株高产的菌株，在200L发酵罐中流加培养114h，获得红法夫酵母生物量为59.97g/L，细胞虾青素含量为1250mg/kg(15、倪辉.法夫酵母虾青素发酵条件的优化及提取与分析研究.博士学位论文，浙江大学，2005)。汪文俊等先后采用紫外诱变、甲基磺酸乙酯、60Co等方法诱变得到一株高产红法夫酵母，采用5L发酵罐培养，得到生物量为15.56g/L，虾青素含量为866mg/kg(16、汪文俊.红法夫酵母发酵生产虾青素及其代谢调控研究.博士学位论文，华中科技大学，2006)。尽管在前人的研究基础上红法夫酵母的虾青素含量已有所提高，但要满足工业化生产的需求，还需要进一步提高红法夫酵母的生物量和虾青素含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法。
本发明的另一目的在于提供所述虾青素生产菌株的应用。
本发明所述一种虾青素生产菌株为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变菌株N1806-04，该菌株已于2009年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.3045。
本发明所述一种虾青素生产菌株以红法夫酵母为出发生产菌，经NTG诱变、β-紫罗酮筛选获得，其具体诱变筛选方法包括以下步骤：
1)菌种准备：以红法夫酵母为出发菌株，将红法夫酵母出发菌株接种至YM琼脂培养基斜面中培养，从活化的斜面上挑一环菌体接种到摇瓶培养；
2)原生质体制备：取步骤1)摇瓶培养好的菌液离心收集菌体，用柠檬酸钠缓冲液将菌体洗涤，然后往菌体中加入破壁酶混合液，摇床中处理，取出处理后的菌液，离心收集原生质体；
3)NTG诱变：将原生质体用柠檬酸钠缓冲液洗涤，再用该柠檬酸钠缓冲液调整使其浓度在107～108/mL之间，然后加入NTG，摇床中处理；取出用NTG处理后的液体，离心收集原生质体，用柠檬酸钠缓冲液洗涤，再用NaCl重悬，将诱变后的原生质体悬液梯度稀释后，用双层平板培养法于再生培养基中再生诱变菌株；
4)菌株初筛：取出步骤3)培养好的平板，随机挑取若干菌落，转接到加有β-紫罗酮作为筛选剂的固体培养基上培养，挑选红色色泽深的色素产量高的菌株；
5)菌株复筛：将初筛得到的菌株挑到YEPD培养基中摇床培养，测其生物量及虾青素含量：
6)连续传代稳定性考察：将所得的产量较高的突变株连续传代五代，重复测其生物量及虾青素含量，以检测其遗传稳定性，最终获得虾青素生产菌株。
在步骤1)中，所述将红法夫酵母出发菌株接种至YM琼脂培养基斜面中培养的温度可为20～22℃，培养的时间可为3～4天；所述摇瓶培养的时间可为36～48h，所述摇瓶培养的培养基可为YEPD培养基；所述YM琼脂培养基(g/L)可为葡萄糖10，蛋白胨5，酵母粉3，麦芽汁3，pH 5.0；所述YEPD培养基(g/L)可为葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，自然pH。
在步骤2)中，所述柠檬酸钠缓冲液的用量，按体积比，可为菌体的0.5～1.0倍，所述柠檬酸钠缓冲液的浓度可为0.8～1.5mol/L；所述加入破壁酶混合液的用量，按体积比，可为菌体的0.5～1.0倍，所述摇床中处理，可在温度为25～30℃，30～60rpm摇床中处理40～70min；所述破壁酶混合液可为0.3％～0.6％破壁酶、0.05％～0.20％纤维素酶和0.005％～0.015％溶菌酶。
在步骤3)中，所述柠檬酸钠缓冲液的用量，按体积比，可为原生质体的0.5～1.0倍，所述柠檬酸钠缓冲液的浓度可为0.8～1.5mol/L；所述NTG的加入量，按体积比，可为原生质体的0.5～1.0倍，所述NTG的浓度可为20～50μg/mL；所述摇床中处理，可在20～22℃，30～60rpm摇床中处理20～30min；所述取出用NTG处理后的液体，离心收集原生质体，用柠檬酸钠缓冲液洗涤的柠檬酸钠缓冲液的用量，按体积比，可为离心收集原生质体的0.5～1.0倍，所述柠檬酸钠缓冲液的浓度可为0.8～1.5mol/L；所述NaCl的用量，按体积比，可为离心收集原生质体的0.5～1.0倍，NaCl的浓度可为0.8～1.5mol/L；所述用双层平板培养法于再生培养基中再生诱变菌株，可采用平板于20～22℃培养5～8天；所述再生培养基(g/L)可为葡萄糖15～20，蛋白胨15～20，酵母粉5～10，蔗糖160～180，pH 6.0。
在步骤4)中，所述β-紫罗酮的浓度可为1000～2000mg/L，所述培养的温度可为20～22℃，培养的时间可为5～8天。
在步骤5)中，所述摇床培养，可在20～22℃，150～250rpm摇床中培养5～6天。
本发明所述一种虾青素生产菌株可用于工业化生产虾青素。
本发明先采用酶法制备红法夫酵母原生质体，然后通过NTG诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得一株高产虾青素的红法夫酵母N1806-04(即虾青素生产菌株)，该菌株在YEPD培养基中于摇瓶培养5天，虾青素产量和含量达到28.22mg/L和4600mg/kg(细胞干重)。将该菌株连续传代5次后虾青素的产量稳定。同时将该虾青素生产菌株用发酵罐放大培养，其虾青素产量和含量分别可达500～600mg/L和5000～6300mg/kg(细胞干重)，生物量可达80～110g/L。虾青素产量和含量以及对应的生物量都满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中第一轮诱变结果。其中
表示红法夫酵母的生物量，
表示虾青素产量(即虾青素的体积浓度)，
表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为菌株号Strain number，左纵坐标生物量Biomass(g/L)，第1右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthin concentration(mg/L)，第2右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
图2为实施例1中第二轮诱变结果。其中
表示红法夫酵母的生物量，表示虾青素产量(即虾青素的体积浓度)，
表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为菌株号Strain number，左纵坐标生物量Biomass(g/L)，第1右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthin concentration(mg/L)，第2右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
图3为实施例1中第三轮诱变结果。其中表示红法夫酵母的生物量，
表示虾青素产量(即虾青素的体积浓度)，
表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为菌株号Strain number，左纵坐标生物量Biomass(g/L)，第1右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthin concentration(mg/L)，第2右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
图4为实施例1中N1806-04诱变株5次连续传代稳定性研究。其中表示红法夫酵母的生物量，表示虾青素产量(即虾青素的体积浓度)，表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为转接代数Generations of propagation，左纵坐标生物量Biomass(g/L)，第1右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthin concentration(mg/L)，第2右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
图5为红法夫酵母N1806-04在显微镜下的细胞形态(放大400倍)。
图6为红法夫酵母N1806-04在显微镜下的细胞形态(放大800倍)。
图7为实施例1中N1806-04在30L发酵罐中采用发酵培养基I培养生产虾青素的过程曲线。其中-○-表示发酵液中的葡萄糖浓度，-■-表示红法夫酵母的生物量，-▲-表示虾青素的体积浓度，-△-表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为培养时间Cultivation time(h)，第1左纵坐标为酸度值pH(-)，第2左纵坐标为转速Stirring speed(rpm)，第3左纵坐标为溶解氧DO(％)，第1右纵坐标为葡萄糖浓度Glucose concentration(g/L)，第2右纵坐标为生物量Biomass concentration(g/L)，第3右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthinconcentration(mg/L)，第4右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
图8为实施例2中第一轮诱变结果。其中
表示红法夫酵母的生物量，
表示虾青素产量(即虾青素的体积浓度)，
表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为菌株号Strain number，左纵坐标生物量Biomass(g/L)，第1右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthin concentration(mg/L)，第2右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
图9为实施例3中N1806-04在YM培养基的生长曲线。其中-■-表示红法夫酵母的生物量，-▲-表示虾青素的体积浓度，-△-表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为培养时间Cultivation time(h)，左纵坐标为生物量biomass(g/L)，第1右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthin concentration(mg/L)，第2右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
图10为实施例4中N1806-04在3.6L发酵罐中采用发酵培养基II培养生产虾青素的过程曲线。其中-○-表示发酵液中的葡萄糖浓度，-■-表示红法夫酵母的生物量，-▲-表示虾青素的体积浓度，-△-表示单位干重的红法夫酵母的虾青素含量；横坐标为培养时间Cultivation time(h)，第1左纵坐标为酸度值pH(-)，第2左纵坐标为溶解氧DO(％)，第1右纵坐标为葡萄糖浓度Glucose concentration(g/L)，第2右纵坐标为生物量Biomassconcentration(g/L)，第3右纵坐标为虾青素浓度Astaxanthin concentration(mg/L)，第4右纵坐标为虾青素含量Astaxanthin concent(mg/g)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做详细说明。
实施例1：
(1)将红法夫酵母出发菌株接种至YM琼脂培养基斜面中，于22℃培养3天。YM琼脂培养基(g/L)为葡萄糖10，蛋白胨5，酵母粉3，麦芽汁3，pH 5.0。
(2)从活化的斜面上挑一环菌体接种到摇瓶，22℃，200rpm培养36h，其中摇瓶培养基为YEPD。YEPD培养基(g/L)为葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10；自然pH。
(3)原生质体制备：取上述培养好的菌液离心收集菌体，用0.6倍体积的柠檬酸钠缓冲液(1.0mol/L)将菌体洗涤两次。然后往菌体中加入0.6倍体积的破壁酶混合液(0.5％破壁酶、0.1％纤维素酶和0.01％溶菌酶)，于28℃，54rpm摇床中处理60min；取出处理后的菌液，离心收集原生质体。
(4)将制备好的原生质体用0.6倍体积的柠檬酸钠缓冲液(1.0mol/L)洗涤两次，再用该柠檬酸钠缓冲液调整使其浓度约在107～108/mL之间。
(5)NTG诱变：往处理好的原生质体中加入0.6倍体积的40μg/mL NTG，于22℃，54rpm摇床中处理20min；
(6)取出上述用NTG处理后的液体，离心收集原生质体，用0.6倍体积的柠檬酸钠缓冲液(1.0mol/L)洗涤两次。再用0.6倍体积的1.0mol/L NaCl重悬。将诱变后的原生质体悬液梯度稀释后，用双层平板培养法于再生培养基中再生诱变菌株，平板于22℃培养7天。再生培养基(g/L)为葡萄糖15～20，蛋白胨15～20，酵母粉5～10，蔗糖160～180，pH 6.0。
(7)菌株初筛：取出上述培养好的平板，随机挑取菌落若干，转接到加有β-紫罗酮(1000mg/L)作为筛选剂的固体培养基上，于22℃培养7天。在加有β-紫罗酮作为筛选剂的固体培养基上色素产量低的菌株表现为白色或黄色，而只有产量较高的才会有红色，并且随着色素产量越高，其红色色泽越深。根据此特点进行初筛。
(8)菌株复筛：从上述培养好的平板中挑取颜色较红的菌落若干，转接到YEPD培养基中于22℃，200rpm摇床培养5天，测其生物量及虾青素含量。
生物量测定：取虾青素生产菌株发酵液3mL加入离心管中，离心收集菌体，用去离子水洗涤两次后，将菌体转移到预先烘干恒重的称量瓶中，于105℃烘干至恒重。
虾青素测定：取虾青素生产菌株发酵液1mL加入离心管中，离心收集菌体，用去离子水洗涤两次后，用二甲亚砜55℃破壁处理5min，用乙醇多次萃取虾青素，直到菌体呈白色。将萃取液定容到10mL，用0.22μm过滤器过滤，滤液用于HPLC。HPLC流动相：色谱纯甲醇。色谱条件：色谱柱：C18ODS；柱温：30℃；检测波长：478nm；进样量：50μL。
经过以上色谱条件测得诱变株的结果如图1所示。由图1可知经过一轮诱变后出现了几株虾青素产量较高的菌株，考虑到生物量和虾青素产量两个标准，选择虾青素产量最高的一株为N18，其生物量为7.538g/L，虾青素产量为21.94mg/L，虾青素含量为2910mg/kg(细胞干重)。
(9)选取第一轮诱变后产量较高的N18，重复实验步骤(1)到(8)，结果如图2。由图2可知，经过第二轮诱变后虾青素的产量有了进一步的提高，选取虾青素产量较高一株菌N1806，其生物量为6.882g/L，虾青素产量为26.28mg/L，虾青素含量为3819mg/kg(细胞干重)。
(10)选取第二轮诱变后产量较高的N1806，重复实验步骤(1)到(8)，其中将步骤(7)中的β-紫罗酮浓度提高到1500mg/L，结果如图3所示。由图3可知，经过第三轮诱变后虾青素产量仍有所提高，但提高幅度不如前面两次。选取虾青素产量较高同时生物量又不太低的一株菌N1806-04，其生物量为6.136g/L，虾青素产量为28.22mg/L，虾青素含量为4600mg/kg(细胞干重)。
(11)将突变株N1806-04在YEPD平板上连续传代，培养6天，取一环接种到摇瓶再培养5天，测定每一代的生物量、虾青素产量和含量，观察其稳定性。由图4可发现突变株N1806-04的生物量和虾青素产量略有波动，但总体比较稳定。突变株N1806-04即为虾青素生产菌株。其细胞形态如图5和图6所示。
(12)30L发酵罐培养N1806-04生产虾青素
在30L发酵罐中装入15L发酵培养基I，成分如下：
(a)有机组成：酵母粉(yeast extract) 10～15g/L
蛋白胨(peptone) 5～10g/L
葡萄糖(glucose) 15～30g/L
(b)无机盐： 七水硫酸镁 2.5～3.5g/L
氯化钾 0.7～1.0g/L
磷酸二氢钾 0.1～0.3g/L
氯化钠 0.5～1.0g/L
五水硫酸铜 0.005～0.01g/L
七水硫酸钴 0.002～0.003g/L
一水硫酸锰 0.006～0.012g/L
七水硫酸亚铁 0.005～0.01g/L
(c)维生素： VB1 0.17～0.34mg/L
VB6 0.3～0.6mg/L
VB12 0.08～0.16mg/L
生物素 1.5～3.0mg/L
肌醇 0.05～0.1mg/L
泛酸钙 20～60mg/L
控制条件为：以N1806-04为生产菌株，接种量10％，温度22℃，溶解氧30％以上，pH为5.0～6.0，用10％盐酸和10％氨水控制pH，同时流加500g/L葡萄糖，控制0～48h葡萄糖浓度为15～20g/L，48h后为5g/L以下。结果如图7所示，培养184h后，虾青素产量和含量分别为585.51mg/L和6163mg/kg(细胞干重)，此时对应的生物量为95.00g/L。
实施例2
(1)实验步骤同实施例1的(1)～(2)。
(2)原生质体制备：取上述培养好的菌液离心收集菌体，用1.0倍体积的柠檬酸钠缓冲液(0.8mol/L)将菌体洗涤两次。然后往菌体中加入1.0倍体积的破壁酶混合液(0.6％破壁酶、0.05％纤维素酶和0.005％溶菌酶)，于30℃，54rpm摇床中处40min；取出处理后的菌液，离心收集原生质体。
(4)将制备好的原生质体用1.0倍体积的柠檬酸钠缓冲液(0.8mol/L)洗涤两次，再用该柠檬酸钠缓冲液调整使其浓度约在107～108/mL之间。
(5)往处理好的原生质体中加1.0倍体积的20μg/mL NTG，于22℃，54rpm摇床中处30min；
(6)取出上述用NTG处理后的液体，离心收集原生质体，用1.0倍体积的柠檬酸钠缓冲液(1.0mol/L)洗涤两次。再用1.0倍体积的1.0mol/LNaCl重悬。将诱变后的原生质体悬液梯度稀释后，用双层平板培养法于再生培养基中再生诱变菌株，平板于22℃培养7天。
(7)实验步骤同实施例1的(7)～(8)。诱变结果如图8所示。
实施例3
将实施例1中获得的虾青素生产菌株接入YM培养基中进行摇瓶培养，装液量为8％～12％，接种量为10％，22℃恒温，200rpm，培养5天，结果如图9所示。从图9可看出，虾青素生产菌株在YM培养基上摇瓶培养，生物量在46h达到最大值为7.083g/L，根据实施例1中提供的色谱条件，测得其在106h虾青素达到最高为25.57mg/L，此时生物量为6.233g/L，即虾青素含量为4743mg/kg(细胞干重)。
实施例4
在3.6L发酵罐中装入1.5L发酵培养基II，其成分如下：
(a)有机组成：酵母粉(yeast extract) 5～10g/L
硫酸铵 2～7g/L
蛋白胨(peptone) 2～5g/L
葡萄糖(glucose) 15～20g/L
(b)无机盐： 七水硫酸镁 2.0～3.0g/L
氯化钾 0.7～1.0g/L
磷酸二氢钾 0.1～0.3g/L
氯化钠 0.5～1.0g/L
五水硫酸铜 0.005～0.01g/L
七水硫酸钴 0.002～0.003g/L
一水硫酸锰 0.006～0.012g/L
七水硫酸亚铁 0.005～0.01g/L
二水氯化钙 0.01～0.04g/L
(c)维生素： VB1 0.17～0.34mg/L
VB6 0.1～0.3mg/L
VB12 0.08～0.16mg/L
生物素 1.0～2.0mg/L
肌醇 0.05～0.1mg/L
泛酸钙 20～40mg/L
烟酸 0.1～0.3mg/L
控制条件为：以N1806-04为生产菌株，接种量10％，温度22℃，溶解氧30％以上，pH为5.0～6.0，用10％盐酸和10％氨水控制pH，同时流加500g/L葡萄糖，控制24h后葡萄糖浓度为5g/L以下。结果如图10所示，用发酵培养基II在3.6L发酵罐中培养161h，虾青素产量和含量分别为508.24mg/L和5238mg/kg(细胞干重)，此时对应的生物量为97.03g/L。
Claims (2)
1.一种虾青素生产菌株，为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变菌株N1806-04，该菌株已于2009年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.3045。
2.如权利要求1所述一种虾青素生产菌株在工业化生产虾青素中的应用。
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