CN107779448A - 一种快速筛选高产虾青素红法夫酵母菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种快速筛选高产虾青素红法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma CGMCC2.1557)的方法。具体步骤如下：1)野生型红法夫酵母菌株活化后恒温培养箱中22～25℃培养，取少量单菌落加入种子培养基中，120～130r/min摇床培养；2)常压恒压室温等离子束(ARTP)诱变野生型红法夫酵母菌株150～180s；3)诱变后菌液转入离心管中，梯度稀释，涂平板；4)菌株转接到24孔板，摇床培养45～50h，激光扫描共聚焦显微镜观察，筛选候选突变菌株；5)种子培养基中摇床培养；6)种子液成比例接入发酵培养基中摇床培养；7)超声法提取虾青素，超声时间为1～1.2h，高效液相色谱法检测发酵液中虾青素含量；8)筛出高产虾青素突变株，产率较野生型提高了25～55％。本发明应用两步法筛选高产虾青素红法夫酵母菌株：菌落颜色初筛与细胞荧光强度复筛，这种方法操作简单、安全、无污染，且诱变菌株较稳定，降低工业生产的成本。

Description

一种快速筛选高产虾青素红法夫酵母菌株的方法

技术领域

本发明涉及一种快速筛选高产虾青素红法夫酵母菌株(Phaffia rhodozymaCGMCC2.1557)的方法。

背景技术

虾青素(Astaxanthin)，又名虾黄质、龙虾壳色素。化学名称为3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β，β'-胡萝卜素，是一种酮式类胡萝卜素。纯的虾青素粉末呈暗红棕色，不溶于水，易溶于丙酮、氯仿和苯等有机溶剂。虾青素广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼、藻体、酵母和鸟类的羽毛中含量较高，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一。自上世纪90年代至今，国内外科学界对虾青素引起高度关注并做了大量研究。虾青素在上色、抗氧化、抗癌变以及增强免疫功能上均有显著作用。虾青素还有参与视觉生理代谢、肩周润滑程度调节、白内障预防、动脉硬化及脑损伤的防治以及中枢神经系统的健康维护等多重功效。基于上述生理功能，虾青素在医药保健、化妆品、水产养殖业、食品添加剂、家畜养殖业和蛋禽等方面有着广泛应用。目前，生产虾青素的方法主要有化学合成和天然提取两种方式。化学合成虾青素需要多步化学及生物催化反应，所以虾青素的化学合成方法相对较复杂，成本较高。现阶段，天然虾青素的开发生产方法主要有藻类提取、虾壳类提取和真菌发酵等。

研究最为广泛的天然提取虾青素的微生物为红发夫酵母菌。红法夫酵母菌产虾青素具有可以使用多种碳源和氮源快速进行异氧代谢、培养过程不需要光照、生产速度快、发酵时间短及可以在发酵罐中进行高密度的培养等优点。为了探索一种快速筛选高产虾青素红法夫酵母菌株的方法，本研究利用类胡萝卜素自发荧光的特性,利用常压恒压室温等离子束(ARTP)进行野生型红法夫酵母的诱变工作，同时应用两步法进行筛选：菌落颜色初筛与细胞荧光强度复筛，筛选出较为高产虾青素的菌株，这种方法操作简单、安全、无污染，且诱变菌株较稳定，降低工业生产成本，这对于今后选育高量虾青素的红法夫酵母具有重要意义。

发明内容

本发明利用常压恒压室温等离子束(ARTP)对红法夫酵母诱变，利用肉眼观察与激光扫描共聚焦显微镜技术对突变菌株进行筛选观察，通过高效液相色谱仪验证高产虾青素菌株的筛选结果，该方法具有工艺简单、工作量小、成本低等特点。

为实现上述目的，本发明由以下步骤组成：

①活化：野生型红法夫酵母菌株活化后在恒温培养箱培养；

②诱变：取野生型单菌落菌株加入种子培养基中摇床培养，利用常压恒压室温等离子束诱变野生型菌株，收集菌液后梯度稀释后涂平板培养，选长有50～200个单菌落接种到新培养基中培养；

③初筛：诱变后菌株转接到24孔板后液体培养，肉眼初步筛选出候选菌株。

④复筛：将候选菌株制成临时装片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察，筛选出荧光强度较高的突变菌株；

⑤种子培养：转接筛选后的突变菌株至种子液中，培养箱中摇床培养3d；

⑥发酵培养：取种子液接入培养基中，培养箱摇床培养3d；

⑦提取：收集发酵液后6000r/min离心10min，弃上清，向沉淀加入一定比例丙酮，超声处理，离心取上清备测；

⑧验证：利用高效液相色谱法检测发酵液中虾青素含量；

⑨最终筛选出高产虾青素的红法夫酵母突变菌株，计算高产率。

步骤1)所述的培养温度为22～25℃。

步骤1)所述的培养时间为120～130h。

步骤2)所述的摇速为120～130r/min。

步骤2)所述的常压恒压室温等离子束照射时间为150～180s。

步骤3)所述的摇床培养时间为45～50h。

步骤3)所述的筛选深橙色突变菌株作为候选菌株。

步骤4)所述的激光扫描共聚焦显微镜的波长为：激发光520～580nm，接收光510～590nm。

步骤7)所述的超声温度为22～27℃。

步骤7)所述的超声时间为1～1.2h。

步骤8)所述的HPLC法流动相为甲醇和乙腈(V甲醇：V乙腈＝9：1～1.5)。

步骤9)所述的最终突变菌株较野生型虾青素含量提高了25～55％。

附图说明

下面对附图进行简要说明。

图1是快速筛选高产虾青素红法夫酵母菌株的的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。

实施例1：

活化：野生型红法夫酵母菌株活化后在22℃恒温培养箱培养125h，转速120r/min；

诱变：取野生型单菌落菌株加入种子培养基中摇床培养24h，转速为120～130r/min，温度为22～25℃，利用常压恒压室温等离子束诱变野生型菌株，诱变时间为160s，诱变的菌液转入含有无菌生理盐水的离心管，梯度稀释后涂平板，22℃培养120h；

初筛：平板中长出的单菌落转接到有2mL培养液的24孔板中摇床培养，转速为125r/min，选深橙色突变菌株作为候选菌株；

复筛：将候选菌株制成临时装片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察，筛选出荧光强度较大的突变菌株；

种子培养：转接筛选后的突变菌株至种子液中，在温度为22℃，摇速为120r/min培养箱中培养72h；

发酵培养：将种子液成比例接种到培养基中，在温度为22℃，摇速为120r/min培养箱中培养3d；

提取：收集发酵液后6000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀，加入一定比例丙酮，25℃超声处理1h，离心取上清备测；

验证：利用高效液相色谱法检测发酵液中虾青素含量，流动相V甲醇：V乙腈＝9：1，流速1.0mL/min，进样量20μL；

最终筛选出的突变菌株中虾青素高产率较野生型提高了25～55％。

实施例2：

活化：野生型红法夫酵母菌株活化，25℃，125r/min的恒温培养箱培养120h，；

诱变：取少量培养后的菌株加入种子培养基中，摇床培养24h，常压恒压室温等离子束诱变酵母，时间180s，诱变的菌液转入含有无菌生理盐水的离心管，梯度稀释后涂平板，22℃培养120h，；

初筛：菌株转接到有2mL培养液的24孔板中,120r/min摇床培养46h，选深橙色突变菌株作为候选菌株；

复筛：将候选菌株制成临时装片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察，筛选出荧光强度较高的突变菌株；

种子培养：转接筛选后的突变菌株至种子液中，25℃，120r/min培养箱中振荡培养72h；

发酵培养：取种子液4L接入培养基中，25℃，120r/min培养箱振荡培养3d。

Claims (7)

1.一种快速筛选高产虾青素红法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma CGMCC2.1557)的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

①活化：野生型红法夫酵母菌株活化后在恒温培养箱中培养,培养温度为22～25℃，时间为120～130h；

②诱变：取野生型单菌落菌株加入种子培养基，摇床培养，利用常压恒压室温等离子束(ARTP)诱变150～180s，诱变的菌液梯度稀释后涂平板，固体培养基中培养；

③初筛：单菌落转接到24孔板中液体培养，筛选深橙色突变菌株作为候选突变菌株；

④复筛：候选突变菌株制成临时装片，激光扫描共聚焦显微镜观察，比较突变菌株细胞荧光强度；

⑤培养：突变菌株至种子液中摇床培养3d后，接入发酵培养基，摇床培养3d；

⑥提取：发酵液离心后留沉淀，加入丙酮，22～27℃超声处理1～1.2h，取上清备测；

⑦定量验证：高效液相色谱法测发酵液中虾青素含量，流动相V甲醇：V乙腈＝9：1～1.5；

⑧通过对红法夫酵母突变菌株定量分析，虾青素产量较野生型菌株产量增加了25～55％。

2.根据权利要求1所述的快速筛选高产虾青素红法夫酵母的方法，其特征在于筛选出的突变菌株虾青素含量较野生型菌株产量增加了25～55％。

3.根据权利要求1所述的，其特征在于筛选运用两步法：初筛，肉眼观察突变菌液的颜色；复筛，比较突变株细胞荧光强度。

4.根据权利要求1所述的，其特征在于所述的步骤②中的诱变时间为150～180s。

5.根据权利要求1所述的，其特征在于所述的步骤④中的激光扫描共聚焦显微镜的波长为：激发光520～580nm，接收光510～590nm。

6.根据权利要求1所述的，其特征在于所述的步骤⑦中流动相为：V甲醇：V乙腈＝9：1～1.5。

7.一种快速筛选高产虾青素红法夫酵母的方法，其特征在于是采用如权利要求1～6任一项所述的方法进行。