CN101717731A - 一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株mk19及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株MK19及其培养方法。采用60Co诱变筛选方法由法夫酵母野生型试验菌株得到本发明的法夫酵母突变株MK19，该法夫酵母突变株MK19经过固体种子活化、液体种子活化与发酵培养得到所述突变株MK19的发酵液。本发明的法夫酵母突变株MK19细胞密度达OD600＝32，虾青素含量为918.53μg/g，因此，该突变株细胞内虾青素含量是野生型菌株的22倍。此外，该菌株营养成分要求简单，培养基成本低廉，工业上应用可以简化虾青素生产工艺，缩短法夫酵母的生产周期，从而减少成本。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物生物技术领域。更具体地，本发明涉及葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株MK19及其培养方法。
【背景技术】
虾青素是一种广泛存在于自然界中的橘红色类胡萝卜素，具有极强的抗氧化活性，其抗氧化活性是维生素E的500倍。动物实验表明，虾青素有抑制肿瘤发生、增强免疫功能等多方面的生理作用；可以防治神经性疾病，如早老性痴呆症和帕金森症等，可以作为抗衰老和预防动脉硬化等疾病的药物或保健品；可以用于防治眼科疾病，尤其对糖尿病眼疾的发病率有明显降低效果。
美国食品和药物管理局(FDA)和欧盟已允许天然虾青素作为人类的膳食添加成分进入市场。目前，国际上利用天然虾青素开发人类的高级营养保健食品和药品，其产品定位主要在强化免疫系统功能、保护视网膜和中枢神经系统免受氧化破坏、抗炎、抗紫外辐射、缓解压力、减缓肌肉疲劳等方面，国外已开发了含虾青素的口服抗感染和消炎制剂，配合阿司匹林服用可加强其药效。在日本，虾青素已经在化妆品工业上广泛应用。
虾青素是全球类胡萝卜素中销售额第二大的品种，还广范用于大马哈鱼与鲑鱼的养殖业。虾青素不仅仅做为水产养殖动物的着色剂，越来越多的证据表明，虾青素是水产动物必需的“维生素“，对它们的正常生长、提高存活率和繁殖率具有极为重要的作用将法夫酵母细胞添加到鲑鱼和鳟鱼的饵料中，虾青素沉积在皮肤和肌肉中使其呈红色。研究表明，虾青素是大马哈鱼和虹鳟鱼饲料中的首选色素。
虾青素用作饲料添加剂能提高动物的免疫力和存活力，且能大量的沉积在动物的皮肤和肌肉等组织中，增色的同时增加其营养价值。在商业化的鱼类和甲壳类动物(如鲑鱼、虾、蟹、虹鳟鱼等)的饲料中添加虾青素可极大提高产品的市场价值。
因此，虾青素在保健品、医药、饲料、食品和日用化妆品等领域具有广阔的应用前景。
红法夫酵母属是生产虾青素的主要微生物之一，法夫酵母属于担子菌门，杂担子菌纲。法夫酵母发酵时兼性嗜低温微生物，适宜的生长温度为18-22℃。最适pH在5.0-6.9之间。法夫酵母在好氧发酵过程中产酸，释放CO2并同时合成虾青素。氧可以促进法夫酵母生长和色素合成。
与其他产类胡萝卜素酵母不同，法夫酵母能够利用葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、木糖、乳糖和甘油等多种碳源进行发酵，法夫酵母利用葡萄糖作为碳源进行发酵的这种特性有利于工业应用。
野生型法夫酵母的葡萄糖代谢阻遏效应呈阳性，即其细胞生长和色素合成皆受到高浓度葡萄糖的抑制。为了克服这个问题，多数实验室采用分批流加葡萄糖等方式，避免高浓度葡萄糖带来的底物阻遏效应。但是这种加料方式复杂，在工业生产中采用这种方式生产将会延长发酵周期，增加劳动和生产成本。
目前，已报道的多数高产虾青素突变株的适宜葡萄糖浓度为1％-5％[参见Hu，Z.等人，《World Journal of Microbiology andBiotechnology》，21：771-775(2005)；Kim，J.H.等人，《Biosci BiotechnolBiochem》，69：1743-8(2005)；Ni，H.，等人，《J Zhejiang Univ Sci.》B8：365-70(2007)；Reynders，M.B.，D.E.Rawlings，and S.T.L.Harrison.《Biotechnology Letters》，19：549-552(1997)；Yamane，Y.，等人，《Biotechnology Letters》，19：1109-1111(1997)]，而这种法夫酵母突变株还存在许多缺陷，例如高浓度葡萄糖的代谢阻遏效应，导致发酵过程中分批补加碳源等操作工艺会增加虾青素生产成本等。
因此，目前迫切需要克服现有法夫酵母受葡萄糖代谢阻遏的缺陷，获得发酵周期短，且虾青素产率高，制备工艺简单，易于工业化的法夫酵母突变株。本发明人通过大量的实验与分析研究，终于完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株。
本发明的另一个目的是提供一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株的培养方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株(Phaffia rhodozyma MK19)，该菌株已于2009年11月16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，简称CGMCC，其保藏编号为CGMCC No.3445。
本发明还涉及所述的葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株MK19的培养方法。
该方法的步骤如下：
A、PDA固体斜面培养基配制如下：200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水1000ml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至1000ml，在温度115℃下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，往该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基；
B、配制液体种子培养基：将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、2.0-2.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，调节pH至5.8-6.2；
C、配制液体低糖发酵培养基：将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4-0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，调节pH至5.8-6.2；
D、配制液体高糖发酵培养基：将100-120g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4-0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，调节pH至5.8-6.2；
E、培养条件与方法
(1)固体种子活化：将含有筛选突变株MK19的菌液涂布在步骤(A)制备的PDA固体培养基平板上，在温度21-25℃下进行斜面培养3-7天，然后置于温度3-5℃下保存；
从PDA斜面挑取菌苔接种至新鲜PDA斜面上，再在温度24-26℃培养3～7天，得到活化突变株MK19固体种子；
(2)液体种子活化：从上述(1)得到的活化突变株MK19固体种子挑取两环菌苔转移到在步骤(B)制备的液体种子培养基中，在温度24-26℃与振荡速度180-220rpm下培养3天；得到的液体种子再以所述的液体种子培养基体积计按照8-10％接种量加到所述的液体培养基中，在温度24-26℃与振荡速度180-220rpm下培养35-40小时；采用紫外分光光度法测定该培养液的OD值为9-12；
(3)发酵培养：上述(2)得到的活化液体种子以所述的低糖或高糖发酵培养基体积计以5-7体积％接种量加到所述的低糖或高糖发酵培养基中，在温度24-26℃与振荡速度200-240rpm下培养4-5天，得到所述突变株MK19的发酵液。
根据本发明的一种实施方式，所述的液体种子培养基是将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、2.4g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml制备得到的。
根据本发明的另一种实施方式，所述的液体低糖种子培养基是将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml制备得到的。
根据本发明的另一种实施方式，所述的液体高糖种子培养基是将100g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml制备得到的。
采用所述方法得到的所述突变株MK19发酵液的虾青素含量是20-30mg/L。
所述的虾青素含量是采用高压液相色谱法检测的。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株(Phaffia rhodozyma MK19)，其保藏编号为CGMCC No.3445。
根据本发明，以从日本理化研究所购买的野生型法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma JCM9042)为材料，采用60Co诱变筛选方法获得所述的法夫酵母突变株MK19。
60Co诱变筛选方法如下：
(1)所述的试验菌株悬浮液的制备：
首先，以所述的试验菌株为出发菌株，依次经本发明所述PDA固体培养基在24～26℃下活化1次，所述PDA液体培养基在24℃～26℃下活化2次，然后按照PDA液体培养基10％接种量接种入PDA液体培养基，在温度24～26℃下培养36h；
取活化的新鲜菌体，在转速5000rpm进行离心2分钟，然后弃去上清液，再用浓度0.9％的生理盐水制成悬浮液；
得到的悬浮液在60Co照射剂量分别为1kGry、2kGry、4kGry、6kGry、8kGry。
60Co照射使用放射性60Co作为放射源，产生γ射线，平均能量1.25MV。
(2)使用双蒸水将接受60Co照射的菌体稀释到103～105个细胞/ml，然后涂布于新制备的PDA培养基平板上，在避光及温度为24-26℃的条件下进行倒置培养7-10天。
所述进行倒置培养使用的设备可以是普通恒温培养箱。
(3)培养结束后，挑选肉眼观察深红色的菌落，进行摇瓶复筛。
(4)挑选的深红色菌落，按照10ml/150ml瓶接种入新制备的液体种子液，在温度24～26℃与转速200rpm下培养至96h后，收集细胞，加入预热60℃的二甲亚砜，并在60℃水浴20分钟破壁，提取色素，重复该步骤至细胞无红色。采用HPLC法测定虾青素含量。使用北京创新通恒科技有限公司高效液相色谱仪，P3000型高压输液泵，UV3000型紫外检测器，液相色谱柱：填料C-18，dp5μm，柱长25cm，内径4mm；流动相：以体积计，甲醇∶水＝97∶3，流速1.0ml/min，虾青素检测波长476nm。最终筛选到高产突变株MK19。
所述的培养设备例如可以是恒温摇床。
法夫酵母突变株MK19菌株生物学特性：
单细胞椭圆形，细胞大小是3.2～6.5μm×4.5～12.0μm，出芽繁殖，在液体培养后期常见几个细胞连在一起呈假丝状，此时细胞长度可达17.0-18.0μm。该菌在平板培养时(PDA培养基)，培养四天，菌落直径可达2.0-5.0mm，菌落而呈明显的深红色。该细胞好氧生长，最适生长初始pH值为6.0，最适生长温度24℃-26℃，当培养基内葡萄糖浓度为11％时生长良好，生物量和色素含量达最高水平，细胞内含有丰富的脂肪酸。
本发明还涉及所述的葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株MK19的培养方法。
该方法的步骤如下：
(1)固体种子活化：将含有筛选突变株MK19的菌液涂布在PDA固体培养基平板上，在24-26℃下进行斜面培养3-7天，然后置于3-5℃下保存。
从PDA斜面挑取菌苔接种至新鲜PDA斜面上，再在24-26℃培养3～7天，得到活化突变株MK19固体种子；
所述PDA固体斜面培养基配制方法如下：200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水1000ml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至1000ml，在温度115℃下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，向该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基。
所述斜面培养使用的设备是本技术领域的技术人员熟知的仪器，如试管和茄子瓶。
(2)液体种子活化：从上述(1)得到的活化突变株MK19固体种子挑取两环菌苔转移到在液体种子培养基中，在温度24-26℃与搅拌速度180-220rpm下培养3天；得到的液体种子再以所述的液体种子培养基体积计按照8-12体积％接种量加到所述的液体培养基中，在温度24-26℃与振荡速度180-220rpm下培养35-40小时；采用紫外分光光度计测定波长600nm处的吸光值，测得该培养液的细胞密度OD600为9-12。
所述的液体种子培养基配制方法如下：将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、2.0-2.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定溶于100ml，调节pH至5.8-6.2。
优选地，所述的液体种子培养基是将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、2.4g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml制备得到的。
(3)发酵培养：上述(2)得到的活化液体种子以所述的低糖或高糖发酵培养基体积计以5-7％接种量加到所述的低糖或高糖发酵培养基中，在温度24-26℃与振荡速度200-240rpm下培养4-5天，得到所述突变株MK19的发酵液。
所述的液体低糖发酵培养基配制方法如下：将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4-0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定容至1000ml，调节pH至5.8-6.2。
优选地，所述的液体低糖种子培养基是将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定容至1000ml制备得到的。
所述的液体高糖发酵培养基配制方法如下：
将100-120g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4-0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定溶于1000ml，调节pH至5.8-6.2。
优选地，所述的液体高糖种子培养基是将100g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定溶于1000ml制备得到的。
在这个步骤中，发酵培养通常使用的设备例如是本技术领域的技术人员熟知的恒温摇床，也可以使用类似的设备，例如发酵罐。
在本发明中，pH调节通常使用无机酸或无机碱进行，无机酸例如是盐酸、硫酸或磷酸，无机碱例如是氢氧化钠、碳酸钠等。一般使用无机酸或无机碱水溶液进行调节，它们的浓度不应该太高，例如0.1-0.5N。
采用上述方法得到的突变株MK19发酵液的虾青素含量是20-30mg/L。
所述的虾青素含量是采用如前面所述的高压液相色谱法进行检测的。
虾青素含量测定方法如下。
1、制作虾青素的分析标准曲线：
采用本技术领域的技术人员熟知的标准曲线制作方法进行。选择的虾青素浓度范围是0.2～25mg/L；高压液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)，P3000型高压输液泵，UV3000型紫外检测器，液相色谱柱使用迪马钻石二代(北京迪科马科技有限公司)：填料C-18，dp5μm，柱长25cm，内径4mm；流动相：以体积计，甲醇∶水＝97∶3，流速1.0ml/min，检测虾青素的波长为476nm。
根据实验获得的数据绘制出虾青素的分析标准曲线。
2、虾青素的提取：
取1ml采用本发明的法夫酵母突变株MK19的培养方法得到的发酵液，在转速12000rpm与室温下进行离心分离，除去上清液，收集菌体，然后用去离子水洗两次，把洗涤的菌体加到预热到60℃的二甲亚砜中，再剧烈震荡混匀，在温度60℃水浴中保温20分钟，加入1ml甲醇与二氯甲烷按照体积比3∶1混合得到的提取液，然后静止几分钟，在转速2000rpm与室温下离心一分钟，将离心得到的上清液转移至另一个离心管中，在其同样条件下进行离心分离，其菌体沉淀物重复用预热到60℃的二甲亚砜进行破壁提取，直到菌体为白色为止，汇集提取液。
3、高压液相色谱法检测虾青素的含量：
上述提取液样品在转速12000rpm与室温下进行离心分离，得到的上清液进行HPLC检测，(北京创新通恒科技有限公司)，P3000型高压输液泵，UV3000型紫外检测器，P3000型高压输液泵，UV3000型紫外检测器，液相色谱柱使用迪马钻石二代(北京迪科马科技有限公司)：填料C-18，dp5μm，柱长25cm，内径4mm；流动相：以体积计，甲醇∶水＝97∶3，流速1.0ml/min.检测波长为476nm，检测物的浓度根据标准品的标准曲线确定。
采用本发明方法培养法夫酵母96小时，再采用高压液相色谱法检测虾青素的含量，这些结果表明，野生株中虾青素的含量在低糖培养基是高糖培养基的2-3倍；而本发明的法夫酵母突变株MK19在低糖和高糖培养条件下则无明显区别。
[有益效果]
本发明提供的耐高糖法夫酵母突变株MK19在葡萄糖高达110g/L的条件下仍能快速生长，且虾青素积累迅速。在初始葡萄糖浓度为110g/L的摇瓶情况下，野生菌最终OD600＝25.2，虾青素含量为40.36μg/g，而本发明的法夫酵母突变株MK19细胞密度达OD600＝32，虾青素含量为918.53μg/g，因此，该突变株细胞内虾青素含量是野生型菌株的22倍。该菌株可耐受高浓度初始葡萄糖。此外，该菌株营养成分要求简单，培养基成本低廉，工业上应用可以简化虾青素生产中的补料工艺，缩短法夫酵母的生产周期，从而减少成本。
本发明涉及一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株(Phaffia rhodozyma MK19)，该菌株已于2009年11月16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，简称CGMCC，其保藏编号为CGMCC No.3445。
【具体实施方式】
实施例1本发明的法夫酵母突变株MK19的培养
PDA固体斜面培养基配制如下：200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水1000ml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至1000ml，在温度115℃下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，向该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基。
配制液体种子培养基：将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、2.4g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定容于1000ml，调节pH至6.0。
配制液体低糖发酵培养基：将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中并定容于1000ml，调节pH至6.0。
培养条件与方法：
固体种子活化：将含有筛选突变株MK19的菌液涂布在前面制备的PDA固体培养基平板上，在温度24-26℃下进行斜面培养5天，然后置于温度4℃下保存；
从PDA斜面挑取菌苔接种至新鲜PDA斜面上，再在温度24-26℃培养3天，得到活化突变株MK19固体种子；
液体种子活化：从上述得到的活化突变株MK19固体种子挑取两环菌苔转移到在前面制备的液体种子培养基中，在温度24-26℃与搅拌速度200rpm下培养3天；得到的液体种子再以所述的液体培养基体积计按照10％接种量加到所述的液体培养基中，在温度24-26℃与搅拌速度200rpm下培养36小时；采用紫外分光光度法测定该培养液的OD值为10。
(3)发酵培养：上述得到的活化液体种子以所述的低糖或高糖发酵培养基体积计按6％接种量加到所述的低糖或高糖发酵培养基中，在温度24-26℃与搅拌速度220rpm下培养5天，得到所述突变株MK19的发酵液。
按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了本发明法夫酵母突变株MK19发酵液的虾青素含量，其结果列于表1中。
还测定了所述法夫酵母突变株MK19发酵液的细胞密度OD600，其结果列于表1中。
实施例2本发明的法夫酵母突变株MK19的培养
该实施例按照与实施例1的同样方式进行，只是使用液体高糖发酵培养基。
液体高糖发酵培养基配制方法如下：将110g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH 6.0。
按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了本发明法夫酵母突变株MK19的虾青素含量，其结果列于表1中。
还测定了所述法夫酵母突变株MK19发酵液的细胞密度OD600，其结果列于表1中。
对比实施例1野生型法夫酵母菌株JCM9042的培养
野生菌株JCM9042购买自日本理化研究所。
该实施例按照与实施例1的同样方式进行。
按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了野生菌株JCM9042发酵液的虾青素含量，其结果列于表1中。
还测定了所述野生菌株JCM9042的发酵液的细胞密度OD600，其结果列于表1中。
对比实施例2野生型法夫酵母菌株JCM9042的培养
野生菌株JCM9042购买自日本理化研究所。
该实施例按照与实施例2的同样方式进行。
按照说明书公开的高压液相色谱法检测虾青素含量的方法测定了野生菌株JCM9042发酵液的虾青素含量，其结果列于表1中。
还测定了所述野生菌株JCM9042的发酵液的细胞密度OD600，其结果列于表1中。
表1不同葡萄糖浓度下野生型和突变株细胞生长密度于虾青素含量
表1结果表明，在初始葡萄糖浓度为110g/L的情况下，野生菌JCM9042最终细胞密度OD600＝25.2，虾青素含量为40.36μg/g(干细胞)，而本发明突变株MK19细胞密度达OD600＝32，虾青素含量为918.53μg/g(干细胞)，本发明突变株MK19突变株细胞内虾青素含量是野生型菌株JCM9042的22倍。测定结果还表明，本发明的突变株MK19葡萄糖代谢脱阻遏，在高糖和低糖的培养基中虾青素的含量基本一致。而野生菌株JCM9042中虾青素的积累却随着葡萄糖的增加而减少至1/3，其代谢受到抑制。
Claims (7)
1.一种葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株(Phaffiarhodozyma MK19)，其保藏编号为CGMCC No.3445。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖代谢脱阻遏、高产虾青素的法夫酵母突变株MK19的培养方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、PDA固体斜面培养基配制如下：200g马铃薯经洗净去皮切碎后，加水1000ml煮沸半个小时，用纱布过滤，其滤液再加20g葡萄糖，混匀后用去离子水补充液体体积至1000ml，在温度115℃下灭菌15分钟，得到PDA液体培养基，往该PDA液体培养基中加入15g琼脂，待琼脂溶解、凝固后得到PDA固体培养基；
B、配制液体种子培养基：将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、2.0-2.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶解于蒸馏水，定溶至1000ml，调节pH至5.8-6.2；
C、配制液体低糖发酵培养基：将36-44g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4-0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶解于蒸馏水，定溶至1000ml，调节pH至5.8-6.2；
D、配制液体高糖发酵培养基：将100-120g葡萄糖、3.6-4.4g酵母粉、0.4-0.8g尿素、1.6-2.2g磷酸二氢钾、0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶解于蒸馏水，定溶至1000ml，调节pH至5.8-6.2；
E、培养条件与方法
(1)固体种子活化：将含有筛选突变株MK19的菌液涂布在步骤(A)制备的PDA固体培养基平板上，在温度21-25℃下进行斜面培养3-7天，然后置于温度3-5℃下保存；
从PDA斜面挑取菌苔接种至新鲜PDA斜面上，再在温度24-26℃培养3～7天，得到活化突变株MK19固体种子；
(2)液体种子活化：从上述(1)得到的活化突变株MK19固体种子挑取两环菌苔转移到在步骤(B)制备的液体种子培养基中，在温度24-26℃及摇床振荡速度180-220rpm下培养3天；得到的液体种子再以所述的液体种子培养基体积计按照8-10％接种量加到所述的液体培养基中，在温度24-26℃与振荡速度180-220rpm下培养35-40小时；采用紫外分光光度法测定该培养液的OD值为9-12；
(3)发酵培养：上述(2)得到的活化液体种子以所述的低糖或高糖发酵培养基体积计按照5-7％接种量接种至所述的低糖或高糖发酵培养基中，在温度24-26℃与振荡速度200-240rpm下培养4-5天，得到所述突变株MK19的发酵液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、2.4g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，制备得到所述的液体种子培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将40g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水，并定容至1000ml中，制备得到所述的液体低糖种子培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将100g葡萄糖、4.0g酵母粉、0.6g尿素、2.0g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，制备得到所述的液体高糖种子培养基。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述突变株MK19发酵液的虾青素含量是20-30mg/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的虾青素含量是采用高压液相色谱法检测的。
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