CN106801019B - 一种高产虾青素的突变菌株及其应用 - Google Patents

一种高产虾青素的突变菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物筛选技术领域，具体涉及一种虾青素高产菌株及其应用。申请人从落叶上筛选到的自然菌株红法夫酵母XQ（Phaffia rhodozyma XQ），其虾青素产量为55.77mg/mL。申请人进一步通过紫外诱变和2‑脱氧‑D‑葡萄糖筛选获得的突变菌红法夫酵母XQS，其虾青素产量得到显著提高，达78.42 mg/mL，比出发菌红法夫酵母XQ提高了40.6%，且遗传性状稳定，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于虾青素的生产，有利于降低生产成本，实现虾青素的有效推广和使用。

Description

一种高产虾青素的突变菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选技术领域，具体涉及一种高产虾青素的突变菌株及其应用。
技术背景
虾青素(Astaxanthin)，化学名称为3，3-二羟基-β, β’-胡萝卜素-4, 4’-二酮，是一种非维生素A源的酮式类胡萝卜素。由于其呈天然的紫红色，所以最初在欧美一些国家是作为色素而被用做水产业的饵料添加剂。药理学和生理学研究发现虾青素具有极强的生物抗氧化性，其抗氧化和淬灭自由基的能力比β胡萝卜素强1.7倍，比维生素E强80倍，此外还具有促进抗体产生增强免疫力以及抗紫外线辐射等作用，因而在水产业、医药、食品、化妆品等方面有着广阔的应用前景。
虾青素的生理功能主要有以下几个方面：1）抗氧化作用。虾青素强大的抗氧化活性是因为其能稳定膜的结构，降低膜通透性、限制过氧化物启动子进入细胞内。保护细胞内重要分子免受氧化损伤。同时虾青素可能具有潜在的成为促氧化剂诱导氧化应激的产生。2）抗癌作用。对膳食类胡萝卜素摄入量和癌症发病率或死亡率间关系的调查发现，癌症总发病率或死亡率与类胡萝卜素的摄入量呈显著负相关。比较各种类胡萝卜素抗肿瘤活性，以虾青素的作用效果最强。虾青素的抗肿瘤活性可能与它在细胞间的信号传导，与异型物质代谢酶的诱导生成，与肿瘤细胞相关的免疫反应调节有关。3）增强机体免疫力。虾青素能明显增强机体局部和全身的免疫能力，这种免疫调节特性与抗氧化性相结合，在防止疾病的发生与传播中发挥重要作用。更重要的是虾青素能增强体内T细胞的功能，增加嗜中性白细胞、自然杀伤细胞的数目，参与机体细胞免疫；虾青素还可以增加免疫系统中B细胞的活力，消灭外源入侵的病原体，通过协助产生抗体并提高其他免疫组分的活性发挥作用。4）着色作用。类胡萝卜素是水生动物体内的主要色素物质，而虾青素占水生动物体内类胡萝素的大部分，因此可以说虾青素是水生动物体内的主要色素物质。虾青素是类胡萝卜素合成的终点，它进入动物体后可以不经修饰或生化转化而直接贮存在组织中，具有极强的色素沉积能力，使一些水生动物的皮肤和肌肉出现健康而鲜艳的颜色，使禽蛋及禽的羽毛、皮肤、脚、项均呈现健康的金黄色或红色。
虾青素广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛。虾青素的生产主要有3种方法：化学合成法、提取法和微生物发酵法。化学合成法具有生产成本较低，产量高等优点，但是合成的虾青素多为顺式结构，而动物机体只对反式虾青素有较高的吸收利用率；提取法主要从水产品加工的废弃物中提取虾青素，提取前必须除去废弃物中的石灰质成分，提取费用高且容易污染。当前微生物发酵生产虾青素的方法主要有两种，一是利用藻类生产（如雨生红球藻培养）；二是利用酵母发酵生产虾青素（如红法夫酵母），发酵法生产的虾青素天然无污染，但受到成本高、培养条件苛刻、产量低等因素的制约。例如，红法夫酵母野生菌株产虾青素量低，发酵温度低易于退化，而且当葡萄糖的质量浓度过高时，虾青素产量会急剧的下降，这些性质使其工业化生产受到制约。
因此亟需通过选育获得高产虾青素、耐高温、发酵温度高、不易退化的优良菌种，以提高虾青素的产量。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产虾青素的红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）菌株。所述红法夫酵母是通过紫外诱变的方法筛选出的突变株，能大大提高虾青素的产量，为低成本、规模化生产虾青素奠定了基础。
本发明一方面涉及一种突变菌株红法夫酵母XQS（Phaffia rhodozyma XQS），已于2016年12月19日保存于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016764。
本发明还涉及上述红法夫酵母在虾青素生产中的应用。
一种生产虾青素的方法，是以上述红法夫酵母为发酵菌株。
本发明从落叶上筛选到的自然菌株红法夫酵母XQ（Phaffia rhodozyma XQ），其虾青素产量为55.77mg/mL。申请人进一步通过紫外诱变和2-脱氧-D-葡萄糖筛选获得的突变菌红法夫酵母XQS，其虾青素产量得到显著提高，达78.42 mg/mL，比出发菌红法夫酵母XQ提高了40.6%，且遗传性状稳定，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于虾青素的生产，有利于降低生产成本，实现虾青素的有效推广和使用。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。但本发明可用下文中的非限定性实施例作进一步的说明。本发明选用的原料均可购自市场上任意一种。
实施例1 产虾青素自然菌株的筛选
样品来源：俄罗斯林场的落叶；
从落叶表面刮下红色的附着物，用无菌水稀释后均匀涂布于分离平板上（葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，麦芽汁3 g/L，琼脂 1 g/L，pH 5.0）上，置于28℃培养。菌落长出后，挑选其中红色、粉红色、橙红色颜色较深且生长迅速的菌落，共29个，分别进行分离培养。将纯化的菌株接种于保存斜面（葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，麦芽汁3 g/L，琼脂 1 g/L，pH 5.0）上。
将初筛得到的29株菌分别接种于YPD液体培养基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L；自然pH）中，28℃振荡培养24h，摇床转速150rpm，即得种子培养液，然后在装有30mL液体培养基的250mL三角瓶中按5%的接种量接入种子培养液，28℃振荡培养72h，摇床转速150rpm。发酵结束后，离心收集菌体，分别测定生物量和虾青素含量，并计算虾青素产量，根据单位体积发酵液的虾青素产量筛选出虾青素高产菌株。
、生物量测定：
取发酵液3mL 加入离心管中，离心收集菌体，用去离子水洗涤两次后，将菌体转移到预先烘干恒重的称量瓶中，于105℃烘干至恒重。
、虾青素含量测定：
1、仪器设备：高效液相色谱仪、色谱工作站、离心机、超声清洗器、漩涡混合器、微量进样器、微孔滤膜、色谱柱为Agilent 不锈钢柱（内装填料PLRS-S，10nm，长250nm，内径4.6mm）等。
2、试剂：色谱甲醇、乙腈；
3、检测条件：流动相为乙腈：水（95:5）；流速为1.5mL·min-1 ；检测波长为471nm，进样量20μL。
4、操作步骤
(1) 标样的制备
准确称取虾青素标准品0.05g( 精确至0.0002g) 溶于50mL 容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。再用移液管取1mL 至10mL 容量瓶，色谱甲醇溶解，并定容至刻度，备用。
(2) 样品制备
取虾青素生产菌株发酵液1mL加入离心管中，离心收集菌体，用去离子水洗涤两次后，用二甲亚砜55℃破壁处理5min，用乙醇多次萃取虾青素，直到菌体呈白色。将萃取液定容到10mL，用0.22μm 过滤器过滤，滤液用于HPLC检测。
在上述条件下，待仪器稳定后注入标样溶液连续两针标样虾青素峰面积相对变化小于1.5% 后，再将制备好的样品进样检测。
(3) 计算方法
虾青素产量（g/L）=( 样品峰面积/ 标准品峰面积) ×标准品浓度×稀释倍数。
检测结果显示，上述初筛得到的29株自然菌株中有8株虾青素产量较高，考虑到生物量和虾青素产量两个标准，选择虾青素产量最高的一株命名为XQ，其生物量为7.538mg/mL，虾青素产量为55.77mg/mL。
申请人采用分子生物学的方法对上述筛选得到的XQ菌株进行鉴定，测得其18srDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行Blast比对，发现其与红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）的序列相似性达99%。进一步结合XQ菌株的菌落形态，申请人确认上述筛选到的高产虾青素的XQ菌株为红法夫酵母（Phaffia rhodozyma），命名为红法夫酵母XQ（Phaffia rhodozyma XQ）。
实施例2 红法夫酵母XQ的诱变筛选
申请人为了进一步提高红法夫酵母XQ的虾青素产量，对该菌株进行紫外诱变，获得虾青素产量提高的红法夫酵母突变菌株。
紫外诱变处理及剂量确定
打开40W紫外灯开关，预热约30min。取直径9cm无菌平皿，加入细胞浓度为OD600＝0.25的红法夫酵母XQ菌悬液7mL，放入一根无菌磁力搅拌器；打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，在垂直距离为15cm处，分别搅拌照射0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，盖上皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30min。将照射后的菌悬液用0.85％生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10-1～10-5；取10-3、10-4、10-5三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布YPD固体平板，每个稀释度涂布三个平板，均匀涂满整个平板表面；以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用报纸包好后，置37℃过夜培养。
统计不同照射时间时每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下平板上长出的单菌落数在30～300个之间，则认为该稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：
菌悬液浓度(CFU/mL)＝某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10
按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：
致死率=(未诱变的菌悬液浓度-诱变后的菌悬液浓度)/未诱变的菌悬液浓度×100%
经计算，不同紫外诱变剂量下红法夫酵母XQ的致死率如表1所示。
表1 紫外线诱变致死率
时间/s 0 30 60 90 120 150 180
致死率/s 0 0 0 34% 60% 86% 93%
从表1的数据可以看出，红法夫酵母XQ菌悬液经紫外照射180s后致死率就达到93％，因此最终确定诱变时间为180s。
紫外诱变与2-脱氧-D-葡萄糖筛选
取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的红法夫酵母XQ菌悬液悬液（浓度为1×107），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使菌悬液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为40w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射180s。
将紫外照射后的菌悬液稀释1000倍，取100ul涂布分离平板（葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，2-脱氧-D-葡萄糖1 g/L，琼脂20 g/L；自然pH），30℃培养2-3d。
因分离平板中添加了2-脱氧-D-葡萄糖，因此能在分离平板上长出的菌株均为抗葡萄糖阻谒效应的突变菌株，能有效提高红法夫酵母的代谢产物产量。
据统计，经过紫外诱变和2-脱氧-D-葡萄糖筛选，申请人共获得21株突变菌株。
分别挑取上述突变菌株接种于YPD固体平板上，30℃培养2-3d，观察平板上菌落的颜色和长势, 如果颜色变淡的就淘汰，选择颜色红的菌落，再传一代按上法进行选择。经过三次传代后，上述获得的31株突变菌中只有12株突变菌的菌落一直为红色，且长势良好，遗传性状稳定。
虾青素产量分析
将上述筛选获得的遗传性状稳定的12株突变菌，分别接种于装有50mLYPD液体培养基的250mL三角瓶中，28℃振荡培养72h，摇床转速150rpm。同时以出发菌株红法夫酵母XQ为对照，采用上述同样条件进行发酵。发酵结束后，离心收集菌体，采用实施例1所述方法分别测定生物量和虾青素含量，并计算虾青素产量。
结果显示，上述筛选获得的突变菌中虾青素产量最高为78.42 mg/mL，比出发菌红法夫酵母XQ提高了40.6%，取得了意料不到的技术效果。申请人将该虾青素产量最高的突变菌株命名为红法夫酵母XQS（Phaffia rhodozyma XQS），并于2016年12月19日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016764。

Claims (2)

1.一种红法夫酵母（Phaffia rhodozyma），其特征在于，所述的红法夫酵母已于2016年12月19日保存于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016764。
2.权利要求1所述的红法夫酵母在虾青素生产中的应用。
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