CN112358975A - 红法夫酵母菌及其用途 - Google Patents

红法夫酵母菌及其用途 Download PDF

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CN112358975A CN202011086155.3A CN202011086155A CN112358975A CN 112358975 A CN112358975 A CN 112358975A CN 202011086155 A CN202011086155 A CN 202011086155A CN 112358975 A CN112358975 A CN 112358975A
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phaffia rhodozyma
astaxanthin
culturing
hff501
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姜宗然
邵琦
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Abstract

本发明涉及一种红法夫酵母菌及其用途，该红法夫酵母菌于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020413，分类命名为：Phaffia rhodozyma HFF501，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。该菌株是发明人从松树林的土壤中筛选分离获得的，该菌株具有高产虾青素的特点。

Description

红法夫酵母菌及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及红法夫酵母菌、用途及生产虾青素的方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)，是一种含有氧类非维生素A源的类胡萝卜素，其在自然界广泛存在，是一种具有巨大潜力的抗氧化剂，具有强抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗机体着色、抗癌等许多重要的生物学功能，在食品、医药、化妆品、水产养殖、畜禽养殖、化工等行业具有广阔的应用前景。
目前，获得虾青素的方法有化学合成和生物提取。其中，化学合成虾青素的工艺流程成熟，但是人工合成的虾青素的生物安全性和生物活性比较低。因此，如何提高生物提取天然虾青素的产量是至关重要的。天然虾青素主要是从藻类、酵母以及水产品加工废料中提取。
红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)在分类上属于真菌界，真菌门，半知菌亚门，隐球酵母科，法夫酵母属。红法夫酵母细胞中有大量的不饱和脂肪酸和多种虾青素的前体，能够在发酵罐中高密度生长，利用多种糖作为碳源进行异养代谢，生长速度快，发酵周期短，代谢产物包括十几种类胡萝卜素，其中占比最高的就是虾青素。但是现有红法夫酵母菌株的虾青素产量较低，基因组和遗传特性不明确。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种红法夫酵母菌及其用途。
为此，根据本发明的实施例，本发明在第一方面提出了一种红法夫酵母菌，于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020413，分类命名为：Phaffia rhodozyma HFF501，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。该菌株(在本申请中命名为HFF501)是发明人从松树林的土壤中筛选分离获得的，该菌株具有高产虾青素的特点，例如，该菌株在发酵培养基中进行150h发酵，其菌体中的虾青素含量可达到0.5-1％。
根据本发明实施例的红法夫酵母菌，所述红法夫酵母菌具有四个特异性DNA片段，其核苷酸序列表如SEQ ID NO:1～4所示。
本发明在第二方面提出了上述红法夫酵母菌在生产虾青素中的用途。本发明筛选到的高产虾青素菌株，在未经任何基因工程改造的情况下，经过较短周期发酵即可获得虾青素的高产，具有产业化应用潜力。
本发明在第三方面提出了一种虾青素的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：在适于虾青素表达的条件下，培养上述的红法夫酵母菌，以便获得含有所述虾青素的培养物。根据本发明实施例的方法，经过较短周期发酵即可获得虾青素的高产，具有产业化应用潜力。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
可选地，所述培养是在发酵培养基中进行的，所述发酵培养基中含有：酵母抽提物2～5g/L，(NH4)2SO4 0.2～0.4g/L，葡萄糖10～20g/L，蔗糖2～4g/L，柠檬酸钠2～3g/L。
其中，前面的百分比表示质量体积比，如2～5g/L酵母抽提物表示1L培养基中含有2～5g的酵母抽提物。发明人通过实验发现，在上述培养基中，所述红法夫酵母的生物量较高，代谢产物-虾青素的单位产量较高。
进一步地，所述发酵培养基的pH在6.0～6.5。
进一步地，所述培养是在22℃，搅拌转速为100rpm，罐压为0.04～0.05MPa，空气流量为1vvm的发酵罐中进行的。
进一步地，所述培养的时间为100～180h。
进一步地，所述培养是以10-30mL/h/L速率进行补料发酵；其中，补料培养基为葡萄糖200-300g/L。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的菌落图；
图2为根据本发明实施例的菌株镜检图；
图3为根据本发明实施例的红法夫酵母HFF501与Xden1的基因比对；
图4为根据本发明实施例的红法夫酵母HFF501与JCM 9681的基因比对；
图5为根据本发明实施例的红法夫酵母HFF501与ASM157971v1的基因比对；
图6为根据本发明实施例的色谱图；
图7为根据本发明实施例的虾青素标准曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1菌种的筛选、鉴定、纯化
(1)筛选：在河北、吉林、黑龙江等地区的松树林下采集355份土壤样品，利用YPD培养基(含50μg/mL的青霉素和链霉素)进行筛选。具体步骤为，将每份土壤样品进行编号，取1g土壤样品溶于10mL0.9％NaCl溶液中，吸取100μL溶液至YPD培养基上，使用无菌涂布棒均匀涂布，置于22℃培养箱中培养96h。挑取多个颜色较红、菌落较大的菌株，利用YPD培养基进行纯化，接种到液体培养基中振荡培养，测定各组的虾青素含量，选择虾青素含量最高的菌株进行进一步纯化。
(2)纯化：使用无菌接种环，将菌株HFF501在葡萄糖蛋白胨酵母粉琼脂培养基(YPD培养基)上划线纯化。培养温度22℃，培养时间48h，得如图1所示的菌落形态，菌落颜色为橘红色，菌落直径2mm。
(3)鉴定：使用天根生化科技(北京)有限公司的真菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)对纯化完成的菌株HFF501进行基因组DNA的提取作为模板，以ITS基因引物(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)为引物，进行PCR，程序为：94℃，5min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，50s，35个循环；72℃，5min。PCR产物送至博尚生物技术(上海)有限公司进行测序。
(4)比对：比对：将测序结果在NCBI数据库中进行比对，结果与红法夫酵母的相似性最高，因此菌株HFF501鉴定为红法夫酵母，菌株HFF501改为红法夫酵母HFF501。
实施例2红法夫酵母HFF501的培养和镜检
(1)将实施例1所得菌种接入发酵罐的200L发酵培养基中，使用4mol/L氢氧化钠溶液或柠檬酸溶液控制pH在6.0，培养温度22℃，搅拌转速为100rpm，罐压为0.05MPa，空气流量为1vvm，发酵培养时间为150h。其中，以25mL/h/L速率进行补料发酵，补料培养基为葡萄糖250g/L。发酵培养基采用：酵母抽提物3g/L，(NH4)2SO4 0.4g/L，葡萄糖15g/L，蔗糖3g/L，柠檬酸钠2g/L。放罐依据使用显微镜检测，红法夫酵母浓度达到1×107以上，安排放罐处理，收集发酵液。
(2)镜检：滴加10μL红发夫酵母发酵液在洁净的载玻片上，用酒精灯烘干，滴加结晶紫染液，染色3-5min，冲洗多余的染液，使用酒精灯烘干载玻片，放置在显微镜下观察，镜检结果如图2。
实施例3：红发夫酵母HFF501的生物量干重测定
准备无菌5mL离心管，对空管称重获得空管重量，重量为1.6843g。取4mL实施例1中得到的红发夫酵母发酵液于无菌5mL离心管中，放置在80℃烘箱中烘干8h，称重，重量为1.7005g。获得的重量减去相对应空管中量即得到4mL发酵液干重为0.0162g，生物量为0.0162×250＝4.050g/L。
实施例4：虾青素干粉的制备与含量检测
(1)喷干：将实施例2得到的发酵液进行喷干处理，具体步骤为，将发酵液转移到喷雾干燥塔中，进风170℃，出风温度50℃。
(2)提取：准确称取1g红法夫酵母粉，加10mL60℃预热的二甲亚砜，振荡充分摇匀，置于50℃水浴锅中，水浴加热破壁5min，加入20mL无水乙醇，避光静置萃取10～15min。经破壁萃取处理后的色素菌体悬浊液，8000rpm离心5min，将上清转移到容量适宜的棕色容量瓶中，所得菌体在重复上述步骤萃取色素，直到菌体为白色为止，将萃取所得上清转移到同一个容量瓶中，用无水乙醇定容。
(3)含量测定：采用Agilent HC-C18色谱柱，以色谱纯甲醇为流动相，流速为1mL/min，检测波长为478nm，柱温为30℃，进样量50μL。结果如图6所示。
配制不同浓度的虾青素标准溶液(0.1、0.5、1、5、10mg/L)，经0.22μm的有机相滤膜过滤后，分别进样测定，以虾青素的质量浓度(mg/L)为纵坐标，相应的峰面积为横坐标，得到虾青素的标准曲线(图7)。线性关系为Y(虾青素mg/L)＝0.0074X(峰面积)+0.0131。相关系数R2＝0.9999。
经测定干粉中虾青素含量为0.6％。
实施例5：红法夫酵母HFF501的全基因组测序与分析
(1)菌种基因组提取：使用天根生化科技(北京)有限公司的真菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)对纯化完成的菌株进行基因组的提取，并将基因组DNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序。
(2)分析：红法夫酵母HFF501的基因组全长18.8Mb，共注释得到3876个基因，在NCBI数据库中blast比对，同源性小于60％的基因有221个，占比为5.70％(具体见表1)。同时，将获得的全基因组与NCBI数据库中仅有的三株红法夫酵母的基因组序列进行比对，结果见图3-图5，红法夫酵母HFF501与Xden1(GeneBank登录号：GCA_001007165.2)有5430bp碱基的差异，与另外两条基因组比对，分别有14609bp碱基(红法夫酵母JCM 9681(GeneBank登录号：GCA_001600435.1))和19550bp碱基(红法夫酵母ASM157971v1(GeneBank登录号：GCA_001579715.1))的差异。此外，红法夫酵母HFF501具有独特的虾青素合成酶(Gene1796：Astaxanthin Synthase)，与数据库中已有的虾青素合成酶只有82.50％的最大相似性。由此可见，HFF501是一株全新的红法夫酵母菌。
表1：
blast同源性 基因数 比例(％)
≥95％ 2699 69.63
＜95％ 1177 30.37
＜90％ 747 19.27
＜80％ 415 10.71
＜70％ 295 7.61
＜60％ 221 5.70
＜50％ 127 3.28
利用DNAMAN 7找出红法夫酵母HFF501的4个特异性片段(S117：SEQ ID NO：1、S177：SEQ ID NO：2、S181：SEQ ID NO：3、S192：SEQ ID NO：4)，再利用Primer Premier6，根据特异性片段序列设计出各个片段的特异性引物，以便用于PCR鉴别菌株。将引物序列发送至博尚生物技术(上海)有限公司进行引物合成。
其中，S117扩增引物：
S117-F ACAACTCCAACCGTTCAC；(SEQ ID NO：5)
S117-R TGCTCCATCAACCACAAC。(SEQ ID NO：6)
S177扩增引物：
S177-F GAACCACAAGCGGAAGTA；(SEQ ID NO：7)
S177-R AACATCCAACAAGCGATCT。(SEQ ID NO：8)
S181扩增引物：
S181-F AGAGACAGAGATTGACTAACG；(SEQ ID NO：9)
S181-R TGACTGGATGTGGTATAGGA。(SEQ ID NO：10)
S192扩增引物：
S192-F ATCAGCCGACCTATCCTT；(SEQ ID NO：11)
S192-R ATTCTCATACTCCGACTCAG。(SEQ ID NO：12)
该菌株于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020413，分类命名为：Phaffia rhodozyma HFF501，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。该菌株(在本申请中命名为HFF501)是发明人从松树林的土壤中筛选分离获得的，该菌株具有高产虾青素的特点。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 厦门昶科生物工程有限公司
<120> 红法夫酵母菌及其用途
<130> 无
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcggcgagt acggaattga ccgatgcgaa tgtaacctgt gcaaagaaga acggcttgac 60
cctctggatg gacgtgagat atggtttgat gacctcgaat gggctttgga gtatgataat 120
acatatccgg agttgcaccg atagtcaatg gaaagatgta taaaccaccg agaagaactc 180
tcgagggagt catgaaaatg actcgttcta tcgaatcgac atacaactcc aaccgttcac 240
cgggtttcat gtctgagctc tgctgtcttt ataattgcct gtcgggcctt cacatgagcg 300
aagcgacggg cggcatgaag caccctgagg aaacgttgtg gttgatggag caagcggtgt 360
actggaagaa acgtgcgctt gagtgttgtg ggttcaaagg gatagagtct gat 413
<210> 2
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atctgaccgt agggtgaatt gaacacccgt cgtccgcgac ttgacgtttc ggttgaagaa 60
ccacaagcgg aagtactaac cactatacta tacgatcttg ttgtgaaggt cggcgctcgc 120
atggaacaag cgcagcttgc gagagatcgc ttgttggatg ttggg 165
<210> 3
<211> 520
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggcgtttg tgttcaccag aaacaagtcc tgggtccaga aggtgcaggg catacctgaa 60
gagcgctgga caggcaagaa agtagacgtc agtcggcttc gtgcgttcgg ctgtactgct 120
ttctatcaca taccgaacgc agacagaaag catgcactgt cgccaaaggg taagaaggca 180
gtctttgtcg gctacggcga agaaaacgga gtgaaaggct ggaaagtatg ggacgaagcg 240
aaggcaaacg tgatctcgtc agcaagcgtc aagttctggg aagacgactt ccagagacag 300
agattgacta acgtgacgga agacagcgag accccgttcg atatgccatg gacagcagtc 360
tcagctgtga gagagctgat tccagttgca tccactcagt atcagtcgcc ctatccttcg 420
ccctatcttc caaatcgata cgctcctata ccacatccag tcaagacaga aagtcctgat 480
gcaagtagtc gggatgatag atctaatgga tctgatgggt 520
<210> 4
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtgagaga gctgactcca gttgcatcca cccagcatca gccgacctat cctttgtcct 60
attcttccaa taggtattcc tctgttttgc atccggtcaa aacggaaagt cgtgaggcag 120
gcagtcagaa cagtgaaact gatgagactg agtcggagta tgagaattc 169
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acaactccaa ccgttcac 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctccatca accacaac 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaccacaag cggaagta 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacatccaac aagcgatct 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agagacagag attgactaac g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgactggatg tggtatagga 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atcagccgac ctatcctt 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
attctcatac tccgactcag 20

Claims (9)

1.一种红法夫酵母菌，于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020413。
2.如权利要求1所述的红法夫酵母菌，其特征在于，所述红法夫酵母菌具有四个特异性DNA片段，其核苷酸序列表如SEQ ID NO:1～4所示。
3.权利要求1所述的红法夫酵母菌在生产虾青素中的用途。
4.一种生产虾青素的方法，其特征在于，包括：
在适于虾青素表达的条件下，培养权利要求1所述的红法夫酵母菌，以便获得含有所述虾青素的培养物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养是在发酵培养基中进行的，所述发酵培养基中含有：酵母抽提物2～5g/L，(NH4)2SO4 0.2～0.4g/L，葡萄糖10～20g/L，蔗糖2～4g/L，柠檬酸钠2～3g/L。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH在6.0～6.5。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养是在22℃，搅拌转速为100rpm，罐压为0.04～0.05MPa，空气流量为1vvm的发酵罐中进行的。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为100～180h。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养是以10-30mL/h/L速率进行补料发酵；其中，补料培养基为葡萄糖200-300g/L。
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