CN111808763A - 一株产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母及其应用，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20126，保藏日期为2020年6月22日。本发明所提供的双倒卵形红酵母ZQ38属于海洋微生物来源，是天然类胡萝卜素的优良生产菌株，该菌株不产毒素，为非重组菌，安全性高，符合食品安全要求；培养要求简单，发酵条件易控制，营养需求低且类胡萝卜素产率高，该菌株在类胡萝卜素的生物合成方面具有广阔的应用前景。

Description

一株产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母及其应用

技术领域

本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及一株分离自海洋环境的产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母。

背景技术

类胡萝卜素(Carotenoids)是一类含40个碳的类异戊烯聚合物，因共轭双键的数目不同导致其颜色呈现变化，共轭双键的数目越多, 颜色越移向红色。类胡萝卜素作为抗氧化剂已被世界公认，是一种优良的食品添加剂和营养增补剂，广泛应用于食品、化妆品、医药、饲料等行业领域。

类胡萝卜素的生产主要有化学合成法、生物合成法和天然提取法。化学合成法制备的类胡萝卜素因溶剂残留等问题，其食品安全问题越来越受到社会的关注, 因此迫使人们寻求更为绿色的制备方法。从天然提取的类胡萝卜素虽然安全性高，但是因其含量低导致类胡萝卜素的提取工艺复杂、成本高。因此通过微生物发酵的生物合成法生产类胡萝卜素，是一种相对经济、产量高、安全性高的的生产方式，已成为类胡萝卜素制备的研究新热点。

微生物发酵生产类胡萝卜素的原料来源广泛，成本低，不受季节的影响，而且发酵工艺简单，生产效率高，着色稳定，天然安全。在微生物发酵生产类胡萝卜素的技术领域，酵母菌中的隐球酵母科、红酵母属，因不产毒素、安全性高尤其受到广泛关注。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过筛选获得一株产类胡萝卜素的海洋红酵母，经过鉴定，确定所筛选的菌株为产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母。

本发明提供的技术方案如下：一株产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母，分类命名为双倒卵形红酵母Rhodotorula diobovata，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20126，保藏时间为2020年6月22日，保藏地址为中国北京。

本发明的另一个目的是该双倒卵形红酵母用于类胡萝卜素的生产。

本发明的双倒卵形红酵母ZQ38，分离自山东省青岛市的海水环境中自然生长的裙带菜表皮，在WL营养琼脂培养基上生长菌落为中等大小，呈圆形或卵圆形，表面光滑湿润，中部隆起，菌落边缘整齐，且颜色均一，颜色为砖红色；显微镜观察菌体细胞形态为圆形或卵圆形，为多边芽殖。

本发明的双倒卵形红酵母ZQ38，培养容易，在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）、WL营养琼脂培养基上均生长良好，营养需求低，在20℃—35℃都能正常培养。

本发明的有益效果是：本发明为来自自然生境的双倒卵形红酵母，不产毒素，为非重组菌，安全性高，符合食品安全要求；培养要求简单，发酵条件易控制，营养需求低且类胡萝卜素产率高，该菌株在类胡萝卜素的生物合成方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为双倒卵形红酵母ZQ38在WL营养琼脂培养基上的生长特征图；

图2为双倒卵形红酵母ZQ38的显微镜形态观察特征图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：产类胡萝卜素的海洋红酵母筛选

1、培养基的准备

1）海洋红酵母筛选培养基为WL营养琼脂培养基：5g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，50g/L葡萄糖，0.55g/L磷酸二氢钾，0.425g/L氯化钾，0.125g/L氯化钙，0.125g/L硫酸镁，0.0025g/L氯化铁，0.0025g/L硫酸锰，0.022g/L溴甲酚绿，20g/L琼脂粉，0.1g/L氯霉素，pH6.5。上述培养基用陈海水配制，在115℃高压灭菌20min后倒平板备用，其中溴甲酚绿和氯霉素在灭菌培养基冷却至65℃时再单独加入。

2）产类胡萝卜素筛选培养基为：20g/L葡萄糖，2g/L硫酸铵，1g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，1g/L氯化钙，5g/L酵母粉，陈海水配制, pH自然。

2、海洋红酵母的筛选：取海水环境中自然生长的裙带菜5g，加入事先灭菌处理的装有500mL海水的三角烧瓶，振摇5min后，梯度稀释后涂布于WL营养琼脂培养基，在28℃的恒温摇床中培养4d，挑取菌落表面光滑湿润、颜色为红色的菌株，在WL营养琼脂培养基平板上经多次划线分纯，获得菌种纯培养。

3、产类胡萝卜素的海洋红酵母筛选：挑取一环筛选的海洋红酵母，加入事先灭菌的产类胡萝卜素筛选培养基，其装液量为100mL/500mL，在200r/min、28℃恒温摇床中培养72h后测定类胡萝卜素含量和菌体干重。

4、类胡萝卜素含量测定：发酵液4000 r/min离心15 min，弃去上清液后菌体沉淀物用蒸馏水洗涤2-3次，离心后弃去上清液，含菌体的离心管在烘箱中55℃烘干恒重。称取烘干至恒重的海洋红酵母0.1g，加入3mol/L盐酸2.4 mL，室温静置1h，在沸水浴中加热4min，冰水迅速冷却，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，沉淀水洗后再离心，重复 2 次，即得细胞碎片。在细胞碎片中加入 10mL 丙酮溶液，室温漩涡震荡15 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，重复浸提 2 次，所得上清液即为类胡萝卜素提取液，提取液在475nm处测定吸光值。类胡萝卜素含量（μg/g干菌体）=A×D×V/0.16×W，其中 A为 475 nm处的吸光值，D 为稀释倍数，V为丙酮用量（mL），W为酵母菌重量（g），0.16 为类胡萝卜素的摩尔消光系数。

筛选的菌株产类胡萝卜素的产量见表1，其中被检测的筛选得到的9株海洋红酵母中，菌株ZQ38的类胡萝卜素产量最高，达309.38μg/g。

表1 筛选的海洋红酵母产类胡萝卜素含量

实施例2：海洋红酵母ZQ38的菌属鉴定

形态特征：如图1所示，海洋红酵母ZQ38在WL营养琼脂培养基上生长菌落为中等大小，圆形或卵圆形，表面光滑湿润，中部隆起，菌落边缘整齐，且颜色均一，呈砖红色；如图2所示，显微镜观察菌体细胞形态为圆形或卵圆形，为多边芽殖。

通过微生物全自动分析仪进行生理生化鉴定，测试鉴定的结果如表2所示，符合红酵母的生理生化特征，初步判定为双倒卵形红酵母。

表2 海洋红酵母ZQ38的生理生化鉴定结果

海洋红酵母ZQ38的26S rDNA D1/D2 区域序列分析：CTAB法提取菌株ZQ38的基因组DNA，采用26S rDNA D1/D2 区域序列扩增的通用引物对进行扩增，扩增程序为： 94℃ 10min； 94℃ 30 s， 50℃ 30 s， 72℃ 1 min，35个循环； 72℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，利用凝胶回收试剂盒回收后送交公司测序。测序获得的其26S rDNA基因序列长度为618bp，在GenBank上经BLAST比对分析，发现该菌株与Rhodotorula diobovata（NG 042340.1）的26S rDNA序列高度相似，判定为同一种（相似度99.67%）。

结合形态学、生理生化指标和分子鉴定结果，确定海洋红酵母ZQ38为双倒卵形红酵母（Rhodotorula diobovata）。

具体基因序列见序列表。

实施例3：双倒卵形红酵母ZQ38发酵生产类胡萝卜素

1）菌种活化：将保藏在斜面的双倒卵形红酵母ZQ38菌种挑取1环，接种到50mL/250mL的三角瓶中，在28℃、200r/min条件下活化培养48h。所用的活化培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，陈海水配制，pH自然，115℃灭菌20min。

2）发酵生产类胡萝卜素

采用优选发酵培养基1：15g/L蔗糖，2g/L硫酸铵，1g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，1g/L氯化钙，5g/L酵母粉，陈海水配制, pH自然，装液量100mL/500mL，121℃灭菌20min。以6%（v/v）接种量接入活化菌种，在培养温度28℃和转速200r/min的恒温摇床中发酵培养3d，按照实施例1中的方法提取类胡萝卜素，测定发酵后样品中类胡萝卜素含量为461.86μg/g。

采用优选发酵培养基2：20g/L蔗糖、5g/L硫酸铵、2g/L的硫酸镁，陈海水配制，pH6，装液量100mL/500mL，121℃灭菌20min。以10%（v/v）接种量接入活化菌种，在培养温度28℃和转速160r/min的恒温摇床中发酵培养3d，按照实施例1中的方法提取类胡萝卜素，测定发酵后样品中类胡萝卜素含量为503.75μg/g。

采用优选发酵培养基3：20g/L蔗糖、4g/L硫酸铵、1g/L蛋白胨、1.5g/L硫酸镁，0.5g/L氯化钙，陈海水配制，pH 6.5，装液量100mL/500mL，121℃灭菌20min。以8%（v/v）接种量接入活化菌种，在培养温度28℃和转速180r/min的恒温摇床中发酵培养3d，按照实施例1中的方法提取类胡萝卜素，测定发酵后样品中类胡萝卜素含量为582.93μg/g。

应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分都属于现有技术。以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一株产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母及其应用

<130> 2020

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 618

<212> DNA

<213> 双倒卵形红酵母(Rhodotorula diobovata)

<400> 1

gcatatcaaa agcggaggaa aagaaactaa caaggattcc cctagtagcg gcgagcgaag 60

cgggaagagc tcaaatttat aatctggcac cttcggtgtc cgagttgtaa tctctagaag 120

tgttttccgc gttggaccgc acacaagtct gttggaatac agcggcatag tggtgaaacc 180

cccgtatatg gtgcggacgc ccagcgcttt gtgatacact ttcaatgagt cgagttgttt 240

gggaatgcag ctcaaattgg gtggtaaatt ccatctaaag ctaaatattg gcgagagacc 300

gatagcgaac aagtaccgtg agggaaagat gaaaagcact ttggaaagag agttaacagt 360

acgtgaaatt gttggaaggg aaacgcttga agtcagactt gcttgccgga gcttgcttcg 420

gtttgcaggc cagcatcagt tttccggggt ggataatgac ggtttgaagg tagcagtctc 480

ggctgtgtta tagctttccg ttggatacgc cctgggggac tgaggaacgc agcgtgcttt 540

ttgcgaaaga ctcgtctttt tcacgcttag gatgctggtg gaatggcttt aaacgacccg 600

tcttgaaacc acggacca 618

Claims (2)

1.一株产类胡萝卜素的双倒卵形红酵母，其特征在于，分类命名为双倒卵形红酵母Rhodotorula diobovata，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20126，保藏时间为2020年6月22日，保藏地址为中国北京。

2.一种权利要求1所述的双倒卵形红酵母在类胡萝卜素生产中的应用。

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