CN108823101B - 一株花青素产生菌株ch18及其应用 - Google Patents

一株花青素产生菌株ch18及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108823101B
CN108823101B CN201810070587.1A CN201810070587A CN108823101B CN 108823101 B CN108823101 B CN 108823101B CN 201810070587 A CN201810070587 A CN 201810070587A CN 108823101 B CN108823101 B CN 108823101B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
fermentation
anthocyanin
culture medium
solid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810070587.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108823101A (zh
Inventor
李艳菊
侯慧鹏
陶慧
杨正礼
张爱平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Institute of Technology BIT
Original Assignee
Beijing Institute of Technology BIT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Institute of Technology BIT filed Critical Beijing Institute of Technology BIT
Priority to CN201810070587.1A priority Critical patent/CN108823101B/zh
Publication of CN108823101A publication Critical patent/CN108823101A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108823101B publication Critical patent/CN108823101B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/77—Fusarium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及一株花青素产生菌株CH18及其应用，属于微生物技术领域。经鉴定菌株CH18为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，保藏号为CGMCC NO.14784。该菌株适生范围较宽，易培养，可利用农业固体废弃物、粮食原料以及多种培养基发酵生产花青素，工艺简便，成本低，生产周期短，花青素产量高，可周年生产。菌株CH18及其发酵产物无生物毒性，绿色环保。所产花青素可以广泛应用于医疗保健、食品、化妆品、护发固发、防龋固齿等领域，应用前景广阔。

Description

一株花青素产生菌株CH18及其应用
技术领域
本发明涉及一株花青素产生菌株CH18，属于微生物发酵与代谢产物领域。
背景技术
花青素(anthocyanidin)属于类黄酮化合物，具有多种生物活性功能,如抗氧化、清除自由基、抗癌、抗辐射、防止皮肤皱纹提早生成、消炎、降血糖、预防心血管疾病、治疗肠道感染、改善皮肤弹性、增进视力、改善睡眠、促进毛发生长、防龋健齿、可预防肥胖和关节炎等，且安全无毒，被广泛应用于医药、化妆品、保健品、食品等领域。
花青素是一种水溶性色素，存在于植物花瓣、果实、茎和叶的表面细胞和下表皮层中，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一，可以随着溶液酸碱度不同而改变颜色，酸性变红，碱性变紫，使花瓣呈现五彩缤纷的颜色。
目前，花青素主要从植物中提取，来源于蓝莓、葡萄、黑枸杞、黑加仑、越橘、酸果蔓、紫甘薯等多种水果和蔬菜。植物生长受季节、地域、温度等环境因素影响较大，且收获有季节性。利用微生物生产植物代谢产物，可避免植物生长周期长、受环境因素影响大等弊端，且生产成本低，可以工业化生产。目前，利用微生物生产植物代谢产物如紫杉醇和胡萝卜素等，已有研究报道。然而，有关利用微生物生产花青素的研究，国内外尚未见到报道。本发明筛选得到一株花青素产生菌，为利用微生物生产花青素开辟了一条新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够产生花青素的菌株CH18。
本发明所述的花青素产生菌株CH18，通过对其形态特征观察，基因组DNA提取，PCR扩增和18S rDNA-ITS序列分析，在NCBI数据库进行Blast比对，进化树构建，发现菌株CH18与Fusarium oxysporum菌的同源性最高，结合菌体的形态特征，确定该菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，命名为尖孢镰刀菌CH18(Fusarium oxysporum CH18)。该菌株2017年10月11日保藏在中国微中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.14784，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所述的花青素产生菌株CH18，可在pH值为2-12，温度为10℃-37℃条件下生长。同时，菌株CH18能在多种培养基质中生长并代谢花青素，可在农业固体废弃物、粮食原料中的一种或几种复合培养基以及马铃薯培养基、马丁氏培养基、无机盐培养基中生长并产生花青素。菌株CH18能够利用的碳源种类较宽，有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、燕麦粉、玉米粉等。
本发明中所述菌株CH18及其发酵代谢产物，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌指示菌均不产生抑制作用，即菌株CH18及其代谢产物包括花青素，无生物毒性，绿色环保，市场应用前途广阔。
本发明中所述菌株CH18具有产花青素的特性，采用下述技术方案：
1、菌株筛选
从不同地区采集多份土壤，用生理盐水稀释后，于牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏固体培养基、马铃薯固体培养基上涂布，分离菌株。定期观察并挑取平板中产红或紫色菌，转接入新的相同的固体培养基上进行划线纯化，直至为纯培养物；并对菌落形态进行观察。
取上述纯化菌落，接入马丁氏液体培养基培养，得到培养液。取培养液开展酸碱变色反应、类黄酮定性颜色反应以及紫外可见吸收峰测定等实验，对上述纯化得到的不同菌株逐一进行筛选，得到产花青素的菌株CH18。
2、菌株CH18菌落形态特征与分子学鉴定
菌株在马铃薯固体培养基中培养6d-8d，菌丝可铺满直径为9cm平板。菌丝絮状，高3～5mm，呈粉白色到紫色，部分紫色代谢产物可转移到培养基中，菌落反面呈现白紫相间或紫色，如果培养时间延长，菌落和培养基会呈现紫黑色。显微镜下观察，可见小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。厚垣孢子尖生或顶生，球形。
利用马丁氏液体培养基对菌株CH18进行活化培养，提基因组DNA，扩增菌株18SrDNA-ITS基因序列，测序，与NCBI数据库序列比对，构建进化树，再结合菌体的形态特征、确定菌株CH18属于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，并命名为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum CH18)。
3、菌株CH18发酵培养
(1)菌株CH18液体发酵培养
取试管斜面保存菌株CH18，挑菌丝接种于马铃薯培养基、马丁氏培养基、无机盐培养基液体发酵培养基，在温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min，活化培养2-3d，得到种子液；然后按照2％-10％接种量，将种子液接种到马铃薯、马丁氏、无机盐培养基液体发酵培养基中培养，培养的时间为3-10d，添加碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、燕麦粉、玉米粉中的一种或几种组合，添加量为10g/L-50g/L。发酵温度为20℃-37℃，转速为150r/min-200r/min，发酵3-10d，收获发酵液。
(2)菌株CH18固体发酵
固体发酵培养基质，有粮食原料与农业固体废弃物，粮食原料有大米、玉米、小麦、小米、燕麦等；农业固体废弃物有秸秆、麸皮、木屑、稻壳等，使用粮食以及农业固体废弃物中的一种或几种组合。
称量上述1种或几种组合的固体发酵原料，分别加入适量的自来水浸泡后，置于高压蒸汽灭菌锅中，115℃或121℃，高温灭菌20-30min。然后，向灭菌后的固体培养基中接入菌株CH18的种子液，接种量为4％-20％，每隔2-3天搅拌一次，待颜色变深时，收获固体发酵物产品。
CH18的种子液制备方法：菌株CH18接种到马丁氏、马铃薯或无机盐液体培养基，温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min，培养2-6天，可作为种子培养液。
4、花青素含量测定
菌株CH18液体发酵结束后，收集菌液，正丁醇做浸提液浸提。同时，用同种方法浸提市售新鲜蓝莓中含的花青素，取不同浸提液于200nm-800nm之间进行紫外全波段扫描，确定菌液浸提液吸收峰的波段，采用紫外可见分光光度计测定吸收峰大小，并计算相对含量。通过对比计算发现，菌体干重和蓝莓干重的质量相同的条件下，菌株产花青素的量是蓝莓产花青素的1-1.5倍。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的菌株CH18是一种花青素产生菌，可用于微生物源花青素生产，拓展出一条微生物生产花青素的新途径与微生物一个新应用领域。
2、本发明提供的菌株CH18，适生范围较宽，易培养，可利用农业固体废弃物、粮食原料以及多种培养基发酵生产花青素，工艺简便，成本低，生产周期短，避免了现有技术利用植物资源生长周期长、受季节和环境影响大等弊端，可以一年四季进行规模生产。
3、本发明所述菌株CH18及其代谢产物包括花青素，无生物毒性，绿色环保。花青素产量较高，液体发酵培养中，花青素产量相当于相同干重蓝莓花青素含量的1-1.5倍。菌株所产花青素可以应用于医疗保健、食品、化妆品、护发固发、防龋固齿等领域，应用前景广阔。
附图说明
图1为菌株CH18的菌落形态图。
图2为菌株CH18显微形态图。
图3为菌株CH18产花青素的全波段扫描图。
图4为菌株CH18的ITS序列系统发育树。
图5为菌株CH18发酵产物对细菌的抑菌结果图(A-金黄色葡萄球菌、B-藤黄微球菌；图中右上角为金霉素抗生素溶液对照，其余为实验组)。
具体实施方式
下面具体实施方式，是对本发明技术方案作进一步具体的说明，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。
实施例1：菌株CH18的筛选与鉴定
1、菌株CH18分离与纯化
(1)从不同地区采集多份土壤，然后用生理盐水按照1:10,1:100，1:1000,1:10000；1:100000梯度，进行稀释。取100-200ul稀释液于牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯固体培养基、马丁氏固体培养基、无机盐固体培养基上分别涂布，在20℃-37℃条件下培养，每个稀释度设置三个平行。
(2)取上述平板中生长菌落，在马铃薯培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏固体培养基、无机盐固体培养基上划线进行分离，室温培养2-8天，挑取有颜色的菌落，在马铃薯培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏固体培养基划线，直到获得单菌落，试管斜面保存。
所用的培养基配方如下：
马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖10-20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
马丁氏培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4 7H2O 0.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
无机盐培养基配制：磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠0.2g，硝酸铵2.0g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，硫酸锰0.01g，七水合硫酸亚铁0.01g，葡萄糖10-20g，蒸馏水1000mL，摇匀，自然pH，115℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10g-15g。
2、花青素产生菌株筛选
挑取上述步骤1中纯化好且产色的菌落，接种于马铃薯液体培养基与无机盐液体培养基中，于20℃-37℃，150r/min-200r/min条件下，震荡培养3-10d，获得发酵液。对不同菌株的发酵液，分别进行酸碱变色反应、类黄酮定性颜色反应以及紫外可见吸收峰波段测定，确定花青素产生菌。方法如下：
(1)酸碱变色反应：将纯化菌株液体发酵液，分别配制成pH值为2，4，6，8，10，12系列溶液，通过酸碱变色反应，pH小于4呈红色，pH 4-10呈紫色，pH大于10呈深紫色，初步判断产花青素菌株，初步筛选出菌株CH18。图1为菌株CH18的菌落形态图。
(2)类黄酮定性颜色反应：具体操作为，发酵液中加入氯化铁的溶液，观察溶液是否变为灰黑色，静置一段时间是否有黑色沉淀产生。同时，向发酵液中加入氯化铝溶液，溶液瞬间变为黄色后，又迅速变为粉色，静置一段时间粉色物质沉降，根据这些类黄酮特征颜色反应检测结果，可进一步判断花青素产生菌。通过类黄酮定性颜色反应，发现菌株CH18发酵可产生类黄酮化合物。
(3)紫外可见吸收峰测定：取发酵液，利用紫外可见分光光度计从200nm-800nm进行全波段扫描，根据在紫外区260nm-280nm是否有吸收峰，在可见光区500nm-550nm是否有吸收峰，可进一步判断是否产生花青素。菌株CH18发酵液在紫外和可见光区域，均具有花青素特异吸收峰。图3为菌株CH18产花青素的全波段扫描图。
3、菌株CH18鉴定
3.1菌落形态特征观察
菌株CH18在马铃薯固体培养基中培养6d-8d，菌丝可铺满整个平板。菌丝分枝生长，絮状，菌丝高3～5mm，菌落呈粉白色或紫色，部分紫色代谢产物可转移到培养基中，菌落反面呈现白紫相间或紫色，如果培养时间延长，菌落呈现紫黑色。
3.2显微形态特征观察
显微镜下观察菌株CH18形态，可见小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。厚垣孢子尖生或顶生，球形。图2为菌株CH18显微形态图。
3.3菌株CH18分子生物学鉴定
3.3.1菌株CH18的基因组提取
(1)挑取试管斜面菌株CH18，接种到马丁氏液体培养基中，在温度为20℃-37℃，150-200r/min，培养为3-5天，过滤收集菌体。
(2)将步骤(1)中培养得到的菌体转入研钵中，加入少量液氮，反复研磨至菌体呈粉末状。将研磨好的菌体转入1.5mL的EP管中，加入600μL 65℃预热的SDS裂解液，65℃保温30min，期间不断摇匀。
(3)置于冰中冷却至室温，然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新EP管中。
(4)向新EP管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液(24:1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新EP管中。
(5)向上清中加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。
(6)4℃，10000r/min，离心10min，弃上清。
(7)使用500μL 70％的冰乙醇洗涤DNA 2-3次，然后倒置晾干，加入50μL的TE溶解。
(8)用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.3.2PCR扩增
采用真菌通用引物ITSI(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，扩增菌株18SrDNA-ITS基因序列。PCR扩增采用50μL反应体系：5μL 10×PCR Buffer，1μL dNTP mix，2μL DNA模板，4μL NL1(或ITS1)(5p)，4μL NL4(或ITS4)(5p)，0.25μL Taq HS，37.75μL ddH2O。
PCR反应条件：95℃ 5min，循环一次；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，循环35次；72℃ 7min。PCR循环结束后取PCR产物2μL，加6μL上样缓冲液，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。
3.3.3测序及系统发育树构建
将扩增得到的序列，送北京诺赛基因组研究中心测序，得到菌株CH18的ITS区长度为547bp。得到菌株CH18的18SrDNA-ITS基因序列如下：
Figure BDA0001553480350000081
Figure BDA0001553480350000091
将上述测序结果与网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中基因序列比对，发现菌株H18的18SrDNA-ITS基因序列与Fusarium oxysporum中的一些菌株的ITS序列的同源性最高。在NCBI里查找相关菌株序列，用Clustalx软件进行序列比对，再用MEGA6.0软件构建系统发育树，图4为菌株CH18的ITS序列系统发育树。结果显示，菌株CH18与菌株Fusariumoxysporum Ppf15聚于同一分支，系统发育关系最为密切。
3.3.4菌株CH18鉴定为新功能菌株
根据菌株CH18菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，确定菌株CH18为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，并命名为尖孢镰刀菌CH18(Fusarium oxysporum CH18)。该菌株于2017年10月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.14784，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
目前，国内外尚无文献报道尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有产花青素的功能。因此，尖孢镰刀菌CH18为一株具有产花青素的新功能微生物菌株。
实施例2：菌株CH18发酵培养与花青素测定
一、菌株CH18的培养与发酵
1、菌株CH18的培养
研究发现，菌株CH18适生范围宽，在pH为2-12，温度在20℃-37℃均能生长，具有较宽的酸碱耐受性。同时，在多种培养基中，如马丁氏培养基、马铃薯培养基、无机盐培养基中均能生长。可用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、燕麦粉、玉米粉等。另外，菌株CH18在粮食与农业固体废弃物中的至少一种或几种组合基质上也能生长。这里所指粮食原料有大米、玉米、小麦、小米、燕麦等；农业固体废弃物有秸秆、麸皮、木屑、稻壳等。
2、菌株CH18液体发酵
(1)菌株活化
挑取试管斜面保存的菌株CH18，分别接种于马铃薯、马丁氏、无机盐液体发酵培养基中，在温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min条件下，活化培养2-3d，活化培养代数1-2代。
(2)发酵培养
取上述(1)中活化的菌液，按照2％-10％接种量，分别接种于马铃薯、马丁氏、无机盐液体发酵培养基中，在温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min条件下，培养3-10d。马铃薯、马丁氏、无机盐发酵培养基的配方如下：
(1)马铃薯发酵培养基：马铃薯200g，碳源10g-50g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20-30min。
(2)马丁氏发酵培养基：蛋白胨5.0g，磷酸二氢钾0.35g，硫酸镁0.175g，碳源10g-50g，蒸馏水1000mL pH自然，121℃ ℃灭菌15-20min。
(3)无机盐发酵培养基：磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠0.2g，硝酸铵2g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，硫酸锰0.01g，七水合硫酸亚铁0.01g，碳源10g-50g，蒸馏水1000mL，摇匀，自然pH，121℃灭菌15-20min。
上述发酵培养基中选用的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、燕麦粉、玉米粉中的1种或几种组合；总添加量为10g/L-50g/L。
3、菌株CH18固体发酵
所用固体发酵原料有粮食原料以及农业固体废弃物等原料，使用粮食以及农业固体废弃物中的至少1种或几种组合。粮食原料有大米、玉米、小米、燕麦等，农业固体废弃物有秸秆、荞麦、麸皮、木屑等。
称量上述固体发酵原料，分别加入适量的自来水浸泡后，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20-30min。然后，向灭菌后的固体培养基中接入菌株CH18的种子液，接种量为4％-20％，每隔2-3天搅拌一次，待颜色变深时，收获花青素固体发酵产品。
CH18的种子液制备方法：菌株CH18接种到马丁氏、马铃薯或无机盐培养基中，在温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min，培养3-6天，至颜色变深时，可作为种子培养液。
二、菌株CH18发酵液中花青素含量测定
1、菌株CH18发酵液中花青素的提取
分别称量3组菌液，均为10.0000g左右，置于50mLEP管中，设置三组平行试验。用正丁醇做浸提液，用JY92-IIN超声波细胞粉碎机进行破碎，再将其于置于超声清洗机中，超声30min-60min，过滤，收集滤液。重复上述操作至菌液中的花青素全部被正丁醇浸提出来。
2、新鲜蓝莓中花青素的提取
分别取市售蓝莓3组，称量0.4g-0.6g，置于50mLEP管中，设置三组平行试验。用正丁醇做浸提液，提取方法与上述1中方法相同。
3、花青素含量测定
用正丁醇做基线，对产花青素正丁醇浸提液与蓝莓花青素的正丁醇浸提液进行紫外全波段扫描，波长范为200nm-800nm。
由于菌液中含水率高于蓝莓中含水率，根据含水率测定，确定蓝莓与菌液干重相同情况下的取样量，分别称取蓝莓和菌液浸提液，确定吸收峰波段，可根据吸光度Abs判断菌液产花青素量。结果显示，在菌液干重与蓝莓干重相同情况下，菌株CH18产花青素量是蓝莓的1-1.5倍。
菌株CH18发酵周期短，工艺简便，发酵规模可以人为控制，可周年生产，产量高，具有很高的开发应用价值。
实施例3：菌株CH18及其代谢产物抑菌实验
1、菌株CH18及其发酵产物对细菌毒性测试
(1)菌株CH18发酵液与固体发酵产物的制备
菌株CH18发酵液的制备：吸取菌株CH18发酵液4mL-10ml，于800R离心10min，得到上清液，应于抑菌活性测定。
菌株CH18固体发酵产物的制备：吸取菌液CH18接种粮食或者接种到农业固体废弃物基质中的一种或几种混合基质上，在20-37℃条件下，培养5-20d，取样，应于抑菌活性测定。
(2)抗生素对照组溶液的配置：
称量20.0mg金霉素，置于100mL蒸馏水中，配成200mg/L的金霉素溶液。
(3)指示菌活化培养：从-20℃冰箱中取出革兰氏阳性菌：藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌：大肠杆菌，四种指示细菌，将其接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于30-37℃，160r/min-180r/min，培养1-2天。
(4)抑菌试验
采用抑菌圈法测定：使用大肠杆菌，藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌作为指示菌。取上述活化好的大肠杆菌，藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌培养液，稀释，使其OD600nm在1.0左右。然后吸取100-200uL的菌液于Ⅱ号固体培养基上，将菌液均匀涂布在培养基上，直至菌液涂干。接入抗生素对照液少许和上述(1)中待测样，三组平行，然后置于20-37℃培养箱中培养，每隔24h观察一次。菌株CH18及其固体发酵产物、液体发酵液对指示菌大肠杆菌、藤黄、金黄微球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小均为零，图5为菌株CH18发酵产物对指示细菌的抑菌结果图，A为金黄色葡萄球菌涂板、B为藤黄微球菌涂板；图中右上角为金霉素抗生素溶液抑菌圈，其余为菌株CH18和发酵产物实验组。由此说明菌株CH18和发酵产物对细菌没有毒性。
Ⅱ号固体培养基配方：蛋白胨6g，牛肉膏1.5g，酵母浸粉6g，葡萄糖1g，琼脂10-15g，水1000mL，115℃，高温灭菌20min。
与此同时，对菌株CH18及其发酵产物抑制真菌活性进行了测定，抑菌试验方法采用对峙法。对峙实验选用指示真菌有：镰刀菌属、镰隔孢属、曲霉属、地霉属、帚霉属中的至少一种。通过对峙实验发现，菌株CH18及其发酵产物对真菌指示菌没有抑制作用，说明菌株CH18及其发酵产物对真菌没有生物毒性。
通过上述菌株CH18及其发酵产物的抑菌试验，发现菌株CH18及其发酵产物包括花青素，无生物毒性，绿色环保，可应用于食品、医疗保健、化妆品、护发固发、防龋固齿等领域，应用前景广阔。
以上所述的实施例为本发明的目的、技术方案和有益效果的说明，本发明的实施方式不受上述实施例的限制，任何在本发明的精神和原则范围内所做的改进、简化、替代、组合等，均视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京理工大学
<120> 一株花青素产生菌CH18及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 547
<212> DNA
<213> Fusarium oxysporum
<400> 1
ctccgtaggg tgaacctgcg gagggatcat taccgagttt acaactccca aacccctgtg 60
aacataccac ttgttgcctc ggcggatcag cccgctcccg gtaaaacggg acggcccgcc 120
agaggacccc taaactctgt ttctatatgt aacttctgag taaaaccata aataaatcaa 180
aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagca aaatgcgata 240
agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc 300
cagtattctg gcgggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa ccctcaagca cagcttggtg 360
ttgggactcg cgttaattcg cgttccccaa attgattggc ggtcacgtcg agcttccata 420
gcgtagtagt aaaaccctcg ttactggtaa tcgtcgcggc cacgccgtta aaccccaact 480
tctgaatgtt gacctcggat caggtaggaa tacccgctga acttaagcat atcaataagc 540
ggaggaa 547

Claims (10)

1.一株花青素产生菌株CH18，其特征在于：通过形态特征观察与分子生物学鉴定，确定菌株CH18为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；该菌株2017年10月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.14784。
2.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CH18，其特征在于：菌株CH18产花青素的鉴别方法采用酸碱变色反应、类黄酮定性颜色反应、紫外可见吸收峰波段测定多步骤相组合的鉴别方法。
3.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CH18，其特征在于：菌株CH18在pH值为2-12，温度为20℃-37℃条件下能生长。
4.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CH18，其特征在于：该菌株能在农业固体废弃物、粮食原料、马铃薯发酵培养基、马丁氏发酵培养基以及无机盐发酵培养基中生长；这里的粮食原料是指大米、玉米、小麦、小米、燕麦中的1种或多种组合；农业固体废弃物是指秸秆、麸皮、木屑、稻壳中的1种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CH18的应用，其特征在于通过液体发酵或固态发酵生产花青素。
6.根据权利要求5所述菌株CH18的应用，其特征在于，液体发酵生产花青素方法包括步骤：(1)菌株活化：活化用培养基为马铃薯发酵培养基或马丁氏发酵培养基或无机盐发酵培养基，菌株CH18在温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min条件下，进行活化培养2-3d，活化培养代数1-2代；(2)发酵培养：取上述步骤(1)中活化的菌液，分别接种于马铃薯发酵培养基或马丁氏发酵培养基或无机盐发酵培养基中，培养3-10d，收获发酵液；发酵培养基的配方为：
(1)马铃薯发酵培养基：马铃薯200g，碳源10g-50g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20-30min；
(2)马丁氏发酵培养基：蛋白胨5.0g，磷酸二氢钾0.35g，硫酸镁0.175g，碳源10g-50g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌15-20min；
(3)无机盐发酵培养基：磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠0.2g，硝酸铵2g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，硫酸锰0.01g，七水合硫酸亚铁0.01g，碳源10g-50g，蒸馏水1000mL，摇匀，pH自然，121℃灭菌15-20min。
7.根据权利要求6所述的菌株CH18的应用，其特征在于：发酵培养的接种量为2％-10％，发酵温度为20℃-37℃，转速为150r/min-200r/min；所述发酵培养基的碳源是指葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、燕麦粉、玉米粉中的1种或几种组合。
8.根据权利要求5所述的菌株CH18的应用，其特征在于：菌株CH18通过固态发酵生产花青素，方法包括下述步骤：称量粮食原料或农业固体废弃物中的1种或几种组合的固体发酵原料，分别加入适量的自来水浸泡后，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20-30min；然后，向灭菌后的固体培养基中接入菌株CH18的种子液，接种量为4％-20％，每隔2-3天搅拌一次，待颜色变深时，收获花青素固体发酵产品；这里的粮食原料是指大米、玉米、小麦、小米、燕麦中的1种或多种组合；农业固体废弃物是指秸秆、麸皮、木屑、稻壳中的1种或多种组合。
9.根据权利要求8所述的菌株CH18的应用，其特征在于：菌株CH18的种子液的制备方法为：菌株CH18接种到马丁氏发酵培养基或马铃薯发酵培养基或无机盐发酵培养基中，在温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min，培养2-6 天，作为种子培养液。
10.根据权利要求5所述的菌株CH18的应用，其特征在于：菌株CH18及其液体发酵液和固体发酵产物，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌指示菌均不产生抑制作用，无生物毒性；这里所指的革兰氏阳性菌是指藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌是指大肠杆菌；真菌是指镰刀菌属，镰隔孢属，曲霉属，地霉属，帚霉属中的至少1种。
CN201810070587.1A 2018-01-19 2018-01-19 一株花青素产生菌株ch18及其应用 Active CN108823101B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810070587.1A CN108823101B (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一株花青素产生菌株ch18及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810070587.1A CN108823101B (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一株花青素产生菌株ch18及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108823101A CN108823101A (zh) 2018-11-16
CN108823101B true CN108823101B (zh) 2021-08-27

Family

ID=64154557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810070587.1A Active CN108823101B (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一株花青素产生菌株ch18及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108823101B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305797B (zh) * 2019-06-18 2020-09-08 北京理工大学 一株花青素产生菌株cj6及其应用
CN110438012B (zh) * 2019-08-05 2021-10-26 四川大学 一种产花青素的萨氏曲霉h-1及其应用
CN114480532A (zh) * 2022-01-26 2022-05-13 北京理工大学 菌株ch18在制备花青素与其它黄酮类化合物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061268A (zh) * 2010-11-29 2011-05-18 湖南农业大学 一种产天然紫红色素菌株l4
CN103788683A (zh) * 2012-10-31 2014-05-14 江苏汉邦科技有限公司 一种镰刀霉菌色素的制备方法
BR102013015305A2 (pt) * 2013-06-18 2015-06-30 Univ Fed De São João Del Rei Processo de produção e aplicação de pigmento oriundo do fungo fusarium oxysporum
KR20170054623A (ko) * 2015-11-09 2017-05-18 대한민국(농촌진흥청장) 홉 대체로 쑥을 이용한 맥주의 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0204008A (pt) * 2002-09-11 2004-06-01 Unicamp Novo processo de monitoramento ambiental de herbicidas por fusarium oxysporum

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102061268A (zh) * 2010-11-29 2011-05-18 湖南农业大学 一种产天然紫红色素菌株l4
CN103788683A (zh) * 2012-10-31 2014-05-14 江苏汉邦科技有限公司 一种镰刀霉菌色素的制备方法
BR102013015305A2 (pt) * 2013-06-18 2015-06-30 Univ Fed De São João Del Rei Processo de produção e aplicação de pigmento oriundo do fungo fusarium oxysporum
KR20170054623A (ko) * 2015-11-09 2017-05-18 대한민국(농촌진흥청장) 홉 대체로 쑥을 이용한 맥주의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enhancement of anthocyanin production in callus cultures of Daucu$ carota L. under the influence of fungal elicitors;L. Rajendran,等;《Appl Microbiol Biotechnol》;19941231;第42卷;第227-231页 *
两株尖孢镰刀菌菌株产色素条件的研究;肖姬玲;《湖南农业科学》;20150430(第4期);第105-108页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108823101A (zh) 2018-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108823101B (zh) 一株花青素产生菌株ch18及其应用
CN109456921B (zh) 一种多粘类芽孢杆菌、应用及微生物菌剂、粉剂和颗粒剂
CN104996543B (zh) 一种改良型水产品生物保鲜剂，其制备方法及用途
CN112625952B (zh) 一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种及其在抑制蓝藻水华中的应用
CN108901615A (zh) 利用金莲花药性培养基培养蛹虫草菌丝体的方法
CN115710566B (zh) 一种用于稻田综合种养的菌株及其应用
CN102174414B (zh) 一种新的肋脉羊肚菌m8-13液体发酵物在保健品及医药开发中的应用
CN108913622B (zh) 一种巨大芽孢杆菌bm22及其芽孢粉剂的制备和应用
CN105462882B (zh) 一种用于防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用
CN110305797B (zh) 一株花青素产生菌株cj6及其应用
CN108841752B (zh) 巨大芽孢杆菌bm22及其芽孢液体制剂在防治仙客来黑根病中的应用
CN102986536A (zh) 一种毛柄金钱菌菌株及制备方法
CN116536207A (zh) 一种萎缩芽孢杆菌wlkysy-4、生物菌剂及应用
CN115806913A (zh) 野尻链霉菌（Streptomyces nojiriensis）菌株9-13及应用
CN106011023B (zh) 一株分离自传统发酵食品酸粥的醋酸菌及其应用
CN109504611B (zh) 一株白及内生真菌1-g1及其应用
CN106399121A (zh) 一种紫色红曲菌菌株
CN111411046A (zh) 一种深色有隔内生真菌菌剂与应用
CN112063554A (zh) 一种生物防治菌Pantoea jilinensis D25及其应用
CN117305135B (zh) 一株拟康氏木霉t0027及其在防治猕猴桃软腐病中的应用
CN115786131B (zh) 一种矢车菊素生产菌株及其应用
CN115873727B (zh) 一株刺梨单宁高效降解菌sl006及其应用
CN111592988B (zh) 一株桑树内生拮抗菌新种柄孢壳菌及其应用
CN117187130B (zh) 一株产ddp-iv抑制剂的泛菌及其应用
CN113832039B (zh) 一株具有抗真菌活性的工业大麻内生真菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant