CN105733951B

CN105733951B - 一株能产生油脂的小球藻及其应用

Info

Publication number: CN105733951B
Application number: CN201410758047.4A
Authority: CN
Inventors: 陈三凤; 李琴
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2034-12-10
Also published as: CN105733951A

Abstract

本发明公开了一株能产生油脂的小球藻及其应用，属于微生物应用领域。本发明的能产生油脂的小球藻为兼氧型小球藻34‑2，保藏编号为CGMCC NO.9225。该小球藻能在宽广pH范围(pH 3‑11)中生长，具有很强的除氮和磷的能力，氮、磷等污染物去除率分别可达60％和85％，并能够在养猪场污水中快速生长，能积累30％的油脂。将本发明的小球藻置于养猪污水中生长，一方面解决了养殖废水处理问题，降低环境污染，另一方面废水中营养成分为微藻生长提供了营养，并降低了微藻生物柴油的生产成本，具有较好的经济效益。

Description

一株能产生油脂的小球藻及其应用

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种能产生油脂的小球藻及其应用。

背景技术

资源、能源和环境是当前人类社会发展面临和必须解决的三大难题，我国是世界上经济发展最为迅速的国家之一，对能源的需求量长期持续高速增长，石油供给远不能满足经济发展的需要。2009年，我国累计进口原油2.04亿吨，对国际依存度首次超过50％。国际石油价格的波动，不仅增加了购买石油的外汇消耗，而且给我国的可持续发展带来潜在威胁。发展替代能源是保障我国能源安全的重大战略举措。

微藻是生产生物柴油的优质原料。微藻的产油率是油料作物如大豆的30-100倍，为生产替代性燃料油奠定了基础。藻类以光能作为能源，利用氮、磷等营养物质合成复杂的有机质。因此，藻类可降低污水中的氮、磷含量。对污水中氮、磷的去除起到了较好的效果。另外制约微藻生物柴油发展的瓶颈性因素为成本太高，利用污水养殖微藻为节约成本起到了一定的作用。

近年来，我国养猪产业得以快速发展，养猪废水因含有大量的氮、磷及极高浓度的有机物，被视为高浓度污水，直接排放会导致水体富营养化，污染水源。此外，养猪废水携带大量的病原菌、散发极浓的臭味，日益对环境造成严重污染。按党的十八大报告“要大力推进生态文明建设、建设美丽中国”要求，防止养猪废水污染、保护生态环境已刻不容缓。

微藻自身含油量高，可以用各种水体养殖，具有不占用耕地等优势，但利用微藻生产生物柴油的方法存在很多问题，成本太高阻碍了该项技术的产业化。本发明利用养猪废水培养微藻，不仅解决了养猪废水直接排放的环境污染问题，还实现了养猪废水的资源化利用，降低了微藻生产生物柴油的成本，对能源和环境两方面均产生了积极的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一株能产生油脂的小球藻及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明的小球藻(Chlorella sp.)是从安徽省宣城市某村庄路边水沟中分离筛选到的一株小球藻，命名为34-2。其在BG11固体培养基上生长良好，细胞绿色，单细胞，球形，直径在4-8μm，每个细胞内有一个杯状的色素体，具有一个蛋白核，细胞壁较薄(图1)。该小球藻基因组包含核酸序列18SrDNA和细胞核编码的核糖体内部转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)序列。根据序列比对和显微观察，本发明的34-2应是隶属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、小球藻科(Chlorellales)、小球藻属(Chlorella)该菌株已于2014年5月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为小球藻Chlorella sp.，保藏号为CGMCC No.9225。

本发明提供了含有小球藻34-2的菌剂。

本发明提供了小球藻34-2或含有其的菌剂在制备生物油脂中的应用。

本发明提供了小球藻34-2或含有其的菌剂在提高生物油脂产量中的应用。

本发明提供了小球藻34-2或含有其的菌剂在污水清洁中的应用。

本发明提供了小球藻34-2或含有其的菌剂在减少养殖场废水污染中的应用。

本发明提供了小球藻34-2或含有其的菌剂在降低废水中氮磷含量的应用。

其中，降低废水中氮磷含量的最佳培养条件为通风、自然光照、温度25-35℃，培养7-10天。

本发明还提供一种生产生物油脂的方法，将小球藻34-2接种于养殖场污水中培养。

本发明方法中，小球藻34-2产油脂的适合培养条件为通气培养，自然光照，温度20-40℃。优选25-35℃。

其中，培养环境的pH值为3-11。

本发明提供的小球藻(Chlorella sp.)34-2，具有抗污能力强，可以在不灭菌的养猪废水中利用其碳、氮、磷等元素为营养物质迅速生长，沉降性好，易收集。该小球藻还具有很强的除氮和磷的能力，养猪污水经小球藻34-2处理后，氮、磷等污染物去除率分别可达60％和85％。同时，该株藻能将污水中的碳源污染物转化成生物油脂，油脂含量达30％。此外，该藻的生长对温度和pH范围适应较广，分别是在20-40℃和3-11之间，具有较大的生产应用潜力。将本发明的小球藻置于养猪污水中生长，一方面解决了养殖废水处理问题，降低环境污染，另一方面废水中营养成分为微藻生长提供了营养，并降低了小球藻藻生产生物柴油的生产成本，具有优良的经济价值。

附图说明

图1为小球藻34-2在显微镜下的形态。

图2为根据小球藻34-2的18SrDNA部分序列构建的系统发育树。

图3为小球藻34-2在不同pH条件下的生长情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1小球藻34-2(CGMCC NO.9225)的鉴定

1、形态特征：

小球藻(Chlorella sp.)34-2在显微镜下进行观察(见图1)，该藻株呈球状或卵形，直径4-8um之间，每个细胞内有一个杯状色素体，具有1个细胞核，细胞壁较薄；检索《中国淡水澡类-系统、分类及生态》，发现此藻在形态上分类相同的为绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、小球藻科(Chlorellales)、小球藻属(Chlorella)。

2、分子特征：

用CTAB法(参考《Molecular systematics》)提取34-2基因组DNA：收集平稳生长期内的藻液4mL，离心加入1mLCTAB缓冲液，65℃水浴2-3h，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提2次，离心取上清，加入上清2倍体积无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后溶于一定体积灭菌双蒸水中。

表1用于克隆ITS及18SrDNA基因的引物

以提取的小球藻34-2的纯培养物提取基因组DNA为模板，以表1中ITS-P1和ITS-P2为上下游引物，PCR扩增ITS部分序列，结果得到了为690bp左右的条带，然后将此条带进行回收纯化，并送交测序。利用引物18S P1和18S P2(表1)扩增该微藻中的18S rDNA序列，测序结果进行BLAST比对，结果显示此菌株属于小球藻属(Chlorella)。该藻株Chlorellasp.34-2已于2014年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.9225，分类命名为小球藻(Chlorellasp.)。

本发明在PCR扩增ITS部分序列和扩增18S rDNA序列时，所用扩增体系为：

扩增条件

18SrDNA序列的扩增：

ITS序列的扩增：

本发明小球藻的ITS序列见SEQ ID NO.1，小球藻的18S rDNA的序列见SEQ IDNO.2。利用NCBI数据库中的BLAST工具对小球藻34-2的18SrDNA和ITS部分序列进行序列相似性分析。选取部分同源序列和该藻株的18SrDNA和ITS部分序列利用clustalx软件进行序列同源进化比对，形成一个多重序列匹配排列矩阵。然后，运用Mega4.0软件，采用邻位(Neighbor-joining)算法，自展数据集bootstraps值为1000构建系统发育进化树(见图2)。图3说明本发明中的微藻属于小球藻属(Chlorella)。

实施例2小球藻34-2生长环境pH值测定

将BG11培养基调节为不同的起始pH，将小球藻34-2分别接种至不同pH的BG11培养基(将OD540nm值为0.8的小球藻34-2以20％的体积比接种于各培养基中，小球藻34-2在培养基中的OD540nm值均为0.2左右)，28℃培养8天。检测各个培养液的OD540nm值，结果表明，小球藻34-2能在宽广的pH(pH3-11)的范围内均能生长(见图3)。

实施例3小球藻34-2在养猪场废水中扩大培养及氮磷去除情况

猪场养殖污水取自北京崔村宏运养殖场。因污水浊度高、颜色深、悬浮固体量大，故实际参数测定时需对取回的养猪废水进行自然沉降，用纱布过滤，离心1500rpm的预处理，并适当稀释后参照水和废水监测分析方法(第4版)(国家环境保护总局，2002)测定上清中氮磷，总氮测定采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法，总磷测定采用钼酸铵分光光度法。金属元素含量测定采用等离子发射光谱法。取回的污水水质条件见表2。

表2试验用猪场污水的水质状况

取上述废水3L，用去离子水稀释至15L，将稀释5倍的废水转入光合反应器中，将生长至对数期的纯种微藻种子液按2％的接种量接种，通气培养，自然光照，温度25-35℃。培养7天后测定，结果表明，小球藻对氮的去除率达60.24％，磷的去除率达85％(见表3)。

表3小球藻34-2培养前后水体中氮磷含量

实施例4小球藻34-2在猪场污水中生长的生物量和油脂含量测定

取猪场污水2升，用自来水稀释至20升，将稀释10倍的污水转入光合反应器中，将生长至对数期的纯种微藻种子液，按2％的接种量接种，使用柱式反应器，培养过程中通气培养，自然光照，底部通入压缩空气，温度在25-35℃区间内。培养过程中间间断取样测定干重；培养10天后将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥置于冷冻干燥机中干燥。每升培养液得到1.65g干燥藻体(生物量为1.65g/L)。

采用改进的酸热法对微藻油脂进行提取。称取0.5g干藻粉，加入20mL 4mol/L的HCl溶液，室温放置30min后沸水浴3min，然后冰浴速冷。将处理好的样品转入50mL玻璃离心管，加入等体积(20mL)体积比为1：2的氯仿：甲醇溶液，振荡混匀，5000r/min 离心5min，取下层溶液于预先称重的玻璃离心管中，置通风橱中氮气吹干。结果表明，小球藻34-2在养殖场污水培养后油脂含量较高，约为30％。

本发明中的小球藻34-2能在宽广的pH(pH 3-11)中生长，在20-40℃范围内也能很好地生长。同时，在猪场养殖废水中，能积累生物量和油脂，对氮、磷有较强的去除效果，是一株在养猪废水处理耦合高价值生物质生产应用中具有很大潜力的微藻，有较好的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.小球藻(Chlorella sp.)34-2，其保藏编号为CGMCC NO.9225。

2.含有权利要求1所述的小球藻34-2的菌剂。

3.权利要求1所述的小球藻34-2或权利要求2所述的菌剂在制备生物油脂中的应用。

4.权利要求1所述的小球藻34-2或权利要求2所述的菌剂在提高生物油脂产量中的应用。

5.权利要求1所述的小球藻34-2或权利要求2所述的菌剂在养殖场废水清洁中的应用。

6.权利要求1所述的小球藻34-2或权利要求2所述的菌剂在减少养殖场废水污染中的应用。

7.权利要求1所述的小球藻34-2或权利要求2所述的菌剂在降低养殖场废水中氮磷含量的应用。

8.一种生产生物油脂的方法，其特征在于，将权利要求1所述的小球藻34-2接种于养殖场污水中培养。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，培养条件为通气培养，自然光照，温度20-40℃。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，培养环境的pH值为3-11。