CN114736836B - 从酸笋发酵液中筛选到的乳酸菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两株从酸笋发酵液中筛选到的乳酸菌,分别为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)HZAU‑R1和乳酸片球菌(Pediacoccus acidiactici)HZAU‑R9,均保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号分别为CCTCC NO:M 2022659和CCTCC NO:M 2022660。这两株乳酸菌中的一株具有很强的产酸能力、另一株对亚硝酸盐有很强的降解能力,将二者协同发酵,能提高酸笋质量并缩短酸笋发酵周期。
Description
技术领域
本发明属于微生物和食品加工领域,具体涉及从酸笋发酵液中筛选到的两株乳酸菌及其在人工接种发酵制备酸笋中的应用。
背景技术
酸笋(Sour bamboo shoot)是一种中国传统的发酵蔬菜食品,由新鲜竹笋经自然发酵制成,因其良好的贮藏性和发酵后形成的独特风味,深受消费者喜爱。酸笋中的乳酸菌不仅具有益生菌功能,还能产生丰富的挥发性风味物质、有机酸等,赋予酸笋独特风味。随着螺蛳粉风靡全球,作为螺蛳粉重要辅料的酸笋,其市场份额也在逐渐扩大。然而,通过调查发现,现阶段酸笋仍主要在家庭式的小作坊中生产,自然发酵的酸笋发酵周期长、容易受杂菌污染、而且不同厂家螺蛳粉风味差别大,品质难以保证。
相对而言,人工接种发酵更符合现代化生产加工,它具有发酵周期短、安全性高、质量均一等优点,是工业化生产酸笋的大趋势。然而菌株的筛选是制约人工接种发酵的关键因素,优良的酸笋发酵菌株不仅要具有很强的产酸能力和发酵能力,同时还要具有很强的生物相容性和安全性,不能产生过多的亚硝酸盐和对人体产生安全危害。因此,探索酸笋的优良菌株有助于酸笋的规模化、标准化生产,对提升酸笋质量具有重要的意义。
Nitin等从酸笋中分离鉴定出明串珠菌(Leuconostoc sp)、植物乳杆菌(L.plantarum)、木糖乳杆菌(L.xyiosus)、短乳杆菌(L.brevis)、弯曲乳杆菌(L.curvatus) 和发酵乳杆菌(L.fermentum)等11株乳酸菌菌种,其中短乳杆菌对植酸的降解能力强,可以将植酸分解为肌醇和磷脂;木糖乳杆菌具有很高的蛋白酶活力和脂解活性。熊建文等从柳州传统酸笋中分离得到48株乳酸菌,其中植物乳杆菌LZ-2-12胆固醇降解率高达54.27%(熊建文等2021)。秦雅莉等从柳州酸笋发酵液中分离筛选得到1株具有良好抗炎活性的发酵乳杆菌SS-31,能显著下调炎症因子IL-1β、IL-6的含量(秦雅莉等2021)。还有学者发现从发酵竹笋中分离出的乳酸杆菌具有较高的核黄素生产特性,以及益生菌显著的功能特性,可进一步探索开发功能性竹笋食品。可以通过将分离出来的优良乳酸菌作为起始物引入富含核黄素的产品,以期预防或治疗仍有待解决的核黄素缺乏症(Thakur et al 2017)。
本发明以自然发酵酸笋为原材料,从中筛选出产酸能力强、亚硝酸盐降解率高的乳酸菌,并对其进行分子生物学鉴定,然后对其发酵特性和安全性进行了评估。
发明内容
本发明的目的是提供两株从酸笋发酵液中筛选到的乳酸菌,这两株乳酸菌中的一株具有很强的产酸能力、另一株对亚硝酸盐有很强的降解能力,将二者协同发酵,能提高酸笋质量并缩短酸笋发酵周期。
一株从酸笋发酵液中筛选到的乳酸菌,命名为植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)HZAU-R1,于2022年5月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学),保藏编号为CCTCC NO:M 2022659。该菌株是从酸笋发酵液中筛选分离,具有很强的产酸率,产酸率高达2.3%。
一株从酸笋发酵液中筛选到的乳酸菌,命名为乳酸片球菌(Pediacoccusacidiactici) HZAU-R9,于2022年5月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学),保藏编号为CCTCC NO:M 2022660。该菌株是从酸笋发酵液中筛选分离,具有很强的亚硝酸盐降解能力,亚硝酸盐降解率高达99.9%。
以上两株乳酸菌应用于人工接种发酵制备酸笋,R1菌株主要用于产酸,R9菌株主要用于降解亚硝酸盐,二者协同作用后能发酵制备出质量高、安全性好的酸笋产品,并大幅缩短酸笋的发酵周期。
本发明进一步提供一种人工接种发酵制备酸笋的方法,该方法包括向新鲜竹笋中接种乳酸菌培养菌液并进行发酵的步骤,所述菌液中含有以上两种植物乳杆菌。
优选地,所述菌液的培养时间是12-24小时,浓度为106-108CFU/mL。
优选地,所述菌液的接种量为新鲜竹笋重量的1-5%。
优选地,所述发酵的温度是35-40℃,发酵时间是5-10天。
本发明的有益效果是:
(1)本发明从酸笋发酵液中同时筛选得到两株乳酸菌,其中一株产酸快,产酸量高,另一株能高效降解亚硝酸盐,经比较,这两株乳酸菌的产酸率或亚硝酸盐降解率均明显高于已知的同属菌株。
(2)本发明以植物乳杆菌和乳酸片球菌为菌种发酵酸笋,经检索,目前尚未发现以这两种菌对酸笋进行人工接种发酵的报导。本发明制作的酸笋不仅风味物质含量高,而且发酵周期短,酸笋质量稳定,易于实现工业化生产。
(3)本发明所使用的菌种本身来源于酸笋发酵液,最终又应用于酸笋的发酵,因此具有很高的安全性,试验表明,菌株不会产生溶血性。
附图说明
图1:酸笋发酵液中部分菌落在平板上的菌落形态。左为编号R8;右为编号R9。
图2:酸笋发酵液中部分菌落的光学显微镜镜检结果(100X)。左为编号R2;右为编号R9。
图3:酸笋发酵液中部分菌株的16S rDNA PCR凝胶电泳结果。
图4:酸笋发酵液中各株乳酸菌的产酸率比较。
图5:亚硝酸盐含量测定的标准曲线。
图6:酸笋发酵液中编号R10菌株的溶血圈。
图7:酸笋发酵液中菌株R1和R9的生长曲线。
具体实施方式
实施例1酸笋人工接种发酵菌的筛选
1.实验方法
1.1乳酸菌的分离纯化及初步鉴定
取自然发酵酸笋发酵液,用0.9%的生理盐水梯度稀释,选取适当稀释梯度的菌液涂布在MRS琼脂培养基上37℃培养48h,进行乳酸菌的初筛。挑选单菌落,通过平板划线分离纯化直至平板上出现菌落形态一致的单菌落。观察培养基上菌落形态,以及革兰氏染色初步筛选乳酸菌,对它们进行编号并用40%甘油(无菌)保存至-80℃冰箱中,以供后续使用。
1.2优良乳酸菌株的筛选
1.2.1高产酸乳酸菌的筛选
将分离纯化的菌株接种于MRS液体培养基中,37℃厌氧培养24h后用0.1%氢氧化钠滴定。滴定时,取2mL发酵液于100mL锥形瓶中,加入50mL蒸馏水,3-5滴 0.5%酚酞溶液,用0.1mol/L NaOH溶液滴至浅粉红色,由耗用的NaOH溶液体积计算样品含酸量。每个处理均以3个平行样的平均结果计算。
式中:
C—NaOH的浓度,mol/L;
V—所消耗的NaOH溶液的体积,mL;
V0—样品的体积,mL;
0.09—总酸转换乳酸系数。
以产酸率高于1.5%为基准筛选优良乳酸菌。
1.2.2降亚硝酸盐乳酸菌的筛选
本实验按照国标GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量。
亚硝酸盐标准曲线的制备:吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、 3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠),分别置于50mL容量瓶中。分别加入2mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液,混匀,黑暗中静置5min后加入1mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混匀,黑暗中静置15min,用1cm比色杯,以零管调节零点,于波长538nm处测吸光度,绘制标准曲线。
将保存在甘油中的乳酸菌用MRS平板划线,挑取单菌落液体培养24h后,按2%的接种量用MRS液体活化一次,将活化好的乳酸菌按2%的接种量接入含100mg/L亚硝酸盐的MRS液体培养基中培养24h后测定亚硝酸盐含量。
样品处理:吸取5mL发酵液,置于250mL具塞锥形瓶中,加12.5mL 50g/L饱和硼砂溶液,加入约40mL水混匀后于沸水浴中加热30min,放置室温冷却,加入5mL 106 g/L亚铁氰化钾溶液摇匀,再加入5mL 220g/L乙酸锌溶液以沉淀蛋白质。转移提取液至200mL容量瓶中,加水至刻度后摇匀,真空泵抽滤,弃去初滤液30mL,剩下滤液储存备用。
样品亚硝酸盐含量测定:吸取发酵液2mL,分别置于50mL容量瓶中。分别加入2 mL4g/L对氨基苯磺酸溶液,混匀,黑暗中静置5min后加入1mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液,加水至刻度后混匀,黑暗中静置15min,用1cm比色杯,于波长538nm处测吸光度,同时做试剂空白。每个样品三次重复。
亚硝酸盐降解率按下列公式计算:
式中:
X1—试样中亚硝酸钠的含量,单位为毫克每千克(mg/kg);
m1—测定样液中亚硝酸钠的质量,单位为微克(μg);
1000—转换系数;
m2—试样质量,单位为克(g);
V1—测定用样液体积,单位为毫升(mL);
V0—试样处理液总体积,单位为毫升(mL)。
1.3乳酸菌分子生物学鉴定
1.3.1菌株基因组的提取
取细菌培养液1mL,10000r/min离心1min,倒弃培养液。加入180μl Lysozyme,振荡使菌体重悬,37℃水浴60min。加入20μl Proteinase K,振荡混匀;加入250μl Buffer GB,振荡混匀,70℃水浴15min。加入180μl无水乙醇,振荡混匀,短暂离心以收集管盖内壁上的液体。将上述混合液转移至FastPure gDNA Mini Columns I吸附柱(吸附柱已放入收集管内)中,12000r/min离心1min,弃滤液。加入500μl Bufr PB(含无水乙醇)至吸附柱中,12000r/min离心1min,弃滤液。加入600μl Buffer PW(含无水乙醇) 至吸附柱中,12000r/min离心1min,弃滤液。再加入600μl Buffer PW(含无水乙醇) 至吸附柱中,12000r/min离心1min,弃滤液。将吸附柱放回收集管中,12000r/min空管离心2min。空柱离心后,可开盖放置2-5min,使残留的乙醇彻底挥发。将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中,向吸附柱膜中央部位悬空滴加50-100μl Elution Buffer (55℃),室温放置2-5min,12000r/min,离心1min。弃吸附柱,DNA产物保存于-20℃,以防止降解。
1.3.2 16SrDNA扩增
PCR扩增的引物分别为27F/1492R。27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
表1 PCR扩增体系中各组分添加量
PCR反应条件为:94℃预变性4min;94℃变性30sec,50℃退火30sec,72℃延伸90sec,循环32次;72℃延伸10min。
1.3.3琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
50×TAE Buffer的配置:称量Tris 121g,Na2EDTA·2H2O 18.6g于1L烧杯中,加约400mL去离子水,充分搅拌至全部溶解,加入28.5mL冰醋酸,最后加去离子水定容至500mL。
在锥形瓶中加入0.35g琼脂糖和35mL 1×TAE(50×TAE Buffer稀释50倍),煮沸并摇晃3次,加入Golden View染液1.5μL,摇晃均匀。将琼脂糖倒入灌胶盒中,插入梳子,待其冷却凝固后取出(大约30min),放到电泳槽中,将Marker和PCR产物分别点样于凝胶梳孔中,电压120V,电流200mA,跑胶30min。
1.3.4 16S rDNA测序
将16S rDNA的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司完成测序。
1.3.5同源性比较
进入NCBI网站,将测序结果与BLAST中的序列进行比对。
1.4乳酸菌生长曲线的测定
将菌株接种至MRS肉汤培养基中活化2次,以2%(v/v)的接种量接种于MRS肉汤中,于37℃培养,使用bioscreen生长曲线分析仪每1h测定OD600nm吸光度,并绘制乳酸菌生长曲线。
2.结果与分析
2.1乳酸菌分离纯化及初步鉴定
从MRS平板上挑选出疑似乳酸菌菌株共30株,并对其进行编号,分离纯化后,观察菌落在平板上的菌落形态,部分菌落形态如图1所示,R8菌株偏透明乳白色,菌落不是光滑圆形,边缘呈花朵状,直径在0.5-1.5mm;R9菌株呈现乳白色,扁平状,直径0.5-3.0mm。然后经过革兰氏染色观察菌体形态,部分镜检结果如图2所示,R2呈短杆状,单个、成对或链状存在;R9呈球状,单个或成对存在。
2.2菌株的鉴定
将菌株按照试剂盒提取DNA,进行16S rDNA基因序列PCR扩增,凝胶电泳结果如图3所示。由图3可知,大约在1500bp处出现荧光条带,由此可知,PCR扩增出来的DNA片段大约为1500bp。
通过BLAST对序列进行比对,结果显示其中26株菌被鉴定为乳酸菌,分别属于乳杆菌属(Lactobacilli)和乳球菌属(Lactococcus),共有4个种,分别为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、列维短乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、乳酸片球菌 (Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。比对结果和同源性分析如表2所示。
表2酸笋中可培养菌株分离鉴定结果
2.3产酸能力强乳酸菌的筛选
产酸率是筛选优良乳酸菌的关键指标,由图4可知,R1、R6、R14产酸率较高,均在2.3%左右,其中R1产酸率最高,可以用于后续发酵。
2.4降亚硝酸盐乳酸菌的筛选
2.4.1亚硝酸盐标准曲线的制作
标准曲线如图5所示,横坐标为亚硝酸盐含量(μg),纵坐标为538nm的吸光度,回归方程为y=0.0157x+0.0003,相关系数为R2=0.9985,拟合度较高,可以用于后续亚硝酸盐含量的测定。
2.4.2降亚硝酸盐乳酸菌的筛选
将发酵液经过盐酸萘乙二胺等处理后测出的吸光度带入图5标准曲线中,可算得出发酵液中亚硝酸盐的含量,再按照1.2.2中的公式算出试样中亚硝酸盐含量,通过原始MRS液体培养基中亚硝酸盐含量为100mg/L,可计算出乳酸菌培养24h的降解率。结果由表3可知,筛选出来的所有乳酸菌菌株亚硝酸盐降解率均在97%以上,亚硝酸盐基本降解完全,其中R9降解率最高,达到了99.9%,因此选择菌株R9进行后续纯种发酵。
表3不同菌株在24小时内亚硝酸盐降解率
2.5乳酸菌安全性评估
为了评估乳酸菌的安全性,需要对其进行溶血性实验,若产生溶血圈,则说明会对人体造成一定危害。将筛选出的乳酸菌经过MRS液体培养基活化2次后在血平板上“Z”字型划线,48h后观察是否出现溶血圈。结果如图6所示,只有R10(P.pentosaceus) 有轻微草绿色溶血圈(α溶血),其他菌株均不溶血(γ溶血),因此可以进行后续的发酵实验。
2.6乳酸菌的生长曲线
将筛选出来的2株乳酸菌菌株R1(L.plantarum)和R9(P.pentosaceus),按2%的接种量接入MRS肉汤中,37℃培养,每隔1h测量其OD值,结果见图7。根据菌株的生长趋势,选择合适生长时期的菌株进行发酵,R1在1h-12h处于对数生长期,R9 在1h-24h处于对数生长期,由此,在培养12h的时候添加菌液进行发酵比较合适。
3.讨论
本章以自然发酵酸笋为原材料,从中筛选出产酸能力强、亚硝酸盐降解率高的乳酸菌,并对其进行分子生物学鉴定,然后对其发酵特性和安全性进行了初步探索。
在蔬菜发酵的过程中,常出现亚硝酸盐超标的情况,因此本实验以亚硝酸盐降解率作为重要指标筛选乳酸菌菌株,同时筛选出产酸快,产酸量高的乳酸菌协同发酵。本研究中共筛选出26株乳酸菌,经过产酸和降亚硝酸盐实验筛选得到R1菌株产酸能力最强,产酸率高达2.3%;R9亚硝酸盐降解率高达99.9%,因此选择这两株菌进行后续发酵。经过革兰氏染色镜检和16S rDNA鉴定,菌株R1属于植物乳杆菌,R9属于乳酸片球菌。
许多学者都从泡菜中分离出高产酸乳酸菌,赵山山等从贵州采集的自制发酵蔬菜制品中筛选出两株产酸量最高的菌株A50f7、A50b9,产酸量分别为3.83g/L和2.97g/L (赵山山等2020)。将这两株乳酸菌接种发酵泡菜,可以明显缩短发酵所需的时间,改善泡菜的品质。龚加路等以四川川南地区收集的的农家泡菜为原料,分离筛选得到一株高产酸的乳酸菌,测定其产酸率高达1.54%(龚加路等2016)。吴锦兰等以柳州传统发酵酸笋为原料,分离并筛选得到一株高产乳酸的乳酸菌菌株LB-1-23,测得其在合适的发酵条件下乳酸产量为12.74g/L(吴锦兰等2021)。而本实验中分离出的植物乳杆菌 R1产算量高达19.35g/L,证明产酸能力十分优异。
亚硝酸盐广泛存在于肉类制品以及发酵蔬菜中,亚硝酸盐会对人体造成严重的危害,例如引起急性中毒以及致癌、致畸(陈伊凡等2020)。因此,在蔬菜腌制的过程中,亚硝酸盐的产生会影响到食品安全和人体健康,目前国内外学者已经筛选出多株降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌。陈正培从柳州酸笋中筛选得到一株降解能力较强的植物乳杆菌 LC-3-3,亚硝酸盐的降解率为76.58%(陈正培等2020)。忻晓庭等从我国特色发酵蔬菜中分离纯化出植物乳杆菌JLSC2-6,结果表明在发酵10h时,其亚硝酸盐降解率已达到 87.52%,发酵30h后,其降解率高达99.06%(忻晓庭等2021)。从四川泡菜中分离得到菌株AR123,并通过16SrDNA序列鉴定为短乳杆菌,在MRS肉汤中测试其亚硝酸盐降解率最高,达到99.85%(Xia etal 2017)。而本实验中分离出来的乳酸片球菌R9亚硝酸盐降解率最高,达到99.9%,几乎可以将亚硝酸盐完全降解。
溶血活性的缺失确保了菌株的非毒力性质,这可以被视为潜在益生菌菌株的选择标准之一,而R1和R9均未产生溶血圈,因此可以用于后续的发酵。乳酸菌在对数生长期,增长速率最快。因此选择对数生长期的乳酸菌进行发酵最为合适。通过测定生长曲线, R1在1h-12h处于对数生长期,R9在1h-24h处于对数生长期,因此,可以在乳酸菌培养12h的时候添加菌液进行发酵。
实施例2筛选的乳酸菌在人工接种制备酸笋中的应用
人工接种发酵制备酸笋:
(1)将R1和R9菌株接种于MRS液体培养基,于37℃培养箱中培养12h,离心后用无菌水配制成浓度为107CFU/mL的菌液。
(2)将菌液按照3%(重量)接种量接入新鲜竹笋发酵罐中,37℃条件下进行人工接种发酵,发酵时间7天。
将乳酸菌接种发酵7天制备的酸笋与厌氧条件下自然发酵30天制备的酸笋进行比较,检测自然发酵与接种发酵的风味物质,结果如下:
乳酸菌接种发酵酸笋中共检测出51种挥发性物质,具体含量与自然发酵对比如下表4所示。
表4两种发酵方式酸笋中主要挥发性物质含量对比
由表4可知,与自然发酵相比,接种发酵中酯类、醛类和酮类物质含量明显增加,其中水杨酸甲酯含量较高(12.331%),具有特有的冬青叶香味;醛类中反式-2-庚醛含量较多(0.875%),有脂芳香。烷烃类、烯烃类物质含量稍有增加,而醚类和酚类物质明显降低,二甲醚含量从6.234%降至3.552%,苯酚含量也从16.511%降至0.908%,对甲酚含量略微增加,酸类物质略有降低,醇类物质含量几乎没有什么区别,总体来说,相比自然发酵,接种发酵制作的酸笋中风味物质更加丰富。
自然发酵30d与自然发酵45d的酸笋在风味物质含量上并无太多差异,可初步判断自然发酵酸笋30d已发酵成熟,接种发酵酸笋在7d和9d、12d风味并无太大差别,可初步判断接种发酵周期在7d左右。
Claims (4)
1.一种人工接种发酵制备酸笋的方法,其特征在于:包括向新鲜竹笋中接种乳酸菌培养菌液并进行发酵的步骤,所述菌液中含有植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)HZAU-R1和乳酸片球菌(Pediacoccus acidiactici)HZAU-R9,分别保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2022659和CCTCC NO:M 2022660。
2.如权利要求1所述人工接种发酵制备酸笋的方法,其特征在于:所述菌液的培养时间是12-24小时,浓度为106-108CFU/mL。
3.如权利要求1所述人工接种发酵制备酸笋的方法,其特征在于:所述菌液的接种量为新鲜竹笋重量的1-5%。
4.如权利要求1所述人工接种发酵制备酸笋的方法,其特征在于:所述发酵的温度是35-40℃,发酵时间是5-10天。
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