CN116694506A - 一种植物乳杆菌hyy-db36及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌HYY‑DB36，所述植物乳杆菌HYY‑DB36的菌种保藏编号为CGMCC NO.62814，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY‑DB36，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年9月21日。从东北泡菜中筛选得到的植物乳杆菌HYY‑DB36具有优异的耐酸耐胆盐能力、产酸能力、调节肠道菌群平衡和降解亚硝酸盐能力，将其进行培育并应用于调节土壤亚硝酸盐含量，能显著降低和降解亚硝酸盐成分，同时具有显著的抑菌效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物筛选及应用领域，具体而言，涉及植物乳杆菌HYY-DB36及其应用。
背景技术
硝酸盐作为土壤中的氮肥会被土壤中的硝酸还原酶还原成亚硝酸盐，植物会吸收累积土壤中的亚硝酸盐，且有些植物作为食物被人体食用后,食物中亚硝酸盐过高也会影响人体健康。因此，土壤中的亚硝酸盐对人体存在直接和潜在的危害，然而我国长期以来缺乏有效的措施去降低土壤中亚硝酸盐含量。一种安全、有效的方法来降低土壤中亚硝酸盐的含量和改善土壤环境迫在眉睫。
另外，随着人民生活水平的提高和生活方式的改变，硝酸盐在食物中过量存在的问题也越来越被重视。如：中国专利CN102586155A公开了一种植物乳杆菌N13，保藏编号为CGMCC NO 5495，对致病菌肠侵袭性大肠杆菌具有抑制作用，能够用于制备酸豆乳、发酵乳制品、发酵蔬菜和发酵青饲料等。中国专利CN103169075A公开了一种植物乳杆菌ST-III在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂或制备具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的发酵豆类制品中的用途，具有降低糖尿病人的餐后高血糖，调节餐后血糖波动的作用。因此，现有技术的植物乳杆菌做到同时降低亚硝酸盐以及提高产品风味的效果的技术方案较少甚至无。况且，目前从食品方向降低亚硝酸盐含量为主要技术手段，从土壤出发降低亚硝酸盐含量的方法甚少。
发明内容
基于此，为了解决现有植物乳杆菌在降解土壤中亚硝酸盐方面的不足，本发明提供了一株通过在东北泡菜中分离、纯化、培养等实验操作筛选出的具有良好安全性和益生性的植物乳杆菌HYY-DB36并将其应用于降低土壤中亚硝酸盐的含量，具体技术方案如下：
一种植物乳杆菌HYY-DB36，所述植物乳杆菌HYY-DB36的菌种保藏编号为CGMCCNO.62814，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-DB36，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年9月21日。
在本申请中，一种植物乳杆菌HYY-DB36的筛选培养方法，所述培养筛选方法包括以下步骤：
收集东北泡菜的发酵液；
从所述发酵液中筛选出植物乳杆菌，经过鉴定，得到植物乳杆菌HYY-DB36。
在本申请中，一种植物乳杆菌HYY-DB36的应用，所述应用为植物乳杆菌HYY-DB36应用于降解亚硝酸盐。
进一步地，所述应用为植物乳杆菌HYY-DB36应用于调节土壤亚硝酸盐含量。
进一步地，所述应用在降解亚硝酸盐的产品制备中。
进一步地，所述产品为含有植物乳杆菌HYY-DB36的乳酸菌复合制剂或含有植物乳杆菌HYY-DB36冻干粉的复合制剂。
进一步地，所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：
将植物乳杆菌HYY-DB36活化后，离心处理，得到菌泥；
将灭菌的脱脂乳粉添加至菌泥中，重悬搅拌均匀并于-20℃条件下进行预冻处理后，置于冻干机中进行冷冻干燥24～48h，得到冻干粉。
上述方案中从东北泡菜中筛选得到的植物乳杆菌，能通过酶解、酸降解及抑制硝酸还原菌与腐败菌生长等机制降低发酵土壤中亚硝酸盐的含量，具有优异的耐酸耐胆盐能力、产酸能力、调节肠道菌群平衡和降解亚硝酸盐能力，将其进行培育应用，能显著降低和降解亚硝酸盐成分，且还具有显著的抑菌效果。另外，经过培育的植物乳杆菌HYY-DB36可以缩短发酵蔬菜的成熟期，提高发酵效率和发酵产品的安全性，并且能够进一步帮助改善发酵蔬菜的品质以及口感。
附图说明
图1是本发明实施例1中的植物乳杆菌HYY-DB36的革兰氏形态示意图；
图2是植物乳杆菌HYY-DB36的菌株122h内的亚硝酸盐降解曲线示意图；
图3为植物乳杆菌HYY-DB36具有高亚硝酸盐降解率能力强的生物学特性示意图；
图4为植物乳杆菌HYY-DB36对红霉素、卡那霉素、诺氟沙星、链霉素的敏感性示意图；
图5为植物乳杆菌HYY-DB36菌株耐酸耐胆盐能力示意图；
图6为植物乳杆菌HYY-DB36菌株耐酸耐胆盐能力示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例中的一种植物乳杆菌HYY-DB36，所述植物乳杆菌HYY-DB36的菌种保藏编号为CGMCC NO.62814，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-DB36，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年9月21日。
在其中一个实施例中，一种植物乳杆菌HYY-DB36的筛选培养方法，所述培养筛选方法包括以下步骤：
收集东北泡菜的发酵液；
从所述发酵液中筛选出植物乳杆菌，然后经过鉴定，得到植物乳杆菌HYY-DB36。
在其中一个实施例中，所述培养的温度为35℃～37℃，pH为5.4，密封培养。
在其中一个实施例中，一种植物乳杆菌HYY-DB36的应用，所述应用为植物乳杆菌HYY-DB36应用于降解亚硝酸盐。
在其中一个实施例中，所述应用为植物乳杆菌HYY-DB36应用于调节土壤亚硝酸盐含量。
在其中一个实施例中，所述应用在降解亚硝酸盐的产品制备中。
在其中一个实施例中，所述产品为含有植物乳杆菌HYY-DB36的乳酸菌复合制剂或含有植物乳杆菌HYY-DB36冻干粉的复合制剂。
在其中一个实施例中，所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：
将植物乳杆菌HYY-DB36活化后，离心处理，得到菌泥；
将灭菌的脱脂乳粉添加至菌泥中，重悬搅拌均匀并于-20℃条件下进行预冻处理后，置于冻干机中进行冷冻干燥24～48h得到冻干粉。
更具体地，将保存在-80℃甘油管冻存的植物乳杆菌于MRS固体平板培养基划线接种，于37℃厌氧培养24h复苏，经两次传代活化后转接于MRS液体培养基，取培养了18h的过夜菌液，在4℃条件下以8000r/min转速离心15min后倒去上清液收集离心管底部菌泥，用浓度为0.90％的灭菌生理盐水洗涤一次后以相同条件重悬1min，以质量比为1:3的比例加入灭好菌的脱脂乳粉重悬混匀，预冻后放入冻干机冷冻干燥29h制作冻干粉,使用冻干粉方式对菌株进行保存。
在其中一个实施例中，所述MRS液体培养基的配制为：准确称取10g蛋白胨、5g酵母提取物、20g无水葡萄糖、10g牛肉膏、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸氢二铵、5g乙酸钠、0.2g七水硫酸镁、0.05g硫酸锰以及1mL吐温-80，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。
在其中一个实施例中，MRS固体平板培养基的配制为：准确称取10g蛋白胨、5g酵母提取物、20g无水葡萄糖、10g牛肉膏、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸氢二铵、5g乙酸钠、0.2g七水硫酸镁、0.05g硫酸锰以及1mL吐温-80混合后，得到混合物，然后加入占所述混合物质量比1.5％～2％的琼脂，用超纯水溶解并定容至1L，121℃灭菌15min。
上述方案中从东北泡菜中筛选得到的植物乳杆菌，有优异的耐酸耐胆盐能力、产酸能力、调节肠道菌群平衡和降解亚硝酸盐能力，将其进行培育应用，能显著降低和降解亚硝酸盐成分，且还具有显著的抑菌效果。另外，经过培育的植物乳杆菌HYY-DB36可以缩短发酵蔬菜的成熟期，提高发酵效率和发酵产品的安全性，并且能够进一步帮助改善发酵蔬菜的品质以及口感。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1：
收集东北泡菜的发酵液；
从所述发酵液中提取植物乳杆菌，然后培养，得到植物乳杆菌HYY-DB36。
将从发酵液中提取的植物乳杆菌中筛选出几株有溶钙圈的菌株，首先通过革兰氏染色法检测出结果为革兰氏阳性菌，同时结合过氧化氢酶实验结果为过氧化氢酶阴性的菌株可初步鉴定其为乳酸菌。再经过明胶液化试验、H2S产生试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、VP试验(乙酰甲基甲醇试验)、淀粉水解试验、糖类发酵试验、16SrDNA鉴定等一系列的理化性质进一步确定了菌株为乳酸菌；对上一步分离出的乳酸菌进行耐酸性试验、耐胆盐试验、溶血试验、药敏试验和抑菌试验等益生性实验和安全性实验测定后继续进行产酸特性实验、降解亚硝酸盐能力实验，分离筛选出高产酸、高亚硝酸盐降解能力强的乳酸菌菌株。
所述菌株已进行16SrDNA测定，确定为Lactiplantibacillus plantarum(植物乳杆菌)，并保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年9月21日，菌种保藏编号为CGMCC NO.62814，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-DB36。植物乳杆菌HYY-DB36的革兰氏形态图如图1所示，先通过革兰氏染色法检测出结果为革兰氏阳性菌同时过氧化氢酶实验结果为过氧化氢酶阴性的菌株初步鉴定其为乳酸菌。
实施例2：
植物乳杆菌HYY-DB36的菌株122h内的亚硝酸盐降解曲线，如图2所示，从图2分析可知，本申请植物乳杆菌HYY-DB36产酸随着时间降低而降低。
实施例3：
所述植物乳杆菌HYY-DB36具有高亚硝酸盐降解率能力强的生物学特性，如图3所示。
实施例4：
植物乳杆菌HYY-DB36具有明胶液化试验阴性、H2S产生试验阴性、吲哚试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、VP试验(乙酰甲基甲醇试验)阴性、淀粉水解试验阴性和糖类发酵试验阳性的理化性质。如下表1所示。
表1植物乳杆菌HYY-DB36理化性质鉴定
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
实施例5：
植物乳杆菌HYY-DB36的抗生素敏感性采用滤纸片扩散法分析，结果如表2所示。
表2植物乳杆菌HYY-DB36的抗生素敏感性
注：“S”表示敏感；“M”表示中度敏感；“R”表示耐药；其中阿莫西林(AMX)、庆大霉素(GEN)、万古霉素(VAN)、红霉素(E)、链霉素(S)、诺氟沙星(NOR)、卡那霉素(KAN)、氯霉素(C)、氨苄西林(AMP)。
植物乳杆菌HYY-DB36对红霉素、卡那霉素、诺氟沙星、链霉素的敏感性如图4所示。所述抑菌能力即在涂布致病菌后的营养琼脂培养基上用无菌挑菌针挑出和牛津杯相同大小的培养基孔洞，在孔洞中加入植物乳杆菌HYY-DB36菌液,在37℃条件下在培养箱中培养24h,利用ImageJ测量抑菌圈直径。如图5所示植物乳杆菌HYY-DB36菌株耐酸耐胆盐能力优异。图6为植物乳杆菌HYY-DB36菌株耐酸耐胆盐能力，综合以上分析，本申请的植物乳杆菌HYY-DB36优异抑菌能力。
实施例6：
植物乳杆菌HYY-DB36具有耐酸耐胆盐的益生性特性，结果如表3所示。
表3植物乳杆菌HYY-DB36菌株耐酸耐胆盐能力
注：“+++”表示生长状况良好；“++”表示生长状况一般；“+”表示生长状况较弱；“-”表示不生长。
从表3的数据分析可知，植物乳杆菌HYY-DB36菌株耐酸耐胆盐能力优异。
实施例7：
1.乳酸菌菌液活化：
取筛选后并甘油管藏的植物乳杆菌HYY-DB36于MRS固体平板划线接种，活化37℃厌氧培养24h，二次活化后接种于MRS液体培养基，后稀释涂布计数，调整菌液浓度至1×1011CFU/mL。
2.将菌液制成冻干粉：
将菌悬液在4℃条件下以8000r/min离心15分钟后倒去上清液，收集离心管底部菌泥，用浓度为0.90％的灭菌生理盐水洗涤一次后以相同条件重悬1min，以质量比1：3的比例加入灭好菌的脱脂乳粉重悬混匀，于-20℃下预冻4h后，放入冻干机29h制作冻干粉,以冻干粉的形式保存菌株。
3.计算冻干粉内活菌数：
精确称取一定重量的冻干粉，在无菌条件下将冻干粉溶于10ml无菌水中，用稀释涂布平板法稀释105～109，37℃厌氧条件培养24h，待平板中菌落长出，记录平板内菌落数并计算每克冻干粉内活菌数量。
4.施于土壤
使用时根据土壤面积大小，使用蒸馏水或自来水稀释至一定浓度，施加菌剂满足1×108CFU/g土壤。
然后在不同时间段对土壤中的亚硝酸盐含量进行检测，结果如下表4所示。
表4土壤中亚硝酸盐含量/(mg/kg)
实验室测试植物乳杆菌HYY-DB36对土壤中亚硝酸盐的降解效果如表4所示，经植物乳杆菌HYY-DB36处理后，土壤中的亚硝酸盐含量明显降低，且效果显著。
以上所述实施的各技术特征可以进行任意组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种植物乳杆菌HYY-DB36，其特征在于，所述植物乳杆菌HYY-DB36的菌种保藏编号为CGMCC NO.62814，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum HYY-DB36，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年9月21日。
2.一种植物乳杆菌HYY-DB36的筛选培养方法，其特征在于，所述培养筛选方法包括以下步骤：
收集东北泡菜的发酵液；
从所述发酵液中筛选植物乳杆菌，经过鉴定，得到植物乳杆菌HYY-DB36。
3.一种植物乳杆菌HYY-DB36的应用，其特征在于，如权利要求2所述的植物乳杆菌HYY-DB36，所述应用为植物乳杆菌HYY-DB36应用于降解亚硝酸盐。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为植物乳杆菌HYY-DB36应用于调节土壤亚硝酸盐含量。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用在降解亚硝酸盐的产品制备中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为含有植物乳杆菌HYY-DB36的乳酸菌复合制剂或含有植物乳杆菌HYY-DB36冻干粉的复合制剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述冻干粉的制备方法包括以下步骤：
将植物乳杆菌HYY-DB36活化后，离心处理，得到菌泥；
将灭菌的脱脂乳粉添加至菌泥中，重悬搅拌均匀并于-20℃条件下进行预冻处理后，置于冻干机中进行冷冻干燥24～48h，得到冻干粉。
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| 胡此海: "萝卜泡菜母水中乳酸菌分离鉴定与发酵特性比较", 食品与发酵工业, vol. 49, no. 23, 8 May 2023 (2023-05-08), pages 111 - 119 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116694506B (zh) | 2024-09-10 |
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