CN113817614A - 一种高效合成c21甾体苷的胶孢炭疽菌z-44及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效合成C₂₁甾体苷的胶孢炭疽菌Z‑44及其应用。本发明胶孢炭疽菌Z‑44(Colletotrichumgloeosporioide)于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：(CCTCCNO：M20211164)，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。该胶孢炭疽菌Z‑44经发酵优化后，发酵液中C₂₁甾体苷最终含量为0.60±0.05mg/mL，显著高于其他菌(P＜0.05)，其合成的C₂₁甾体苷主要为隔山消苷C₃N。本发明通过胶孢炭疽菌Z‑44发酵培养后制备C₂₁甾体苷，与植物提取法相比，生产周期短、成本低廉、产量较高、保护生态。

Description

一种高效合成C21甾体苷的胶孢炭疽菌Z-44及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高效合成C₂₁甾体苷的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)Z-44。

背景技术

C₂₁甾体苷广泛应用于各领域，其在抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、保护肝脏、降血脂、化疗药物增效减毒、抗抑郁等方面具有显著的生物活性。C₂₁甾体化合物主要存在萝藦、通关藤、白首乌、青阳参和黑蔓藤等植物中，白首乌作为萝藦科植物中的一种，其块根中存在最多的活性成分即为C₂₁甾类化合物。白首乌中C₂₁甾体苷是主要的抗癌活性成分之一，迄今为止，国内外对C₂₁甾体苷的获取途径主要为原植物中提取成分的分离、纯化。该方法存在植物来源有限、提取工艺复杂、纯化后的后续酶反应效率低、产量低等不足。

研究显示，中国传统药材中的内生菌具有合成、转化各种新颖的生物活性物质的潜力。已有学者从黄槿、内喜树、金粟兰属(Chloranthus swarts)等药用植物中筛出的内生菌可产生与宿主植物相同或相似的化学结构。C₂₁甾体苷的微生物代谢研究显示，环境中存在部分真菌和细菌能对培养体系中的C₂₁甾体苷前体物进行转化，本发明从富含C₂₁甾体苷的白首乌中筛选高产内生菌具有靶向性强的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效合成C₂₁甾体苷的胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide)Z-44及其应用，可为C₂₁甾体苷大规模高产制备提供新途径。

本发明是这样实现的，一种高效代谢C₂₁甾体苷的胶孢炭疽菌Z-44，该胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)Z-44于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211164，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。

本发明进一步公开了上述胶孢炭疽菌Z-44发酵制备C₂₁甾体苷的方法，该方法包括以下步骤：将胶孢炭疽菌Z-44按0.5％～2.0％接种量接种到液体培养基中，该液体培养基pH为6～8，150rpm摇床、28～37℃条件下发酵培养48～144h，得到含有C₂₁甾体苷的发酵液。

优选地，所述接种量为0.5％，发酵培养温度37℃，培养时间为144h。

优选地，所述液体培养基为马铃薯葡萄糖PDA液体培养基，该培养基的pH为8。

本发明进一步公开了上述胶孢炭疽菌Z-44在制备抗癌药物C₂₁甾类化合物中的应用。

优选地，所述抗癌药物C₂₁甾类化合物为隔山消苷C₃N。

本发明克服现有技术的不足，提供一种高效合成C₂₁甾体苷的胶孢炭疽菌Z-44(Colletotrichum gloeosporioide)及其应用。本发明利用选择性培养基从白首乌不同组织部位筛选出8株内生真菌，通过改良香草醛比色法测定各内生真菌发酵液中C₂₁甾体苷含量，据此判定具有C₂₁甾体苷合成能力的内生真菌6株。同时，浓缩并纯化高产菌株发酵液中C₂₁甾体苷，采用LC-MS法鉴定纯化产物类型。所筛选菌株命名为胶孢炭疽菌Z-44(Colletotrichum gloeosporioide)于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：(CCTCC NO：M 20211164)，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。

本发明发现，可代谢C₂₁甾体苷的白首乌内生真菌占比为75％，其中，胶孢炭疽菌Z-44发酵液中C₂₁甾体总苷浓度显著高于其他菌株(P＜0.05)，培养48h发酵液中含量达到0.5mg/mL。该指标为其他植物源或真菌的10～100倍，具有明显优势。且经发酵优化后，培养216h时，C₂₁甾体苷最终含量为0.60±0.05mg/mL，显著高于其他菌(P＜0.05)。

本发明综合C₂₁甾体苷代谢关键酶活性及关键酶基因检测、蛋白多样性分析，揭示胶孢炭疽菌Z-44中C₂₁甾体苷合成途径为：类戊二烯生物合成途径(MVA)，其合成的C₂₁甾体苷主要为隔山消苷C₃N(Geshanxiaoglycoside C₃N)。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用微生物发酵法制备C₂₁甾体苷，与植物提取法相比，生产周期短、成本低廉、产量较高、保护生态；

(2)本发明探究了胶孢炭疽菌Z-44中C₂₁甾体苷的代谢途径，为生产中进一步调控发酵过程提供依据。

附图说明

图1是胶孢炭疽菌Z-44的PDA平板划线结果；

图2是胶孢炭疽菌Z-44系统进化树；

图3是胶孢炭疽菌Z-44发酵液中C₂₁甾体苷总苷浓度；

图4是胶孢炭疽菌Z-44发酵液中C₂₁甾体苷总苷的LC-MS结果；

图5是胶孢炭疽菌Z-44胞内、外蛋白含量；

图6是胶孢炭疽菌Z-44蛋白多样性结果；

图7是胶孢炭疽菌鲨烯合酶基因序列同源性对比结果；

图8是胶孢炭疽菌Z-44中鲨烯合酶SQS基因检测结果；

图9是胶孢炭疽菌Z-44中HMGR酶活性检测结果；

图10是胶孢炭疽菌Z-44的发酵优化结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

一、白首乌内生真菌的筛选

1、样品前的处理

将从江苏省滨海县果老首乌种植基地带回的白首乌样本洗净，吸干表面水分，紫外灭菌10min。以无菌水冲洗3次，将表面的水分吸干，75％乙醇溶液浸泡根，茎，叶，种子5min，无菌水冲洗3次，3％次氯酸钠溶液浸泡3min，再以无菌水冲洗5次，保留最后—次冲洗液，待消毒检验用。

将根、茎、叶分别去皮切成小碎块，研钵中加入蒸馏水和少量石英砂研磨成匀浆，静置30min，取上清液1mL，稀释成10^-1、10^-2、10^-3等3个梯度。

2、菌株初筛

将组织稀释液涂布于PDA培养基上，30°℃培养，待平板上长出菌落，用平板划线方法反复分离纯化菌株，直至得到单一的纯菌落，编号并保存菌种(图1、图2)。

二、白首乌内生真菌理化性质鉴定

甲基红试验：配制葡萄糖蛋白胨水培养基培养基，分装至试管，每组2只试管，灭菌。待培养基冷却后，1支试管接菌，另一支试管作为空白对照。37℃培养1～2d。培养后，每支试管加入2滴甲基红试剂，培养基若呈红色为阳性，若呈黄色为阴性。目的：检验微生物分解葡萄糖产酸量。结果Z-44为阴性即该菌分解葡萄糖产酸量少或产生的酸进一步转化为其他物质又或是不能分解葡萄糖使培养基的酸度仍在pH6.2以上。

吲哚试验：配制蛋白胨水培养基培养基，分装至试管中，每组2只试管，灭菌。1支试管接菌，另一支作为空白对照37℃培养1～2d。培养后，培养基内滴入3～4滴乙醚，摇匀，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐滴入2滴吲哚试剂。乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。目的：检验真菌是否能产生色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸。结果为阴性即Z-44不能产生色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸。

淀粉水解试验：制作淀粉培养基平板，划线接种菌种，每组设置一个实验组与一个空白组，37℃恒温培养1～2d，观察菌的生长情况，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。目的：检验真菌是否拥有产生淀粉酶和利用淀粉的能力。结果为阴性，即Z-44没有产生淀粉酶和利用淀粉的能力

糖发酵试验：将含指示剂的蛋白胨水培养基以每试管10mL的量分装好，灭菌20min，并将配置的20％糖溶液在113℃高压条件下灭菌30min，灭菌后每管以无菌操作分别加入20％无菌糖液0.5mL制成相应的糖发酵培养基。将代测菌株培养液接种入相应的糖发酵培养基，塞子封紧摇匀37℃培养24h。培养期间，糖发酵产酸致使pH下降，酸和气体产生与否可根据培养后试管中指示剂颜色的变化和杜氏小管内有无气泡产生断定。指示剂溴甲酚紫在碱性环境呈紫色，酸性环境呈黄色。目的：检验微生物是否可以利用一些糖产酸及杜氏小管内有无气泡产生。“+”表示阳性，即待测菌株可以利用该糖产酸，“√”表示杜氏小管中有气泡产生，即待测菌株可以利用该糖产气。对Z-44的检测结果如下：葡萄糖+×、蔗糖+√、乳糖-、淀粉+√、麦芽糖+√。

不同温度水平生长试验：培养基以每试管5mL分装，灭菌，接种量2％接种，分别置于22℃，27℃，32℃，37℃，60℃恒温培养箱中培养1～2d后，观察菌株的生长情况。目的：观察微生物在不同温度下的生长情况。“+”表示待测菌株可以在该温度下生长，“-”表示待测菌株不能在该温度下生长。对Z-44的检测结果如下：22℃+、28℃+、30℃+、37℃+、60℃-。

三、白首乌内生真菌的分子鉴定

菌株培养至对数期，离心，收集菌体，利用DNA提取试剂盒分别提取筛出菌株的基因组DNA。以通用引物ITS1/ITS4进行18S rDNA序列扩增。

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

四、内生真菌发酵液中C₂₁甾体苷含量的测定

1、菌种的活化

配制马铃薯葡萄糖(PDA)培养基，灭菌，1％接种量接种，150rpm，28℃摇床培养，活化菌种。

2、菌种发酵液中C₂₁甾体苷含量的测定

28℃培养菌株，每隔48h，无菌条件下收集发酵液，10,000rpm离心5min，取上清液1mL，加入7％香草醛-冰乙酸溶液0.4mL、浓硫酸0.6mL,摇匀，60℃水浴加热30min，取出，立即冰水浴冷却5min，加冰乙酸10mL，摇匀，放置15min，450nm波长处测OD值，结果如图3所示。

五、发酵液中C₂₁甾体苷的浓缩、纯化

1、取10mL菌种发酵液1,000rpm离心5min，取上清液4mL，采用真空冷冻干燥法处理发酵液。

2、采用“二步法”纯化步骤(1)中C₂₁甾体苷。加入1mL乙醇(萃取剂)，混匀静置30min。设置萃取剂与沉析剂比为1：4，摇匀，1,000rpm离心1min，40℃水浴挥发至无液体残留，晶体析出。

3、采用LC-MS法分析发酵液中C₂₁甾体苷的成分

根据质谱图谱合理性分析选定图4为分析对象，图谱中最高质量端为m/z960.44Da。对比相关文献中C₂₁甾体苷质谱结果，得到该C₂₁甾体苷分子离子峰为[M+Na]⁺。确定纯化物中含C₂₁甾体苷，且相对分子质量与C₂₁甾体苷隔山消苷C₃N(wilfosideC₃N)一致。

六、白首乌胶孢炭疽菌Z-44中C₂₁甾体苷代谢途径分析

1、胞内、胞外蛋白质含量测定

胞外：取一定量发酵液，10,000rpm离心10min，收集上清。

胞内：取一定量发酵液，10,000rpm，离心10min，收集菌体沉淀，以10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗，10,000rpm离心10min，去上清，重复上述步骤2～3次。在菌体沉淀中加入20mL 10mmol/L Tris-HCl缓冲液，冰浴条件下超声破碎，破碎后，8,000rpm，4℃，离心15min。

取待测液1mL于试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，静置2min。测定并记录OD₅₉₅nm的吸光度，如图5所示，并计算胞内、外蛋白含量。

2、蛋白多样性分析

配制分离胶、浓缩胶、电泳缓冲液、染色液、脱色液。进行SDS-PAGE样品前处理。然后固定制胶装置，安装电泳槽，凝胶聚合，加样、电泳、染色、脱色，结果如图6所示。图6中A图为菌株Z-44胞外蛋白SDS-PAGE电泳结果；B图为菌株Z-44胞内蛋白SDS-PAGE电泳结果。Z-44胞内、胞外蛋白多样性分析显示，胞外蛋白丰度高于胞内。检测样品在蛋白质分子标准量Marker45kd～66.2kd区间内，均存在明显条带。推测Z-44具有代谢C₂₁甾体苷的两种关键酶--SQS酶及HMGR酶。

3、C₂₁合成关键酶SQS基因检测

提取真菌基因组DNA，进行模板质量检测，参考资料对胶孢炭疽菌鲨烯合酶基因序列进行同源性对比(见图7)，并设计引物，结果为：

上游F1：5’-TCCGAGTCAACACAAAACCT-3’；

下游R1：3’-GGAAGAGAAAACAAGCGAGA-5’。

琼脂糖凝胶电泳检测待测样品中鲨烯合酶SQS基因，结果如图8所示。

4、关键酶HMGR酶活测定

(1)母液制备

1M Tris-HCl:称取1.2114g的Tris加入8mL的超纯水，滴加盐酸，直至pH为7.0，滴定至10mL；

1mM乙酰-CoA母液：1mg样品加1mL的超纯水充分溶解后，再加入0.235mL灭菌超纯水混匀；

7.5mM NADPH母液:10mg样品，加入1mL灭菌超纯水充分溶解后，再加入0.6mL灭菌超纯水混匀；

40mM DTT：10mg样品，加入0.62mL灭菌超纯水充分溶解后，再加入1mL灭菌超纯水混匀。

(2)样品前处理

10,000rpm，5min离心收集发酵液或胞内提取液，取1mM乙酰-CoA母液至3倍体积的上述样品中，使其终浓度为0.24mM。37℃反应12h，检测HMGR酶活性。

(3)酶活测定

对照组NADPH的氧化速率(a)：在反应体系(5μL1 M Tris-HCl；1μL7.5mM NADPH；10μL40 mMDTT)中加入10μL上清液，立即计时，在340nm处每隔30sec检测NADPH的氧化情况，连续测定5min。

试验组NADPH的氧化速率(b)：在反应体系(5μL1 M Tris-HCl；1μL7.5mM NADPH；10μL40 mM DTT)中加入10μL添加乙酰-CoA的处理样品后，立即计时，在340nm处每隔30sec检测NADPH的氧化情况，连续测定5min。

(4)酶活计算公式

该酶活计算公式为：

HMGR相对活性(U/mg-protein)＝酶液稀释倍数×△A340×V₁/(ε*d*C*V₂)

式中：

△A340＝△A340b-△A340a；

△Ab和△Aa：平均每分钟相对对照组的吸光度变化值；

V₁为反应体系体积(μL)；

ε为NADPH的吸光系数(6.22×10^-6pmol^-1cm^-1)；

d为测定光源直径(0.67mm)；

C为蛋白浓度(mg/mL)；

V₂为加入反应体系中的酶液体积(10μL)。

Z-44胞内、外HMGR酶活检测结果如图9所示。

七、胶孢炭疽菌Z-44产C₂₁甾体苷的发酵条件优化

1、设计3因素3水平正交实验，其中，接种量(0.5％、1％、2％)、pH(6、7、8)和培养温度(28℃、32℃、37℃)，对菌株Z-44进行发酵条件优化，拟进一步提高C₂₁甾体苷发酵产率。

2、选择发酵时间：分别在培养48h、96h、144h时取样，测定发酵液中C₂₁甾体总苷含量，确定最适发酵时间。

3、优化后对发酵液中C₂₁甾体苷含量进行测定

取适量发酵液10,000rpm离心10min，取1mL上清液于试管中，采用本发明中的改良香草醛比色法测定C₂₁甾体苷含量，结果如图10所示。

本发明优化发酵条件，3个因素对胶孢炭疽菌Z-44发酵液中C₂₁甾体苷含量的影响为：pH＞温度＞接种量，因此，pH对该菌C₂₁甾体苷的合成影响最大。菌株Z-44在接种量0.5％，pH 8，温度37℃，培养144h条件下，发酵液中C₂₁甾体苷含量最高，达0.600±0.036mg/mL，相比优化前提高20％。

八、总结

本发明在白首乌内生真菌中获得了一株产C₂₁甾体苷能力较强的胶孢炭疽菌Z-44，其发酵液中C₂₁甾体苷总苷浓度显著高于其他菌株(P＜0.05)，培养48h发酵液中含量达到0.5mg/mL，效果最佳。

对液质联用图谱进行分析，从高质量端确定分子离子峰得到质荷比(m/z)，即表明了该物质分子量，与相关物质的数据库中信息进行比对。分析相邻离子峰之间的质荷比差值，推测丢失的可能碎片，并结合已知C₂₁甾体类化合物的结构判断其合理性。经分析，Z-44发酵液纯化物中含有C₂₁甾体类化合物隔山消苷C₃N(图4)。

本发明测得胶孢炭疽菌Z-44胞内蛋白含量为0.049±0.009mg/mL，胞外分泌蛋白含量为0.195±0.024mg/mL，胞外蛋白含量显著高于胞内(P＜0.05)。

本发明中Z-44胞内、外目的蛋白在45kd～66.2kd之间，查阅文献，C₂₁甾体苷代谢关键酶鲨烯合酶(SQS)的相对分子质量约为46.7kd～47.9kd，HMGR酶的相对分子质量约为63.3kd～64.3kd，对照文献资料，该菌两种C₂₁代谢关键酶检测结果均为阳性。

本发明HMGR酶活检测结果显示胶孢炭疽菌Z-44能够合成代谢C₂₁甾体苷的关键酶HMGR酶，通过酶活动力学分析，胶孢炭疽菌Z-44胞外酶活为0.018±0.045U，胞内酶活1.540±0.050U，胞内HMGR酶活显著高于胞外(P<0.05)。

本发明优化发酵条件，3个因素对胶孢炭疽菌Z-44发酵液中C₂₁甾体苷含量的影响为：pH＞温度＞接种量。因此，pH对该菌C₂₁甾体苷的合成影响最大。其最优组合为：A1B3C3，即当接种量为0.5％、pH为8、培养温度为37℃时，C₂₁甾体苷浓度为0.602±0.036mg/mL，相比优化前产率提高20％。

由此可知，胶孢炭疽菌Z-44是一株高效产C₂₁甾体苷的菌种，其性质稳定、产量较高，在抗肿瘤药物开发利用方面具有较高的开发利用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 盐城师范学院

<120> 一种高效合成C21甾体苷的胶孢炭疽菌Z-44及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccgagtcaa cacaaaacct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagagaaa acaagcgaga 20

Claims (6)

1.一种高效代谢C₂₁甾体苷的胶孢炭疽菌Z-44，其特征在于，该胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)Z-44于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211164，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。

2.权利要求1所述的胶孢炭疽菌Z-44发酵制备C₂₁甾体苷的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将胶孢炭疽菌Z-44按0.5％～2.0％接种量接种到液体培养基中，该液体培养基pH为6～8，150rpm摇床、28～37℃条件下发酵培养48～144h，得到含有C₂₁甾体苷的发酵液。

3.如权利要求2所述的胶孢炭疽菌Z-44发酵制备C₂₁甾体苷的方法，其特征在于，所述接种量为0.5％，发酵培养温度37℃，培养时间为144h。

4.如权利要求3所述的胶孢炭疽菌Z-44发酵制备C₂₁甾体苷的方法，其特征在于，所述液体培养基为马铃薯葡萄糖PDA液体培养基，该培养基的pH为8。

5.权利要求1所述的胶孢炭疽菌Z-44在制备抗癌药物C₂₁甾类化合物中的应用。

6.如权利要求5所述的的应用，其特征在于，所述抗癌药物C₂₁甾类化合物为隔山消苷C₃N。

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