CN111518710B - 一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用 - Google Patents

一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111518710B
CN111518710B CN201910107411.3A CN201910107411A CN111518710B CN 111518710 B CN111518710 B CN 111518710B CN 201910107411 A CN201910107411 A CN 201910107411A CN 111518710 B CN111518710 B CN 111518710B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
enterobacter
strain
fermentation
microbial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910107411.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111518710A (zh
Inventor
吴凌天
李柯铖
郗栋南
黎宇航
吴金男
董雯
卢艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zeno Suzhou Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Changshu Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changshu Institute of Technology filed Critical Changshu Institute of Technology
Priority to CN201910107411.3A priority Critical patent/CN111518710B/zh
Publication of CN111518710A publication Critical patent/CN111518710A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111518710B publication Critical patent/CN111518710B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株肠杆菌Kosakonia cowanii，菌株号LT‑1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为(CCTCC No：M 2017850)，保藏日期为2017年12月29日。本发明还公开了该肠杆菌在合成微生物多糖中的应用。该菌株以蔗糖作为碳源，花生饼粉作为氮源时，微生物多糖产量可达到15.35～59.52g/L，蔗糖转化率高达57.83％～70.17％。本发明所述操作方法简单，生产成本低，对微生物多糖的工业化生产具有十分重要的意义。

Description

一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用
技术领域
本发明涉及一株肠杆菌Kosakonia cowanii LT-1菌株及利用该菌株产微生物多糖方法，它属于微生物学及生物工程技术领域。
背景技术
生物多糖广泛存在于微生物、大型真菌、动物和植物中，是天然界最丰富的聚合物之一。随着生物技术的高速发展，微生物多糖功能的研究也日益完善，成为免疫学、生物学和药学的研究热点。研究表明，微生物多糖由于其独特的化学结构、优越的物理化学性质、流变学特性以及本身的生物活性和营养价值，微生物多糖在各个领域均具有相关应用。此外，微生物多糖具有生产周期短、原料廉价、纯化简单以及可在人工控制下进行大规模工业化生产等动植物多糖所不具备的优势。因此，微生物多糖正迅速成为重要的新兴的生物材料。
经检索，目前未见有使用肠杆菌K.cowanii发酵合成微生物多糖的专利报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一株产微生物多糖的菌株。
本发明还要解决的技术问题是提供肠杆菌在制备微生物多糖中的应用。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
发明人在2017年从江苏省苏州市地区土壤中筛选得到一株肠杆菌，分类命名为Kosakonia cowanii LT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，登记入册的保藏号为CCTCC No：M 2017850，保藏日期为2017年12月29日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。
所述菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。
表1菌落形态学特征与生理生化特性
Figure GDA0002365287160000021
2、16S rDNA序列分析：
测得菌株的16S rDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQID No.1：所示。将所测序列从Gene Bank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建 16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与肠杆菌HME8565达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌，具体为肠杆菌K.cowanii LT-1。
上述肠杆菌K.cowanii LT-1在制备微生物多糖中的应用也在本发明的保护范围之内。
利用上述肠杆菌K.cowanii LT-1制备微生物多糖的具体的方法如下：将肠杆菌LT-1 接种于斜面固体培养基，转接到种子培养基，最后接种于多糖发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有细菌微生物多糖。
本发明所述肠杆菌K.cowanii LT-1及其所述菌在制备微生物多糖的应用，依次包括以下步骤：
1.培养基的配制：
斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；
液体种子培养基：蔗糖15g/L，花生饼粉3g/L，无机盐及金属离子1～2.5g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；
固体种子培养基：液体种子培养基，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2， 121℃灭菌20min；
富集液体培养基：蔗糖30g/L，酵母粉3g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2， 121℃灭菌20min；
富集固体培养基：富集液体培养基、琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2， 121℃灭菌20min；
发酵培养基：蔗糖30g/L，花生饼粉6g/L，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.04g/L，自来水配制，pH值调至7.0～7.2，121℃灭菌20min；
2.菌种选择：
选已保藏菌株肠杆菌K.cowanii LT-1；
3.菌种活化：
将肠杆菌K.cowanii LT-1菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养24～36h，再次挑取单菌落划线到普通固体培养基上，24～36℃培养24～36h，得到活化菌种备用；
4.种子培养：
取步骤3中活化好的菌种，无菌条件下接种2～4环于种子液的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为28～38℃培养24h，得到发酵种子液；
5.发酵培养：
将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以4％～10％体积比的接种量，将种子液接种于发酵培养基摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，28～38℃培养36～48h；当发酵液中多糖浓度不再上升时，发酵停止；
6.多糖提取：
(1)取步骤5中发酵液离心除去菌体，上清减压蒸馏至1/5体积后加入3～5倍体积的95％无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用75％乙醇洗涤，再高速离心收集沉淀恒温干燥后可获得微生物多糖粗品；
(2)将步骤(1)所得的多糖粗品溶解于25倍体积蒸馏水中，用Na2CO3调pH至 7.0～8.0，加入质量为多糖1％～5％的胰蛋白酶，50～60℃水解1～2h后，用草酸调pH至 5.0～6.0添加质量为多糖质量2‰～5‰的木瓜蛋白酶，60～70℃水解2～4h后，于100℃水浴加热4～6min，以终止酶反应；
(3)将步骤(2)所得蛋白酶处理液用草酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌， 15,000rpm离心10～15min，取上清；
(4)将步骤(3)所得清液加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得多糖溶液；
(5)将步骤(4)所得多糖溶液用氨水调pH值至8.0，在50℃下滴加30％的H2O2，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用草酸中和pH至7.0；蒸馏水透析2～4d后，冷冻干燥得多糖精品，并蒸馏回收酒精；
7.多糖含量测定
本发明利用苯酚硫酸法测定多糖含量：
精密称取干燥恒重的葡萄糖，分别配置成0.000、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、 0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mg/mL的标准液，同时配置一定浓度的多糖溶液。精密吸取各标准液和多糖溶液0.2mL，分别置于试管内，各加5％苯酚试剂0.1mL和浓硫酸0.5mL，立刻摇匀。沸水加热15min，冰浴，以0mg/mL的标准液作空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，并计算多糖的含量。
有益效果：本发明具有如下优势：
(1)本发明筛选得到一株微生物多糖生产菌株，该菌株在多糖发酵过程以廉价的蔗糖作为碳源，廉价的花生饼粉作为氮源，合成微生物多糖，大大节约成本，操作方便简单。
(2)该菌株发酵合成微生物多糖，产量可达到17.35～59.52g/L，蔗糖转化率高达57.83％～70.17％。大大降低了生产成本，对于微生物多糖的生产具有十分重要的意义和经济价值。
附图说明
图1为肠杆菌LT-1的16S rDNA PCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和肠杆菌LT-1 的系统发育树(B)。
图2为肠杆菌LT-1产微生物多糖水解液液相色谱图。
图3为肠杆菌LT-1产微生物多糖的红外光谱图。
图4为肠杆菌LT-1产微生物多糖的核磁共振图(NMR)1H图谱。
图5为肠杆菌LT-1产微生物多糖的核磁共振图(NMR)13C图谱。
图6为摇瓶合成肠杆菌LT-1微生物多糖进程曲线。
图7为7.5L发酵罐补料合成肠杆菌LT-1微生物多糖进程曲线。
图8为1t发酵罐补料合成肠杆菌LT-1微生物多糖进程曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：菌株LT-1的筛选
从60份来自全国各地的酒糟中筛选微生物多糖产生菌，各取1g分别加入装有无菌富集培养基的三角瓶中，装液量为50mL/250mL，在37℃条件下，置于摇床以200rpm，富集培养48h。取1mL培养液转接到相同的液体富集培养基中相同条件下进行第二次富集培养，培养48h。在无菌条件下，将培养液稀释到10-8和10-9，各取0.2mL涂布于苯胺蓝多糖筛选平板中，30℃培养24h，
根据菌落表面湿润粘稠的程度和合成产物与苯胺蓝反应的颜色变化，筛选出阳性菌株并进行分离纯化，再接种到多糖发酵培养基中，在30℃，200rpm条件下培养48h，然后测定初筛菌株多糖的产量，以此获得产量最高的菌株。
所述的苯胺蓝多糖筛选平板包含如下组分：蔗糖30g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，苯胺蓝0.05g/L，琼脂20g/L，自来水配置，自然pH，121℃灭菌20min；
实施例2：菌株LT-1的菌属鉴定及发酵产物微生物多糖的鉴定
①肠杆菌K.cowanii LT-1的鉴定
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株LT-1的基因组DNA，以上游引物27F 和下游引物1492R PCR扩增16S rDNA序列如图1A所示，将PCR扩增后产物进行胶回收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株的16S rDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQID No.1所示。将测序结果与Gene Bank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，并使用BLAST程序进行同源性比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与肠杆菌K.cowanii HME8565达到100％同源性(图1B)。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌，具体命名为肠杆菌K.cowanii LT-1。
②肠杆菌K.cowanii LT-1发酵产物的鉴定
取肠杆菌K.cowanii LT-1多糖发酵液于5,000rpm条件下离心除去菌体，上清液在60～70℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5，加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用无水乙醇脱水，经过高速离心收集沉淀，恒温干燥后可获得微生物多糖粗品；将多糖粗品溶解于蒸馏水中，用Na2CO3调pH至7.0～8.0，加入质量为多糖2％～5％的胰蛋白酶，45～55℃酶解1～2h后，用醋酸调pH至5.0～6.0添加质量为多糖质量2％～5％的木瓜蛋白酶，55～65℃水解2～4h后，于100℃水浴加热15～30min，终止酶反应；将蛋白酶处理液用醋酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，5,000rpm离心10～15min，取上清加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得多糖溶液；用氨水调pH 值至8.0，在50℃下滴加30％的H2O2，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用稀盐酸中和pH至7.0；蒸馏水透析2～4d后，冷冻干燥得多糖提纯产物。
取多糖提纯产物0.3g于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于30℃水浴60 min，取出后加入84mL去离子水稀释到5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节pH至6.5，得到多糖酸水解液，多糖水解液液相色谱结果如图2所示。从单糖高效液相色谱图中可以看出，EPS共有四种单糖组分，分别为葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖。
利用红外光谱仪测定K.cowanii LT-1发酵微生物多糖提纯产物的红外图谱，取样品 0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm-1。以D2O为溶剂，对K.cowanii LT-1发酵提纯产物进行NMR1H和NMR13C 检测。结果如图4、图5所示。
实施例3：肠杆菌LT-1合成微生物多糖的发酵碳源种类优化
本实施例说明不同碳源对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含30g/L甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、柠檬酸盐为唯一碳源的发酵培养基中，初始pH值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50 mL/250mL三角瓶，发酵培养48h，菌株微生物多糖的产生情况明显不同。当且仅当碳源为蔗糖时菌株才能合成微生物多糖，即菌株依赖蔗糖合成微生物多糖。因此，选择蔗糖为发酵培养基的碳源，多糖产量达到17.35g/L，蔗糖转化率为57.83％，多糖合成速率为0.36g/L/h。
实施例4：肠杆菌LT-1发酵合成微生物多糖的蔗糖浓度的优化。
本实施例说明不同蔗糖浓度对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v) 的接种量分别接种于含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g/L的蔗糖发酵培养基中，初始pH值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50mL/250 mL三角瓶，发酵培养48h。当所选蔗糖浓度为30g/L时，菌株的微生物多糖产量最多，为17.95g/L，蔗糖转化率为59.83％，多糖合成速率为0.37g/L/h。
实施例5：肠杆菌LT-1发酵合成微生物多糖氮源种类的优化。
本实施例说明不同氮源对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含5g/L牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、黄豆粉、小麦胚芽粉、酵母粉为唯一氮源的发酵培养基中，初始pH值为7.0～7.2，于 28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养48h，菌株微生物多糖的产生情况明显不同。当所选氮源为花生饼粉时，菌株的微生物多糖产量最多。因此，选择花生饼粉为发酵培养基的氮源，多糖产量达到18.21g/L，蔗糖转化率为60.70％，多糖合成速率为0.38g/L/h。
实施例6：肠杆菌LT-1发酵合成微生物多糖的花生饼粉浓度的优化
本实施例说明不同花生饼粉浓度对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％ (v/v)的接种量分别接种于含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L花生饼粉的发酵培养基中，初始pH值为7.0～7.2，于28～32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50mL/250 mL三角瓶，发酵培养48h，菌株微生物多糖的产量差别较大。当所选花生饼粉浓度为 6g/L时，菌株的微生物多糖产量最多。因此，选择6g/L花生饼粉浓度为发酵培养基的氮源浓度，多糖产量达到19.24g/L，蔗糖转化率为64.13％，多糖合成速率为0.40g/L/h。
实施例7：肠杆菌LT-1发酵合成微生物多糖的温度优化。
本实施例说明不同培养温度对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v) 的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为7.0～7.2，于200rpm恒温振荡培养，培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养48h，发酵培养温度分别为24℃、26℃、 28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，菌株微生物多糖的产生情况明显不同。从结果可以看出在30℃菌株的微生物多糖产量较高。因此选择30℃为最佳生产微生物多糖的温度范围，多糖产量达到19.88g/L，蔗糖转化率为66.27％，多糖合成速率为0.41g/L/h。
实施8：肠杆菌LT-1发酵合成微生物多糖所需金属盐种类及其浓度的优化。
本实施例说明不同金属盐及其浓度对菌株产微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于含有以下各不同浓度金属盐的发酵培养基中，经过单因素变量实验如下：
硝酸钠3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0g/L以及对照组，硝酸钠最佳浓度为6.0g/L；
磷酸二氢钾0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，磷酸二氢钾最佳浓度为0.30g/L；
硫酸镁0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，硫酸镁最佳浓度为0.50g/L；
硫酸锰0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g/L以及对照组，硫酸锰最佳浓度为0.04g/L；
对于不同实验组的发酵培养基，不同浓度的金属离子设置3组平行对照，初始pH值为7.0，于30℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养48h，菌株产多糖最高，多糖产量达到20.16g/L，蔗糖转化率为67.20％，多糖合成速率为0.42g/L/h。
实施例9：肠杆菌LT-1发酵合成微生物多糖时间的优化
本实施例说明不同发酵培养时间对菌株微生物多糖产量的影响，将种子培养液以4％ (v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为7.0～7.2，于200rpm，30℃恒温振荡培养，培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养时间分别每隔4h取一次样并测定多糖的含量，共发酵60h，菌株不同时间段微生物多糖的产生情况明显不同。从结果可以看出在28～32℃菌株的微生物多糖产量较高。因此，选择48h为最佳生产微生物多糖的时间范围，多糖产量达到21.05g/L，蔗糖转化率为70.17％，多糖合成速率为0.44g/L/h(图6)。
实施例10：7.5L发酵罐补料合成肠杆菌LT-1微生物多糖
斜面固体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0，121℃灭菌20min；
液体种子培养基为：蔗糖15g/L，花生饼粉3g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.05g/L，自来水配制，调整pH值至7.0，121℃灭菌20min；
发酵培养基为：蔗糖30g/L，花生饼粉6g/L，硫酸锰0.04g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.5g/L，硝酸钠6g/L，自来水配制，调整pH值至7.0，121℃灭菌20min；
将肠杆菌LT-1接种在种子培养基，在30℃，200rpm的摇床条件下培养48h，将种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有7.5L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：整个发酵过程中保持温度32℃，空气比控制在1.4VVM，转速为350 rpm，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用盐酸或氨水控制发酵液pH值在7.0之间。当发酵液中残留还原糖在10g/L时，打开补料装置，将蔗糖补入发酵液中，除最后一次补料，其他补料时控制发酵液中蔗糖终浓度保持在30g/L左右，进行补料发酵。发酵 86h，微生物多糖浓度达到55.67g/L，蔗糖转化率为65.49％，多糖合成速率为0.65g/L/h。
实施例11：1t发酵罐补料合成肠杆菌LT-1微生物多糖
斜面固体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0，121℃灭菌20min；
液体种子培养基为：蔗糖15g/L，花生饼粉3g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.05g/L，自来水配制，调整pH值至7.0，121℃灭菌20min；
发酵培养基为：蔗糖30g/L，花生饼粉6g/L，硫酸锰0.04g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.5g/L，硝酸钠6g/L，自来水配制，调整pH值至7.0，121℃灭菌20min；
将肠杆菌LT-1接种在种子培养基，在30℃，200rpm的摇床条件下培养48h，将种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有750L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养条件：整个发酵过程中保持温度32℃，空气比控制在1.4VVM，转速为300 rpm，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用盐酸或氨水控制发酵液pH值在7.0～7.2 之间。当发酵液中残留还原糖在10g/L时，打开补料装置，将蔗糖补入发酵液中，除最后一次补料，其他补料时控制发酵液中蔗糖终浓度保持在30g/L左右，进行补料发酵。发酵72h，微生物多糖浓度达59.62g/L，蔗糖转化率为70.14％，多糖合成速率高达0.83 g/L/h。(图7)
实例12：
此外，该菌及其所产多糖可以促进经济类作物(玉米、小麦、水稻、土豆、红薯、油菜、棉花、草莓等)生长、提高种子发芽率、果实增产和提早上市的作用。
最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 常熟理工学院
<120> 一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1388
<212> DNA
<213> 肠杆菌LT1(Kosakonia cowanii)
<400> 2
acggtaacag gaagcagctt gctgcttcgc tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct 60
gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt 120
cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc agatgggatt 180
agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg 240
accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtatgaagaa ggccttcggg 360
ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggc gatgtggtta ataaccgcgt cgattgacgt 420
tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc 480
aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtctgtca agtcggatgt 540
gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca tccgaaactg gcaggcttga gtctcgtaga 600
ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccggtgg 660
cgaaggcggc cccctggacg aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga cttggaggtt gtgcccttga 780
ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 840
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 900
gcaacgcgaa gaaccttacc tggtcttgac atccacagaa cttggcagag atgccttggt 960
gccttcggga actgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt ccggccggga 1080
actcaaagga gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1140
ggcccttacg accagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacaaagag aagcaaactc 1200
gcgagagcaa gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac 1260
tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgtg aatcagaatg tcacggtgaa tacgttcccg 1320
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt 1380
aaccttcg 1388

Claims (7)

1.一株肠杆菌Kosakonia cowanii，菌株号LT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 2017850，保藏日期为2017年12月29日。
2.权利要求1所述的肠杆菌在制备微生物多糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将肠杆菌LT-1接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵得到微生物多糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在，所述发酵培养基中的碳源为蔗糖。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下组分：
蔗糖20～40g/L，花生饼粉4～8g/L，硝酸钠5～8g/L，硫酸锰0.02～0.05g/L，磷酸二氢钾0.2～1.0g/L，硫酸镁0.5～1.0g/L，pH值7.0～7.2。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的好氧培养条件是：初始pH为7.0～7.2、通气比控制在1.0～1.5VVM、培养温度为28～32℃、培养时间为48～96h。
7.权利要求1所述肠杆菌在促进植物生长及植物种子萌发中的应用。
CN201910107411.3A 2019-02-02 2019-02-02 一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用 Active CN111518710B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910107411.3A CN111518710B (zh) 2019-02-02 2019-02-02 一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910107411.3A CN111518710B (zh) 2019-02-02 2019-02-02 一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111518710A CN111518710A (zh) 2020-08-11
CN111518710B true CN111518710B (zh) 2022-03-29

Family

ID=71900632

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910107411.3A Active CN111518710B (zh) 2019-02-02 2019-02-02 一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111518710B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111518711B (zh) * 2019-02-02 2021-12-07 常熟理工学院 一株肠杆菌株及其在联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇中的应用
CN111518712B (zh) * 2019-02-02 2022-02-11 常熟理工学院 一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用
CN114437985B (zh) * 2022-02-18 2023-04-11 南京工业大学 一株产气肠杆菌及其在合成微生物多糖中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101440355A (zh) * 2008-10-06 2009-05-27 浙江大学 一种阴沟肠杆菌及其多糖和多糖的应用
CN102586151A (zh) * 2012-03-05 2012-07-18 江南大学 一株高产多糖的菌株及利用该菌株发酵生产多糖的方法
CN103215197A (zh) * 2012-04-19 2013-07-24 湖北中烟工业有限责任公司 桑肠杆菌及利用其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法
CN105670975A (zh) * 2016-03-14 2016-06-15 山东省食品发酵工业研究设计院 一种高产胞外多糖的假单胞菌株及其应用
CN107058166A (zh) * 2017-01-13 2017-08-18 东南大学 一株产胞外多糖的植物乳杆菌

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101440355A (zh) * 2008-10-06 2009-05-27 浙江大学 一种阴沟肠杆菌及其多糖和多糖的应用
CN102586151A (zh) * 2012-03-05 2012-07-18 江南大学 一株高产多糖的菌株及利用该菌株发酵生产多糖的方法
CN103215197A (zh) * 2012-04-19 2013-07-24 湖北中烟工业有限责任公司 桑肠杆菌及利用其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法
CN105670975A (zh) * 2016-03-14 2016-06-15 山东省食品发酵工业研究设计院 一种高产胞外多糖的假单胞菌株及其应用
CN107058166A (zh) * 2017-01-13 2017-08-18 东南大学 一株产胞外多糖的植物乳杆菌

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Optimization of γ-polyglutamic acid synthesis using response surface methodology of a newly isolated glutamate dependent Bacillus velezensis Z3;Zhu, R.Y.等;《International Microbiology》;20180618;摘要 *
保加利亚乳杆菌胞外多糖合成条件的优化及其在发酵乳中的应用研究;吴荣荣等;《中国乳品工业》;20080225(第02期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111518710A (zh) 2020-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106754508B (zh) 一株枯草芽孢杆菌菌株及其在酱油发酵增香中的应用
CN111518710B (zh) 一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用
KR101778436B1 (ko) 우수한 초산 생성능을 가지는 신규한 아세토박터속 slv-7 균주 및 이의 용도
CN110484471B (zh) 一株高产细菌纤维素的耐酸菌株及其生产细菌纤维素的方法
CN111411061B (zh) 一株地衣芽孢杆菌的筛选及其在食品生产中的应用
CN112143664B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌株及其在合成微生物多糖中的应用
CN111518711B (zh) 一株肠杆菌株及其在联产微生物胞外多糖和2,3-丁二醇中的应用
CN108018247B (zh) 一种高产直链葡聚糖菌株及其葡聚糖发酵生产方法
WO2023016387A1 (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用
CN113817614B (zh) 一种高效合成c21甾体苷的胶孢炭疽菌z-44及其应用
CN114015607B (zh) 一种高产5-甲基四氢叶酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN112176012B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸中的应用
CN112143663B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌株及其在合成γ-聚谷氨酸中的应用
CN109456898A (zh) 一种球毛壳菌右旋糖酐酶的发酵制备及其应用
CN107365730A (zh) 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产支链淀粉酶的方法
CN111518712B (zh) 一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用
CN108587923B (zh) 一种改善苹果酸发酵性能的方法
CN116286513B (zh) 一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法
CN113957024B (zh) 一株根瘤菌GL-1803及其在制备不溶性β-葡聚糖中的应用
CN116590203B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-异亮氨酸中的应用
CN112300954B (zh) 解淀粉芽孢杆菌及其在发酵生产谷氨酰胺酶中的应用
CN110438039B (zh) 一株丙氨酸发酵用菌株
CN112574900B (zh) 类芽孢杆菌及其生产果聚糖的方法
CN107142219B (zh) 一株产三萜类化合物的滴孔菌及其应用
CN116622565A (zh) 一种凝结芽孢杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221212

Address after: Room 903, Building 6, No. 88, Xianshi Road, Changshu High tech Industrial Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province, 215500

Patentee after: Zeno (Suzhou) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 215500 Changshou City South Three Ring Road No. 99, Suzhou, Jiangsu

Patentee before: CHANGSHU INSTITUTE OF TECHNOLOGY

TR01 Transfer of patent right