CN113774001B - 一株高产c21甾体苷的根瘤农杆菌f-45及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产C₂₁甾体苷的根瘤农杆菌F‑45及其应用。本发明内生放线菌从江苏省滨海县果老首乌种植基地的滨海白首乌植株中筛得，利用平板划线分离纯化菌株，编号并保存菌种，所用的亲本菌株经理化性状分析、16SrDNA引物扩增及序列测定及分析，鉴定结果为根瘤农杆菌F‑45。该根瘤农杆菌F‑45(Agrobacterium tumefaciens F‑45)于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211166，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。本发明根瘤农杆菌F‑45生长周期短、易代谢控制、易菌种选育和大规模发酵工业化生产，可作为产C₂₁甾体类化合物的优势菌种。

Description

一株高产C21甾体苷的根瘤农杆菌F-45及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种高效代谢合成C₂₁甾体类化合物的根瘤农杆菌F-45及其应用。

背景技术

从已经被证实具有抗癌作用的中药中分离筛选出有效、安全的抗癌新药，已成为研究的热点。白首乌中C₂₁甾体类化合物是目前主要的抗癌活性成分之一，也是具有潜力的抗癌药物来源。但因资源有限、植物体含量低等限制，探究其新的生物合成途径显得尤为重要。由于药用植物内生放线菌具有资源丰富、种类多样、生长周期短、易代谢控制、易菌种选育和大规模发酵工业化生产等优点。因此，在合成C₂₁甾类化合物的白首乌内生菌中，放线菌研究最具前景。

目前，可代谢C₂₁甾类化合物的放线菌主要有铜绿假单胞杆菌、烟曲霉菌、假单胞杆菌、灰色链霉菌等，其代谢机制为以C₂₁甾体为底物，微生物相关代谢酶对底物某一化学位置进行特定的生物催化反应所获得的特定产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种根瘤农杆菌F-45及其在高效代谢合成抗癌药物C₂₁甾体类化合物中的应用，旨在解决现有从植物中提取抗癌药物所存在的资源有限、植物体含量低等的问题。

本发明是这样实现的，一种根瘤农杆菌F-45，该根瘤农杆菌F-45 (Agrobacteriumtumefaciens)于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211166，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。

本发明进一步公开了上述根瘤农杆菌F-45在制备抗癌药物C₂₁甾类化合物中的应用。

优选地，所述根瘤农杆菌F-45代谢合成C₂₁甾体类化合物的关键酶。

优选地，所述关键酶包括3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)和鲨烯合酶(SQS)。

本发明克服现有技术的不足，提供一种根瘤农杆菌F-45及其在高效代谢合成抗癌药物C₂₁甾体类化合物中的应用。本发明内生放线菌从江苏省滨海县果老首乌种植基地的滨海白首乌植株中筛得，利用平板划线分离纯化菌株，编号并保存菌种，所用的亲本菌株经理化性状分析、16S rDNA引物扩增及序列测定及分析，鉴定结果为根瘤农杆菌F-45，该根瘤农杆菌F-45(Agrobacterium tumefaciens F-45)于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211166，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。

在此基础上，本发明采用酶学分析、基因分析、代谢途径分析等手段揭示根瘤农杆菌F-45具有C₂₁甾体类化合物的合成能力，这为C₂₁甾体类化合物大规模高产制备提供新途径。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明根瘤农杆菌F-45与药用植物白首乌相比，生长周期短、易代谢控制、易菌种选育和大规模发酵工业化生产；

(2)本发明根瘤农杆菌F-45不仅能产生与宿主植物相同或相似的产物，而且能产生大量结构新颖的活性代谢产物，可为后续生物活性物质的工业化生产提供可靠的菌种资源支撑；

(3)本发明根瘤农杆菌F-45具有生长性能良好、实用性强以及应用范围广等特点，可考虑作为产C₂₁甾体类化合物的优势菌种；其中，该根瘤农杆菌 F-45在37℃、pH＝7以及接种量1％的条件下，经发酵培养9d后，发酵液中 C₂₁甾体类化合物含量较高达0.60±0.05mg/mL。

附图说明

图1是本发明从白首乌根、茎、叶中共分离得到7株内生放线菌的纯化图；

图2是本发明根瘤农杆菌F-45的系统进化树；

图3是本发明实施例中筛出内生放线菌发酵液中C₂₁甾体类化合物总含量测定结果；

图4是本发明实施例中烘干和真空冷冻干燥工艺处理后根瘤农杆菌F-45发酵液的高效液相色谱鉴定结果；

图5是本发明实施例中根瘤农杆菌F-45的胞内、胞外可溶性蛋白含量结果；

图6是本发明实施例中根瘤农杆菌F-45的胞外蛋白SDS-PAGE电泳图；

图7是本发明实施例中农杆菌鲨烯合酶基因序列同源性对比结果；

图8是本发明实施例中农杆菌/根瘤菌与F-45的亲缘性分析；

图9是本发明实施例中根瘤农杆菌F-45中鲨烯合酶基因检测结果图；

图10是本发明实施例中根瘤农杆菌F-45中HMGR酶活测定结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

一、白首乌内生放线菌的分离纯化及筛选

1、样品前处理

本发明所用滨海白首乌植株采集于江苏省滨海县果老首乌种植基地，经表面冲洗、消毒等处理后，立即进行内生菌的分离。

将新鲜白首乌植株洗净，吸除表面水分，于超净台中紫外杀菌10min；无菌水冲洗3次，吸干表面水分；以75％乙醇溶液浸泡根、茎、叶、种子各5min，无菌水冲洗3次；再以3％次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗5次，保留最后一次冲洗液，待消毒检验用。

2、培养基的配制

高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0g、硝酸钾1.0g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.001g、水1000mL。

称取20g可溶性淀粉，用50mL水调成糊状后，倒入950mL热水，搅匀后加入其他药品，使它溶解，调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。

3、菌种的分离与纯化

将白首乌根、茎、叶、种子用无菌手术刀去皮切成小碎块(约5～10g)，置于研钵中，加入蒸馏水和少量石英砂研磨成匀浆，静置30min；吸取1mL上清液，梯度稀释10^-1、10^-2、10^-3，得到3种不同浓度的根，茎，叶，种子组织液，吸取100μL各浓度组织液，涂布于不同培养基平板上，30℃，培养2～5d；待长出菌落，平板划线分离纯化菌株，直至得到单一的纯菌落，分别编号为F-2、 F-3、F-20、F-24、F-25、F-45、F46并保存菌种。

二、筛出放线菌种鉴定

1、理化指标检测

(1)培养基的配制

葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K₂HPO₄ 2g、蒸馏水 1000mL、pH调至7.0～7.2。

蛋白胨水培养基：蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL，pH调至7.6。

淀粉培养基：蛋白胨10g、NaCl 5g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、琼脂15～20g、蒸馏水1000mL。

糖发酵培养基：蛋白胨水培养基1000mL、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1～2mL、 pH调至7.6，另配20％糖溶液(葡萄糖、乳糖、蔗糖等)各10mL。

吲哚试验试剂：对二甲氨基苯甲醛5.0g、乙醇75mL、浓盐酸25mL。

甲基红试剂：甲基红0.1g、95％酒精300mL、蒸馏水100mL。

(2)甲基红试验

配制葡萄糖蛋白胨水培养基，分装至试管中，高压灭菌；待培养基冷却后，将菌接入葡萄糖蛋白胨水培养基，设置平行组及空白对照，于37℃下培养1～2 d。将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2滴甲基红试剂，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。

(3)吲哚试验

配制蛋白胨水培养基，分装至试管中，高压灭菌；待培养基冷却后，将菌接入蛋白胨水培养基，并设置平行组及空白对照，于37℃下培养1～2d；培养后的蛋白胨水培养基加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min；待乙醚上升后，沿试管壁缓慢加入2滴吲哚试剂；在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

(4)淀粉水解试验

将筛选出的菌株划线接种至淀粉固体培养基，37℃恒温培养1～2d，并观察菌株生长情况。

滴入少量卢戈氏碘液于平板中，使碘液均匀铺满整个平板；若菌苔周围出现无色透明圈，表明淀粉被水解，为阳性；透明圈的大小可初步判断该菌株水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。

(5)糖酵解试验

将含指示剂的蛋白胨水培养基分装，灭菌；并将配制的20％糖溶液在113℃高压条件下灭菌30min，灭菌后每管分别加入20％无菌糖液0.5mL制成相应的糖发酵培养基。

将待测菌株接种入相应的糖发酵培养基，加塞摇匀，37℃培养24h；培养期间，糖发酵产酸致使pH下降，酸和气体产生与否可根据培养后试管中指示剂颜色的变化和杜氏小管内有无气泡产生断定；指示剂溴甲酚紫在碱性环境呈紫色，酸性环境呈黄色。

(6)不同温度水平生长试验

将配制好的液体培养基分装，高压灭菌。将菌株以2％的接种量接入液体培养基中，加塞摇匀，分别置于22℃、27℃、32℃、37℃、60℃恒温培养 1～2d后，并观察菌株的生长情况。

2、分子鉴定

用高氏一号培养基培养过夜，收集菌体并保存菌株，利用生工细菌基因组提取试剂盒提取菌株基因组DNA；PCR扩增菌株16S rRNA基因，上下游引物序列分别为：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

1492R：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

50μLPCR反应体系：10×Tap Buffer 5μL、dNTP(2.5mM)4μL、1492R 下游引物与27F上游引物各1μL、DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、基因组DNA 3μL、ddH₂O 35μL。

扩增参数为：95℃预变性5min、94℃30s、57℃40s、72℃40s，35 个循环后，72℃延伸5min，反应结束后，取5μL PCR产物电泳检测，并进行测序。

利用DNA MAN软件对菌种的核酸序列进行处理，得到完整的核酸序列，并在NCBI上进行核酸序列比对；利用生理生化实验、形态学和分子生物学鉴定菌株，对细菌进行鉴定。

三、白首乌内生放线菌发酵液中C₂₁甾体类化合物含量检测

1、菌种扩培

将筛选出的白首乌内生放线菌接入高氏一号培养基进行扩培24～84h，接种量为1％，37℃、150rpm。

2、发酵培养

将扩培后的放线菌转接至高氏一号培养基，设置三个平行组及对照空白组，接种量为1％，37℃，150rpm。设置间隔36h取样测定pH值，间隔72h测定C₂₁甾体总苷含量。

3、C₂₁甾体类化合物总含量的测定

取适量发酵液10,000rpm离心10min，取1mL上清液于试管中，以优化后的最佳条件进行反应。反应结束，立刻转移至冰水浴，终止反应并加入10mL 冰乙酸，混匀。在最佳测定波长下，测定数据并记录。

四、发酵液中C₂₁甾体类化合物的提取和检测

1、样品前处理

样品浓缩：取10mL菌种发酵液，10,000rpm离心5min，各取上清液4mL，分别置于60℃烘干和-20℃预冻24h后真空冷冻干燥24h，得到干燥样品A 和B。

样品纯化：干燥样品中各加入8mL乙醇，匀浆器打匀，10,000rpm离心5 min，取上清8mL；加入混合有机溶剂32mL摇匀，1,000rpm离心1min，40℃水浴挥发至无液体残留。

2、紫外全波长扫描

将纯化样品用60％乙醇水溶液定容至2mL中，摇匀，经微孔滤膜(0.22μm) 过滤后，稀释10倍备用。各取样品以及对照品2μL进行紫外全波长扫描。

3、高效液相色谱鉴定

选定样品进行高效液相色谱鉴定。

色谱条件为：Alltima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈(A) -水(B)梯度洗脱(0～10min，35％A；10～15min，35％～44％A；15～25min， 44％A；25～28min，44％～50％A；28～36min，50％A；36～38min，50％～ 56％A；38～46min，56％A；46～64min，56％～74％A；64～72min，74％A)；流速1mL/min；柱温35℃；检测波长为263nm；进样量10μL。

五、根瘤农杆菌F-45胞内、胞外可溶性蛋白质含量测定

1、胞内、胞外可溶性蛋白质含量测定

(1)样品前处理

胞外蛋白质含量测定样品制备：取一定量的发酵菌液，10,000rpm，离心 10min，取上清。

胞内蛋白质含量测定样品制备：取一定量的发酵菌液，10,000rpm，离心 10min，弃上清。得到的菌体沉淀通过10mmol/LTris-HCl缓冲液清洗，10,000 rpm，离心10min，弃上清，重复2～3次。将清洗过的菌体沉淀加入20mL 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，冰浴条件下超声破碎(工作5s，停止10s，共40min)。破碎后，8,000rpm，4℃，离心15min，取上清，4℃保存。

处理样品可用于后续SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳和HMGR酶活测定。

(2)试剂配制

牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，即为1,000μg/mL的原液。

蛋白试剂的配制：考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝 G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％(W/V)的磷酸100mL，定容至 1000mL。

(3)标准曲线的绘制

取6支试管，取标准蛋白液0～0.1mL，用蒸馏水配制成2mL体系，加入 5mL考马斯亮蓝试剂，充分混匀，静置2min。测定并记录OD₅₉₅nm的吸光度，绘制标准曲线。

(4)胞内、胞外可溶性蛋白含量检测

取提取液1mL于试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，静置2min。测定并记录OD₅₉₅nm的吸光度，并计算胞内外分泌蛋白含量。

2、SDS-PAGE法检测F-45胞外蛋白多样性

(1)试剂的配制

分离胶(5mL 12％)：H₂O 1.6mL，30％mix 2mL，1.5M Tris pH＝8.81.3mL， 10％SDS 50μL，10％APS 50μL，TEMED 2μL。

浓缩胶(3mL 5％)：H₂O 2.1mL，30％mix 500μL，1M Tris pH＝6.8 380μL， 10％SDS 30μL，10％APS 30μL，TEMED 3μL。

电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3):称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g， SDS1.0g，用无离子水溶解后定容至1L。

染色液：考马斯亮蓝R-250。

脱色液：取乙醇125mL和冰乙酸75mL定容至500mL。

(2)SDS-PAGE样品前处理

取处理过的待测液5mL，加入4倍体积的甲醇，加入1倍体积的氯仿，再加入3倍体积的双蒸水，涡旋20s或剧烈上下摇动20s，4℃放置30min；

4℃条件下，10,000rpm离心15min，弃去上层相和下层氯仿相，小心收集中间的蛋白沉淀(尽量去除有机溶剂)。

加入2×蛋白Buffer，沸水浴15min，3500rpm，离心3min，取上清进行 SDS-PAGE蛋白电泳。

(3)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

将上述处理样品进行SDS-PAGE电泳，其分离胶浓度为12％。

3、PCR扩增技术鉴定代谢关键酶SQS基因

(1)引物设计

从NCBI网址下载相关农杆菌/根瘤菌的SQS基因中间序列，采用 Megalign4.0软件对高度保守区域序列进行序列分析，并通过16S rRNA确定菌株的系统分类及亲缘关系。利用Primer 5.0软件根据亲缘性设计鲨烯合酶(SQS) 特异性引物。

(2)基因组DNA的抽提

参考Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒(生工试剂盒)说明进行。

(3)模板质量检测

使用微量分光光度计ND 5000测定总DNA的A260nm和A280nm，选择 A260nm/A260nm为1.8～2.0的总DNA进行PCR扩增。

(4)SQS鲨烯合酶基因的克隆及检测

PCR反应体系：ddH₂O 9.5μL；SQS F1(10μmol·L^-1)1μL；SQS R1(10 μmol·L^-1)1μL；Template 1μL；2×taq Master Mix 12.5μL；总体积25μL。

PCR循环条件：95℃预变性3min；94℃变性30s；42℃退火30s；72℃延伸60s；72℃修复延伸10min，35个循环。

琼脂糖凝胶电泳：1.5％琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液，254nm紫外透射光下观察并拍照。

4、关键酶HMGR酶活检测

(1)母液制备

1M Tris-HCl:称取1.2114g的Tris加入8mL的超纯水，滴加盐酸，直至 pH为7.0，滴定至10mL；

1mM乙酰-CoA母液：1mg样品加1mL的超纯水充分溶解后，再加入0.235 mL灭菌超纯水混匀；

7.5mM NADPH母液:10mg样品，加入1mL灭菌超纯水充分溶解后，再加入0.6mL灭菌超纯水混匀；

40mM DTT：10mg样品，加入0.62mL灭菌超纯水充分溶解后，再加入1 mL灭菌超纯水混匀。

(2)样品前处理

10,000rpm，5min离心收集发酵液或胞内提取液，取1mM乙酰-CoA母液至3倍体积的上述样品中，使其终浓度为0.24mM。37℃反应12h，检测HMGR 酶活性。

(3)酶活测定

对照组NADPH的氧化速率(a)：在反应体系(5μL1 M Tris-HCl；1μL7.5 mM NADPH；10μL40 mMDTT)中加入10μL上清液，立即计时，在340nm 处每隔30sec检测NADPH的氧化情况，连续测定5min。

试验组NADPH的氧化速率(b)：在反应体系(5μL1 M Tris-HCl；1μL7.5 mM NADPH；10μL40 mMDTT)中加入10μL添加乙酰-CoA的处理样品后，立即计时，在340nm处每隔30sec检测NADPH的氧化情况，连续测定5min。

(4)酶活计算公式

该酶活计算公式为：

HMGR相对活性(U/mg-protein)＝酶液稀释倍数×△A340×V₁/(ε*d*C*V₂)

式中：△A340＝△A340b-△A340a；

△Ab和△Aa：平均每分钟相对对照组的吸光度变化值；

V₁为反应体系体积(μL)；

ε为NADPH的吸光系数(6.22×10^-6pmol^-1cm^-1)

d为测定光源直径(0.67mm)；

C为蛋白浓度(mg/mL)；

V₂为加入反应体系中的酶液体积(10μL)。

六、菌株产C₂₁甾体类化合物条件优化

采用3因素3水平设计正交实验，其中接种量(0.5％、1％、2％)、pH(6、 7、8)和温度(28℃、32℃、37℃)。并测定发酵液中C₂₁甾体类化合物总含量，确定最优产C₂₁甾体类化合物发酵条件。

效果实施例

一、菌种分离纯化结果

本发明通过菌落颜色，大小，形状等进行对比，从白首乌根、茎、叶中共分离纯化出7株白首乌内生放线菌，编号并保存(如图1所示)。

二、菌种鉴定结果

1、理化指标测定结果

从淀粉水解试验得出，根瘤农杆菌F-45没有产生淀粉酶和利用淀粉的能力；从吲哚试验得出，根瘤农杆菌F-45不能产生色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸；从甲基红试验和糖发酵试验得出根瘤农杆菌F-45不能进行葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖发酵；从不同温度水平生长试验得出，根瘤农杆菌F-45的生长温度范为22～37℃，对环境温度变化的适应性较强。

2、分子鉴定结果

经DNA MAN软件处理菌种核酸序列，在NCBI上比对结果为：F-45为根瘤农杆菌，其系统进化树如图2。

三、白首乌内生放线菌产C₂₁甾体类化合物的测定结果

1、C₂₁甾体类化合物总含量的测定结果

白首乌内生放线菌C₂₁甾体类化合物总含量测定含量变化如图3所示，72 h～144h为白首乌内生放线菌的生长繁殖及产酶积累的过程，144h～216h为白首乌内生放线菌C₂₁甾体类化合物的代谢旺盛期，216h终止发酵后F-45代谢C₂₁甾体类化合物最终含量为0.60±0.05mg/mL。

2、F-45发酵液中C₂₁甾体类化合物的提纯和检测

(1)全波长扫描结果

样品与标准品在263nm附近均存在一个吸收峰，在该特征波长条件下的色谱图杂质峰较少，所以选择263nm作为C₂₁甾体类化合物的检测波长。

(2)高效液相色谱鉴定结果

在色谱条件下，60℃烘干处理过的样品A和真空冷冻干燥处理过的样品B 中的C₂₁甾体类化合物成分达到基线分离，HPLC两个样品都存在明显主峰，峰形尖锐对称，峰面积为100％。

样品A和B在2min-3min内都得到一个明显峰。样品A峰高为12.52mAU，峰面积为433.49mAU*s，峰面积100％；样品B峰高为6.47mAU，峰面积为 225.09mAU*s，峰面积100％(如图4)。两种工艺制备样品HPLC都出现明显峰，且峰数量少，得到的化合物较纯。60℃烘干干燥工艺得到的样品含量相对较高。

四、白首乌内生根瘤农杆菌F-45(中C₂₁甾体类化合物转化途径探究

1、胞内、胞外分泌蛋白质含量测定结果

(1)胞内、胞外分泌可溶性蛋白含量检测结果

对F-45进行胞内、胞外分泌可溶性蛋白含量的检测，检测结果如图5所示，通过考马斯亮蓝法测得胞内蛋白含量为0.355±0.001mg/mL，胞外分泌蛋白含量为0.151±0.001mg/mL。F-45胞内可溶性蛋白含量显著高于胞外可溶性蛋白含量(P<0.05)。结果表明，F-45胞内分泌可溶性蛋白的能力较强，结合代谢产物鉴定结果，推测F-45能合成代谢C₂₁甾体类化合物的关键酶。

2、SDS-PAGE法分析胞外蛋白多样性

通过SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳检测F-45分泌蛋白多样性，检测结果如图6所示，经文献查阅得知，C₂₁甾体类化合物合成代谢关键酶鲨烯合酶(SQS) 的相对分子质量约为46.7kd～47.9kd，HMGR酶的相对分子质量约为63.3 kd～64.3kd。由图6可以看出，F-45胞外蛋白多样性丰富，且在蛋白质分子标准量Marker的第二条带与第三条带(45kd～66.2kd)之间，有明显条带，推测 F-45能够产代谢C₂₁甾体类化合物的两种关键酶。

3、PCR扩增技术鉴定鲨烯合酶基因

(1)同源性分析结果

依次对比5株菌：根瘤农杆菌、葡萄土壤杆菌、放射根瘤菌、悬钩子农杆菌、发根农杆菌相关鲨烯合酶基因的同源性，其结果如图7。通过软件Megalign 分析得出5株有关菌鲨烯合酶基因序列的相关性较低，因此，无法在此基础上设计相关引物。故后续采用5株农杆菌/根瘤菌与F-45的16s序列进行对比，选出亲缘性最高的菌株，直接通过该菌株的鲨烯合酶基因序列设计引物。

(2)菌株亲缘性对比

通过CLUSTL 1.81W和MEGA 4.0程序对5株农杆菌/根瘤菌与F-45的16S rDNA序列进行系统进化分析，其结果如图8所示，通过亲缘性分析得知，F-45 与1-Agrobacteriumtumefaciens的亲缘性较高，故选用1-Agrobacterium tumefaciens的鲨烯合酶序列直接设计引物。

(3)引物设计

根据1-Agrobacterium tumefaciens的鲨烯合酶序列，采用primer 5.0软件设计鲨烯合酶(SQS)特异性引物。引物设计结果为：

上游F1：5’-TTTGCCGCCTATCTTCCC-3’；

下游R1：5’-CCTTTGCCAGCAGCCATT-3’。

(4)模板质量检测

使用微量分光光度ND 5000测定DNA含量为38.926ng/μL，A260 nm/A280 nm＝1.674，符合PCR模板含量及检测浓度要求。

(5)鲨烯合酶SQS基因克隆及检测

F-45提取的总DNA经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，其结果如图9所示，琼脂糖凝胶电泳图的第五条带和第六条带之间(1kbp～750bp)有明显条带。鲨烯合酶SQS基因特异性引物经PCR扩增出目的片段长度为889bp，与文献中涉及的鲨烯合酶SQS基因相应目的片段长度相符。结果表明，从白首乌内生菌中筛出的F-45能够合成代谢C₂₁甾体类化合物的关键酶鲨烯合酶SQS。

4、关键酶HMGR酶活检测结果

F-45胞内、胞外合成代谢C₂₁甾体类化合物的关键酶HMGR酶活测定结果如图10，通过酶活动力学分析，测得F-45胞内酶活为0.0199±0.0010U，胞外酶活为0.0009±0.0010U，胞内HMGR酶活显著高于胞外(P<0.05)。结果表明，F-45能够代谢合成C₂₁甾体类化合物的关键酶HMGR酶，且白首乌内生菌 F-45是通过类异戊二烯生物合成途径(MVA)合成C₂₁甾体类化合物。结合可溶性蛋白含量测定结果及SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析，推测F-45首先在胞内合成大量代谢关键酶HMGR酶，待发酵液中积累一定量底物前体后，向胞外分泌适量代谢关键酶，参与胞外C₂₁甾体类化合物的合成代谢反应。

综上，本发明利用酶学分析、关键酶基因分析、代谢途径分析等手段从白首乌中获得了一株高效代谢C₂₁甾体类化合物的内生菌——根瘤农杆菌F-45。培养条件优化后菌株F-45胞内酶活为0.0199±0.0010U，胞外酶活为 0.0009±0.0010U，胞内HMGR酶活显著高于胞外(P<0.05)。

经基因序列及酶活测定，该菌基因组内含有关键酶鲨烯合酶基因，且关键酶HMGR在胞内酶活达到0.0199±0.0010U，推测该白首乌内生菌是通过类异戊二烯生物合成途径(MVA)合成C₂₁甾体类化合物。

本发明中根瘤农杆菌F-45在高氏一号培养基中，37℃，pH＝7，接种量1％的条件下培养9d生长良好，发酵液中C₂₁甾体类化合物含量显著高于其他菌(P ＜0.05)，为0.60±0.05mg/mL。F-45较其余白首乌内生放线菌代谢更加旺盛，推测其代谢C₂₁甾体类化合物的效果更佳。

因此，根瘤农杆菌F-45是一株高效代谢C₂₁甾体类化合物的内生菌，其遗传性能稳定，环境耐受性强，在代谢C₂₁甾体类化合物方面具有很好的开发利用价值，可为后续的工业化生产提供可靠的菌种资源支撑。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 盐城师范学院

<120> 一种根瘤农杆菌F-45及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggttacctt gttacgactt 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgccgcct atcttccc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctttgccag cagccatt 18

Claims (2)

1.一种根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）F-45，其特征在于，该根瘤农杆菌F-45于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M20211166，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。

2.权利要求1所述的根瘤农杆菌F-45在制备抗癌药物C₂₁甾类化合物中的应用，所述应用为所述根瘤农杆菌F-45代谢合成C₂₁甾体类化合物的关键酶，所述关键酶包括3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶和鲨烯合酶。

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