CN111944782B - 一种阿魏酸酯酶及其在生产阿魏酸中的应用 - Google Patents

一种阿魏酸酯酶及其在生产阿魏酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阿魏酸酯酶及其在生产阿魏酸中的应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的阿魏酸酯酶，此阿魏酸酯酶的比酶活高达519U/g，因此，此阿魏酸酯酶在生产阿魏酸中具有巨大的应用前景。

Description

一种阿魏酸酯酶及其在生产阿魏酸中的应用
技术领域
本发明涉及一种阿魏酸酯酶及其在生产阿魏酸中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
阿魏酸(Ferulic acid，FA)广泛存在于植物细胞壁中，与多糖、纤维素、木质素通过酯键或醚键的形式连接构成细胞壁中复杂的网状骨架结构，以维持细胞壁的完整性，同时降低生物分解率。
阿魏酸是世界上公认的安全抗氧化剂，在日本、美国等国家被列入食品添加剂中。此外，阿魏酸还具有紫外吸收、抗菌消炎、防癌降血脂等作用，在医药、化妆品、造纸等领域均有广泛的应用前景。
目前，生产阿魏酸的方法主要有植物提取法、化学合成法以及生物酶法。其中，植物提取法主要是通过酸碱水解的方式从当归、黄连、米糠、麦麸等植物中提取分离天然阿魏酸，但是，由于酸碱水解法会引起细胞壁中其他化学成分的改变，因此，使用此方法生产阿魏酸会破坏植物内其他高价值化学成分，同时，由于酸碱水解法生产阿魏酸的副产物多，产物分离困难，并且，使用此方法生产阿魏酸能耗大、污染环境。化学合成法主要是以香草醛为基原料通过一系列有机反应生产阿魏酸，但是，由于产物中掺杂顺式阿魏酸，使用此方法生产阿魏酸会使分离成本增加，并且，使用此方法生产得到的阿魏酸无法直接作为医药原料使用，另外，使用此方法生产阿魏酸还具有反应时间长、对环境污染严重等缺陷。
生物酶法主要是通过将阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase，Ferulic acidesterase，FAE，E.C.3.1.1.73)添加至含有阿魏酸酯类化合物的反应体系中进行反应以生产阿魏酸，与生物提取法、酸碱水解法以及化学合成法相比，使用生物酶法生产阿魏酸具有反应条件温和、专一性高、对环境友好等优点，这些优点使得生物酶法成为生产阿魏酸的研究热点。但是，由于现有的阿魏酸酯酶比酶活较低，例如，文献“曹艳,夏其乐,陈剑兵,等.1株阿魏酸酯酶产生菌的筛选鉴定及发酵条件优化[J].微生物学杂志,2019，(5)：8-15.”中，来源于溜曲霉的阿魏酸酯酶的比酶活仅有231.34U/g，这大大限制了使用生物酶法生产阿魏酸的工业化进程。
因此，急需找到一种比酶活高的阿魏酸酯酶。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种比酶活高的阿魏酸酯酶(Feruloylesterase，Ferulic acid esterase，FAE，E.C.3.1.1.73)。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种阿魏酸酯酶，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述阿魏酸酯酶。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pMA5质粒或pUB质粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。
本发明还提供了一种生产阿魏酸的方法，所述方法为先将上述阿魏酸酯酶添加至含有阿魏酸酯类化合物的反应体系中进行反应，得到反应液，然后从反应液中分离得到阿魏酸。
在本发明的一种实施方式中，所述阿魏酸酯类化合物为阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯。
本发明还提供了上述阿魏酸酯酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在生产阿魏酸中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的阿魏酸酯酶，此阿魏酸酯酶的比酶活高达519U/g，因此，此阿魏酸酯酶在生产阿魏酸中具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001，分类学命名为Bacilluspumilus，已于2020年8月14日保藏于中国典藏培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020421，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001的菌落形态。
图2：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001的菌体形态。
图3：阿魏酸标准品的高效液相色谱图。
图4：阿魏酸甲酯标准品的高效液相色谱图。
图5：反应液的高效液相色谱图。
图6：反应液的LC-MS图。
图7：蛋白浓度标准曲线。
图8：反应液中阿魏酸的产量。
具体实施方式
下述实施例中涉及的阿魏酸标准品购自北京百灵威科技有限公司；下述实施例中涉及的阿魏酸甲酯购自阿法埃莎(中国)化学有限公司；下述实施例中涉及的牛白蛋白和考马斯亮蓝G-250购自上海国药集团化学试剂有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
菌株分离培养基：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂15g/L，pH自然。
筛选固体培养基：使用0.22μm的滤膜过滤含有100mg/L阿魏酸乙酯的N,N-二甲基甲酰胺溶液，得到阿魏酸乙酯溶液；将经灭菌的基础培养基冷却至60℃后，向基础培养基中添加10％(v/v)的阿魏酸乙酯溶液，摇匀至呈均匀的乳白色溶液；
其中，基础培养基：NaNO32 g/L、K2HPO4·3H2O 1g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、琼脂15g/L，pH自然。
种子培养基：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L，pH自然。
基础发酵培养基：麦麸20g/L、NaNO32 g/L、K2HPO4·3H2O 1g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH自然。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH自然。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L。
实施例1：短小芽孢杆菌SK52.001的获取
具体步骤如下：
1、短小芽孢杆菌SK52.001的分离纯化
以来源于江苏省无锡市贡湖湾湿地地区的土壤为样本，取1.0g样本放入10mL装入玻璃珠的无菌水中，于30℃，200r/min摇床振荡30min，使菌体充分分离，得到混合菌液；吸取0.5mL混合菌液在无菌环境下加入装有4.5mL生理盐水的10mL离心管中，得到10-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；分别吸取100μL稀释梯度为10-3、10-4、10-5、10-6稀释液涂布于菌株分离培养基上，于30℃恒温培养箱中倒置培养24～48h，得到稀释涂布平板；挑取稀释涂布平板上的单菌落在筛选固体培养基上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养24h，得到单菌落；观察单菌落周围是否有透明圈出现，筛选周围有透明圈的单菌落；此次共筛得一个单菌落，将与此单菌落对应的菌株命名为SK52.001。
2、短小芽孢杆菌SK52.001的鉴定
提取菌株SK52.001的基因组，将菌株SK52.001的16S rDNA进行扩增和测序(由天一辉远生物科技有限公司完成)，将测序分析得到的菌株SK52.001的16S rDNA序列(SK52.001的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)在GenBank中进行比对，结果显示此菌株确为短小芽孢杆菌，命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001。
3、短小芽孢杆菌SK52.001的观察
蘸取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001的菌液在LB固体培养基上划线，于30℃恒温培养箱倒置培养12h，得到单菌落；挑取单菌落接种至LB液体培养基中于30℃、200r/min的摇床上培养12h，得到菌液；将菌液用无菌水稀释100倍后涂布于LB固体培养基上，于30℃培养箱中培养18h后观察到菌落形态(菌落形态见图1)；将菌液用无菌水稀释20倍后在光学显微镜下观察到菌体形态(菌体形态见图2)。
由图1可知，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001的菌落形态为：圆形，较薄，中间呈浅黄色，边缘微白，表面黏稠湿润，边缘凹凸不整齐。
由图2可知，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001的菌体形态为：短杆状，两端钝圆，具有典型的芽孢杆菌的形态特征，属于革兰氏阳性菌。
实施例2：阿魏酸酯酶的生产
具体步骤如下：
挑取实施例1获得的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001的单菌落接种至种子培养基中，于30℃、200r/min的摇床中培养18h，得到种子液；将种子液按照5％(v/v)的接种量接种至基础发酵培养基中，于30℃、200r/min的摇床中发酵26h，得到发酵液。
将发酵液于4℃、10000rpm下离心10min，获得粗酶液；测定粗酶液中阿魏酸酯酶的酶活，测定方法如下：
将250μL粗酶液添加至750μL浓度为0.003mol/L的阿魏酸甲酯溶液(阿魏酸甲酯溶液是通过将阿魏酸甲酯溶于pH为8.0、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中获得的)，得到酶反应体系；将酶反应体系于50℃水浴锅中反应30min后，先用沸水灭酶10min，然后经0.22μm膜过滤，得到反应液；以灭酶后的粗酶液为空白对照，采用HPLC法(高效液相色谱法)测定反应液中阿魏酸浓度；将阿魏酸浓度代入阿魏酸酯酶活力计算公式中，得到粗酶液中阿魏酸酯酶的酶活；
其中，阿魏酸酯酶酶活的定义为：在50℃下，每分钟分解阿魏酸甲酯生成1μmol阿魏酸所需要的酶量为1个酶活力单位(1U)；
阿魏酸酯酶活力计算公式如下：
Figure BDA0002659096250000041
阿魏酸标准品的高效液相色谱图见图3，阿魏酸甲酯标准品的高效液相色谱图见图4，反应液的高效液相色谱图见图5，阿魏酸浓度根据高效液相色谱图中的峰面积Y与阿魏酸浓度X之间的线性关系Y＝52514X-80.417(R2＝0.9996)计算而得；
HPLC法采用Agilent 1200型高效液相色谱仪；色谱柱为ZORBAX Eclipse PlusC18(Agilent，4.6mm×150mm，3.5μm)；紫外检测器；流动相A：1％(v/v)的乙酸溶液，流动相B：甲醇；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长320nm，梯度洗脱程序如表1所示。
检测结果为：粗酶液中阿魏酸酯酶的酶活为195U/L。
为进一步证明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001可产阿魏酸酯酶，将反应液LC-MS分析(分析结果见图6)。
由图6可知，产物峰相对丰度最高的碎片m/z＝193，而目标产物的相对分子质量为194，与阿魏酸单体的相对分子量一致。
表1洗脱程序
时间/min A相/％ B相/％
0 90 10
0.23 70 30
1.66 50 50
4.97 0 100
5.57 85 15
7.52 90 10
7.60 90 10
实施例3：阿魏酸酯酶的生产
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将基础发酵培养基分别替换为发酵培养基A～E，得到发酵液A～E；
其中，发酵培养基A：小麦麸皮45g/L、胰蛋白胨5g/L、K2HPO4·3H2O 1.0g/L、KCl0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH 6.0；
发酵培养基B：去淀粉小麦麸皮10g/L、NaNO32 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0g/L、KCl0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH自然；去淀粉小麦麸皮的处理方法为：用浓度为0.3％(w/w)的醋酸钾溶液浸泡小麦麸皮，得到混合物；将混合物在95℃水浴1h并不断搅拌后，使用去离子水反复冲洗至淀粉完全去除，于105℃下烘干至恒重备用；
发酵培养液C：小麦麸皮10g/L、NaNO32 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH自然；
发酵培养液D：小麦麸皮45g/L、NaNO32 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH自然。
发酵培养液E：小麦麸皮45g/L、酵母提取物5g/L、K2HPO4·3H2O 1.0g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH自然。
将发酵液A～E分别于4℃、10000rpm下离心10min，获得粗酶液A～E；测定粗酶液A～E中阿魏酸酯酶的酶活，测定结果为：粗酶液A～E中阿魏酸酯酶的酶活分别为421U/L、73U/L、102U/L、241U/L、344U/L。可见，使用发酵培养基A时，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)SK52.001产阿魏酸酯酶的产量最高。
实施例4：阿魏酸酯酶的性能
具体步骤如下：
测定粗酶液A中阿魏酸酯酶的比酶活，测定方法如下：
称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90％(v/v)乙醇中后，加入100mL 85％(v/v)磷酸，并用蒸馏水定容至1L，得到考马斯亮蓝G-250染液；称取100mg牛白蛋白溶解，并用蒸馏水定容至100mL，得到标准蛋白溶液；分别吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL标准蛋白溶液分别加入1.0、0.98、0.96、0.94、0.92、0.90mL蒸馏水中后，分别加入5mL考马斯亮蓝G-250染液混合均匀，得到混合液；将混合液于25℃下反应2min，得到反应液；将反应液于595nm波长下测定吸光度，并绘制蛋白浓度标准曲线(标准曲线见图7)。
取100μL实施例2获得的粗酶液A，用蒸馏水定容至1mL，得到稀释液；在稀释液中加入5mL考马斯亮蓝G-250染液混合均匀，得到混合液；将混合液于25℃下反应2min，得到反应液；将反应液于595nm波长下测定吸光度；根据测得的吸光度和蛋白浓度标准曲线，计算得到粗酶液A中的蛋白浓度，并根据粗酶液A中的蛋白浓度，计算得到粗酶液A中阿魏酸酯酶的比酶活；
其中，阿魏酸酯酶的比酶活的计算公式如下：
Figure BDA0002659096250000061
检测结果为：粗酶液A中的蛋白浓度为0.81mg/mL、粗酶液A中阿魏酸酯酶的比酶活519U/g。
通过PCR从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001基因组中扩增出阿魏酸酯酶的基因并进行测序，测序结果为：粗酶液A中的阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码粗酶液A中的阿魏酸酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例5：阿魏酸的生产
具体步骤如下：
挑取实施例1获得的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SK52.001的单菌落接种至种子培养基中，于30℃、200r/min的摇床中培养18h，得到种子液；将种子液按照5％(v/v)的接种量接种至基础发酵培养基中，于30℃、200r/min的摇床中发酵40h，得到发酵液；发酵过程中，不断对发酵液取样；将取样的发酵液于4℃、10000rpm下离心10min，获得粗酶液；将250μL粗酶液添加至750μL浓度为0.003mol/L的阿魏酸甲酯溶液(阿魏酸甲酯溶液是通过将阿魏酸甲酯溶于pH为8.0、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中获得的)，得到酶反应体系；将酶反应体系于50℃水浴锅中反应30min，得到反应液。
测定反应液中阿魏酸的产量(检测结果见图8)；
其中，反应液中阿魏酸的产量的检测方法为：
将反应液先用沸水灭酶10min，然后经0.22μm膜过滤，最后以灭酶后的粗酶液为空白对照，采用HPLC法(高效液相色谱法)测定反应液中阿魏酸浓度；
HPLC法采用Agilent 1200型高效液相色谱仪；色谱柱为ZORBAX Eclipse PlusC18(Agilent，4.6mm×150mm，3.5μm)；紫外检测器；流动相A：1％(v/v)的乙酸溶液，流动相B：甲醇；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长320nm，梯度洗脱程序如表1所示。
如图8所示，发酵26h粗酶液，反应30min后，阿魏酸常量为280mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种阿魏酸酯酶及其在生产阿魏酸中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> 短小芽孢杆菌
<400> 1
tgcaagtcga gcgaacagaa gggagcttgc tcccggatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
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atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac 960
cctagagata gggctttccc ttcggggaca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcatttag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200
aaagggctgc gagaccgcaa ggtttagcca atcccataaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc ttta 1404
<210> 2
<211> 297
<212> PRT
<213> 短小芽孢杆菌
<400> 2
Met Asn Leu Gln Glu Gln Ile Lys Ile Ala Ala Ser Leu Arg Gln Pro
1 5 10 15
Ala Glu Gly Ser Leu Pro Ser Gln Ser Glu Leu Lys Pro Val His Pro
20 25 30
Pro Glu Val Asn Lys Met Glu Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Ala Gly Glu
35 40 45
Thr Lys Val Trp Ile Phe Lys Pro Val Asn Thr Ser Lys Gln Pro Leu
50 55 60
Pro Val Phe Val Asn Leu His Gly Gly Gly Phe Ile Leu Gly Ser Ala
65 70 75 80
Glu Met Asp Asn His Trp Cys Pro Val Ile Ala Asp Arg Ala Gln Cys
85 90 95
Ile Val Val Asn Val Glu Tyr Gln Leu Ala Pro Glu His Pro Phe Pro
100 105 110
Ala Ala Leu His Glu Cys Tyr Asp Val Leu Lys Trp Leu Tyr Glu His
115 120 125
Pro Asp Glu Leu Gln Ile Asp Pro Asn Arg Val Ala Ile Gly Gly His
130 135 140
Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala Thr Ala Ala Cys Leu Leu Asn Ile Gln
145 150 155 160
Lys Gly Asn Pro Val Pro Ile Val Tyr Gln Val Leu Asp Tyr Pro Pro
165 170 175
Leu Asp Leu Ala Thr Asp Pro Ala Glu Lys Pro Ala Phe Glu Glu Ala
180 185 190
Ile Pro Val Glu Met Ala Arg Leu Phe Asn Ala Phe Tyr Leu Gln Gly
195 200 205
Gln Asp Pro His Asn Pro Leu Val Ser Pro Ile Phe Ala Asp Arg Ser
210 215 220
Ser Leu Ala Gln Leu Pro Pro Ala Leu Val Ile Thr Ala Glu Arg Asp
225 230 235 240
Ser Leu Ala Gln Glu Ala Glu Gln Tyr Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ala
245 250 255
Gly Val Asp Val Thr Tyr Arg Gln Phe Lys Gly Val Pro His Ala Phe
260 265 270
Thr His Ala Gly Asp Leu Glu Ile Ala Glu Glu Ala Trp His Leu Met
275 280 285
Ser Asp Gln Leu Lys Lys Ala Phe Glu
290 295
<210> 3
<211> 894
<212> DNA
<213> 短小芽孢杆菌
<400> 3
atgaacttac aagagcaaat caaaatcgct gcgtcattac gtcaaccggc tgaaggttca 60
ttaccgagtc aatcggaact aaaaccagtc catcctcccg aagtgaacaa aatggaatat 120
gacattccaa caagtgctgg cgaaacaaag gtatggatat ttaagccggt caacacatca 180
aagcagccgc ttcccgtttt tgtgaattta catggcggag gatttatcct aggcagtgct 240
gaaatggata accactggtg tccggtcatt gcagaccgag cgcaatgtat cgtcgtcaat 300
gtcgagtatc agcttgcccc agagcaccct tttccagcag ctcttcatga atgctacgat 360
gtgctgaagt ggctgtatga acaccctgat gagcttcaaa tagatcctaa tagagtagcc 420
attggcggac atagtgcagg aggaaacttg gcaacggctg cttgtctctt aaatattcaa 480
aaagggaacc cagtcccgat tgtctatcaa gtgcttgatt atccgccgct tgatttagcc 540
actgatccag cagaaaagcc agcatttgaa gaagcgatcc cagttgaaat ggcgaggctc 600
tttaatgcct tctatctgca aggccaagat ccgcacaatc cgctcgtttc tccaatcttt 660
gccgatcgtt catccttggc tcaactgcca ccagctctcg ttatcacagc tgaaagagat 720
tcgctagctc aagaagccga acaatatgcg gagaagttaa aagaagcagg ggtagatgtc 780
acgtacagac agtttaaagg agtccctcac gccttcacgc atgctggaga tttagaaata 840
gctgaagaag cttggcatct gatgagtgat caattgaaaa aggcatttga ataa 894

Claims (10)

1.一种阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的阿魏酸酯酶。
3.如权利要求2所述的一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2或3所述的基因。
5.如权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pMA5质粒或pUB质粒。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2或3所述的基因或权利要求4或5所述的重组质粒。
7.如权利要求6所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。
8.一种生产阿魏酸的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的阿魏酸酯酶添加至含有阿魏酸酯类化合物的反应体系中进行反应，得到反应液，然后从反应液中分离得到阿魏酸。
9.如权利要求8所述的一种生产阿魏酸的方法，其特征在于，所述阿魏酸酯类化合物为阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯。
10.权利要求1所述的阿魏酸酯酶或权利要求2或3所述的基因或权利要求4或5所述的重组质粒或权利要求6或7所述的宿主细胞或权利要求8或9所述的方法在生产阿魏酸中的应用。
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