CN114561304B - 一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺 - Google Patents

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CN114561304B CN202210063233.0A CN202210063233A CN114561304B CN 114561304 B CN114561304 B CN 114561304B CN 202210063233 A CN202210063233 A CN 202210063233A CN 114561304 B CN114561304 B CN 114561304B
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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及到一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺。本申请的一种红法夫酵母菌株，命名为红法夫酵母菌株(Xanthophyllomyces dendrorhous/Phaffia rhodozyma)，于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2020413。本发明的红法夫酵母发酵生物量干重达到110g/L，虾青素发酵产量达到600mg/L以上，虾青素含量达到5.00mg/g以上，实现红法夫酵母产业化生产虾青素，大幅超过了目前同类菌株的虾青素产量，也逐渐拉近了与基因工程菌的产量差距。本发明的红法夫酵母菌株可广泛应用于动物饲料添加剂、食品添加剂、保健品等领域。

Description

一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及到一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)，又名虾黄素，是一种萜类不饱和化合物，其化学式为3,3'-二羟基-β,β-胡萝卜素-4,4'-二酮，分子式为C40H52O4，虾青素分子中碳原子共轭双键链的两端有不饱和羰基和羟基构成的α-羟基酮结构，而α-羟基酮结构具有非常活泼的电子效应，虾青素特殊的分子结构使其具有抗氧化、增强免疫、抗癌变、保护神经和心血管等生理功能；虾青素通过淬灭单线态氧、清除过氧自由基等方式阻断链式反应，抑制脂质过氧化来保护膜结构，从而起到防止氧化损伤的效果。
目前虾青素的来源主要有化学合成法、水产品加工废弃物提取和微生物高密度培养。虾青素的化学合成过程极为复杂，目前全球仅有几家企业能够自主合成并工业化生产虾青素，但在结构、功能与应用及安全性方面与天然虾青素有显著差异，化学合成的虾青素应用范围受到严格限制，尤其在食品与膳食补充剂中禁止使用。水产品加工废弃物主要来自甲壳类水产品的废弃物，由于甲壳中虾青素的含量很低，且灰分和几丁质含量较高，这在很大程度上限制了虾青素的提取效率。微生物高密度培养主要有雨生红球藻和红法夫酵母两种天然虾青素来源，前者虽然虾青素含量高，但是藻细胞生长缓慢、培养周期漫长且虾青素只能在逆境条件的胁迫下合成，在正常的生长环境下几乎不合成虾青素；需要光照而且占地面积庞大，最重要的是难以控制微生物污染藻体。红法夫酵母具备生长速度快、培养周期短、无需光照、能在发酵罐中实现高密度培养而且不限地域和气候限制，还能够利用多种糖质类作为碳源，如葡萄糖、蔗糖、纤维二糖等进行快速异养培养，但虾青素产量较低，是限制其规模化生产的重要因素。红法夫酵母胞内合成的虾青素占总类胡萝卜素的40％～95％，被认为是最具潜力实现工业化生产虾青素的微生物。
基于目前制约工业化发酵生产虾青素的因素诸，诸如虾青素产量低，生产成本居高不下，发酵工艺较复杂，许多国内公司和研究机构主要围绕菌株和工艺进行攻关。如专利号CN109971664A利用酿酒酵母构建整合了有香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因crtE，八氢番茄红素合成酶基因crtYB，八氢番茄红素脱氢酶基因crtI和β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ以及β-胡萝卜素酮化酶基因crtW的菌株，经等离子体诱变、SCRaMbLE诱变，获得一株高产的诱变菌株AS30，摇瓶发酵的虾青素产量为46.4mg/L，较出发菌株提高11.5倍。
专利号CN110195023A在前期工作基础之上，采用浓度梯度递减的间歇补料方式向发酵罐培养基中补加酵母浸粉，在5L发酵罐中获得404.78mg/L的虾青素产量。
专利号CN111979132A通过优化发酵培养基成分，去除了常规发酵培养基中所添加的锌离子，并添加铁离子和优化其浓度，大幅提高了虾青素产量和虾青素纯度，在30L发酵罐的酿酒酵母虾青素产量最高达1530mg/L。
专利号CN104178430A用亚硝基胍进行诱变，通过摇瓶发酵筛选获虾青素产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株VR-032。该菌株利用蔗糖为发酵碳源，在5L发酵罐中虾青素产量达到68.7mg/L，相比原始出发菌株提高了20.8％。
专利号CN106801019B从落叶上筛选到的自然菌株红法夫酵母XQ(Phaffiarhodozyma XQ)，其虾青素产量为55.77mg/L；申请人进一步通过紫外诱变和2-脱氧-D-葡萄糖筛选获得的突变菌株红法夫酵母XQS，其虾青素产量达78.42mg/L，比出发菌株红法夫酵母XQ提高了40.6％。
专利号CN108998493B在高产虾青素的发酵培养基中添加中药膏剂防风、黄芪、大黄、杏鲍菇、连翘，红法夫酵母繁殖对数期再添加6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、β-萘氧乙酸，有效的提高了红法夫酵母的细胞活性，改善糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速酵母细胞生长与繁殖，在发酵罐中获得120.6mg/L的虾青素产量。
专利号CN106318878B通过代谢工程方法，提高红法夫酵母胞内乙酰辅酶A合成，降低甾醇类物质合成以及提高虾青素合成途径代谢通量的基因元件表达盒转化宿主，获得红法夫酵母工程菌株SXD，所获得的红法夫酵母工程菌株SXD的最高虾青素含量为4.4mg/g细胞干重，优化培养后的虾青素含量为7.1mg/g。
专利号CN106676019B利用已经构建好能够生物合成虾青素的模式生物解脂耶氏酵母，优化培养后在发酵罐获得450mg/L的虾青素产量。袁雪峰利用中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室构建、筛选的基因工程菌E.coli-LY01，通过对发酵过程中pH、温度、诱导剂添加量和补糖方法的优化，建立了一套大肠杆菌高密度发酵工艺，在1L发酵罐中实现了958mg/L的虾青素产量，虾青素含量为17.2mg/g。
然而这些发酵液虾青素产量能做到400mg/L以上的，几乎是利用基因工程进行改造的模式菌株，这些菌株并非能够天然自身合成虾青素。因此，大规模的工业化生产暂时未见报道。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种红法夫酵母菌株，命名为红法夫酵母菌株(Xanthophyllomyces dendrorhous/Phaffia rhodozyma)，于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2020413。
一种提升如上述的红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、摇瓶种子液制备：将事先从甘油管到固体平板活化好的菌株刮取到灭菌的摇瓶种子培养基中，并在转速150～200rpm，温度20～24℃条件下培养24～28h，获得摇瓶种子液；
S2、一级种子液制备：将步骤S1摇瓶种子液按3％～10％接种到一级种子罐中，并在转速150～200rpm，温度20～22℃，通气量0.6～1.8Nm3/h条件下培养22～26h，获得一级种子液；
S3、发酵培养：将步骤S2中一级种子液生长到特定菌数与菌体形态时，按3％～10％体积接种量转接入含有发酵培养基的发酵罐中，开启搅拌，转速200～300rpm，通气量2.4-2000Nm3/h，开始发酵；发酵至一段时间后往发酵罐中流加前体物，直到溶氧低于预设区间时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。
进一步的，摇瓶种子培养基包括以下质量浓度的组分：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，pH6.0；所述一级种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸铵6g/L，蔗糖6g/L，MgSO4·7H2O 2.2g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 0.09g/L，聚醚消泡剂0.5g/L，pH6.0。
进一步的，步骤S3中前体物包括八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、海胆烯酮、3(或3')-羟基海胆酮、玉米黄素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质中的一种或两种；且所述前体物用油、水、乙醇中的一种或两种溶剂进行溶解，其浓度为10～300g/L。
进一步的，步骤S3发酵前期以柠檬酸和氨水维持pH稳定在6.0左右；发酵至18～22h，溶氧降至低点时，逐步提高发酵罐搅拌转速与通气量，使发酵罐内溶氧维持在25％左右，每天检测四次发酵液葡萄糖浓度，以54％葡萄糖浓缩液补料维持罐内发酵液残余葡萄糖浓度在1～3g/L；60～64h后逐步降低发酵罐搅拌转速，使罐内溶氧维持在40～60％，在72～84h，待菌体干重达到稳定时，将发酵罐的pH均调节至5.0左右，直至发酵结束。
进一步的，前体物初次的流加时间在菌体的对数生长末期，优选为48～72h；所述前体物后续的多次流加均与溶氧参数进行关联，当溶氧上升到40～60％时，触发流加程序，前体物以低流量进行流加，直到溶氧低于30％时停止流加。
进一步的，发酵培养基包括以下质量浓度的组分：酵母浸粉6g/L，蔗糖3.0g/L，柠檬酸钠2.5g/L，谷氨酸钠1.0g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L，KH2PO4 1.0g/L，CaCl2 0.045g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，CuSO4·5H2O 0.0125g/L，MnSO4·H2O 0.425mg/L，CoSO4·7H2O 3mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，KCl 2.5mg/L，H3BO3 0.155mg/L，泛酸钙1.25mg/L，生物素0.025mg/L，VB12 0.5mg/L，VB1 0.5mg/L，聚醚消泡剂0.25g/L，体积分数0.1～1％植物油。
进一步的，植物油包括玉米油、芝麻油、大豆油、橄榄油、花生油中的一种或多种。
进一步的，还包括二级种子液制备：将所述一级种子液按3％～10％接种到含有二级种子培养基的二级种子罐中，并在150～200rpm，温度20～22℃，通气量10～20Nm3/h条件下培养22～24h，获得二级种子液；其中，二级种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸铵6g/L，蔗糖6g/L，MgSO4·7H2O 2.2g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl20.09g/L，聚醚消泡剂0.5g/L，pH6.0。
进一步的，还包括三级种子液制备：将所述二级种子液按3％～10％接种到含有三级种子培养基的三级种子罐中，并在150～200rpm，温度20～22℃，通气量120～180Nm3/h条件下培养20～22h，获得三级种子液；其中，三级种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸铵6g/L，蔗糖6g/L，MgSO4·7H2O 2.2g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl20.09g/L，聚醚消泡剂0.5g/L，pH6.0。
由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明的一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺具有以下有益效果：
1、生物量优势明显，本发明的基础培养基通过合适的葡萄糖补料工艺即可达到110g/L的菌体干重，远超过目前同类菌株60～70g/L的干重水平。
2、在菌体发酵周期内，通过补加合适的前体物，再匹配优化后的发酵工艺，有效的促进了菌体虾青素的积累，虾青素产量达600mg/L以上，大幅超过了目前同类菌株的虾青素产量，也逐渐拉近了与基因工程菌的产量差距。
3、得益于生物量和虾青素产量两者大度提升，可以获取更多红法夫酵母菌体和虾青素，使得单位生产成本降低。
附图说明
图1为本发明优选实施例一中50L三联罐对照组501#的发酵结果图；
图2为本发明优选实施例一中50L三联罐实验组502#的发酵结果图；
图3为本发明优选实施例一中50L三联罐实验组503#的发酵结果图；
图4为本发明优选实施例二中5m3发酵罐的发酵结果图；
图5为本发明优选实施例三中60m3发酵罐的发酵结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例一
50L三联罐工艺优化
首先，称取葡萄糖200g，酵母浸粉120g，蔗糖60g，硫酸铵60g，MgSO4·7H2O 22g，KH2PO4 20g，CaCl2 0.9g，溶解后加入20L种子罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂5g，灭菌后调节pH 6.0。再将摇瓶种子1L接种到20L种子罐内，通气量0.72Nm3/h，温度22℃，转速200rpm，酸碱补料以柠檬酸和氨水维持整个种子培养周期pH稳定在6.0，培养22～26h后即可获得一级种子液。
其次，配置50L三联罐的发酵培养基，称取酵母浸粉300g，(NH4)2SO4 150g，蔗糖150g，柠檬酸钠125g，谷氨酸钠50g，MgSO4·7H2O 55g，KH2PO450g，CaCl2 2.25g，ZnSO4·7H2O0.5g，CuSO4·5H2O 0.625g，MnSO4·H2O 21.25mg，CoSO4·7H2O 150mg，Na2MoO4·2H2O 5mg，KCl 125mg，H3BO3 7.75mg，泛酸钙62.5mg，生物素1.25mg，VB12 25mg，VB1 25mg，溶解后加入50L发酵罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂12.5g，灭菌后调节pH 6.0，温度22℃。
其中，(NH4)2SO4，MgSO4·7H2O，KH2PO4，CaCl2，ZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，MnSO4·H2O，CoSO4·7H2O，Na2MoO4·2H2O，KCl，H3BO3，泛酸钙，生物素，VB12，VB1在使用过程中尽量逐个单独溶解后再加入培养基中，避免发生沉淀，影响菌株对其利用效率。而植物油的添加量为发酵液体积分数的0.1～1％，优选为0.5％，其次，植物油优选为玉米油、芝麻油、大豆油、橄榄油和花生油，最优选为玉米油，因玉米油含有部分玉米黄素以及丰富的甾醇与脂肪酸，玉米黄素是虾青素生物合成路径中的近末端产物，而甾醇和脂肪酸是红法夫酵母生长过程中所需合成的产物，该产物的合成起始于乙酰辅酶A，而虾青素合成路径上游的萜类骨架合成亦是起始于糖酵解后的乙酰辅酶A，意味着甾醇、脂肪与虾青素的合成同时竞争乙酰辅酶A，从而造成碳代谢通量不足，玉米油中丰富的甾醇与脂肪酸进入菌体后有效的降低了甾醇和脂肪合成路径对乙酰辅酶A的需求，继而增加了乙酰辅酶A流入萜类骨架合成的通量，最终促进菌体虾青素的积累；同时玉米油的添加在一定程度上抑制了红法夫酵母发酵周期内泡沫的产生，同时也降低了聚醚消泡剂的使用量，减少聚醚消泡剂对红法夫酵母菌体生长和虾青素积累的影响。
最后，待一级种子生长到特定菌数与菌体形态时，将培养好的一级种子按3％～10％体积接种量，等量分别移转接入到三个50L发酵罐501#、502#、503#。其中501#为对照组，502#在501#基础上流加前体物，503#在502#的基础之上加入0.1～1％体积分数的植物油，三联罐均开启搅拌250rpm，通气量2.4Nm3/h，将溶氧校准100％，随后均将搅拌设置为200rpm，通气量调整为1.8Nm3/h，开始发酵；发酵至一段时间后往发酵罐中流加前体物，直到溶氧低于预设区间时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。
其中，前体物为虾青素生物合成路径中的中间代谢产物，在发酵过程中添加前体物，菌体吸收后，有利于增加其胞内虾青素生物合成路径中的该前体物的代谢通量，进而作为酶促生化反应的底物生成该路径的下一级产物，依次类推，最终会促进该路径的终端产物虾青素的合成；其包括八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、海胆烯酮、3(或3')-羟基海胆酮、玉米黄素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质其中的一种或两种，优选为角黄素和β-胡萝卜素和玉米黄素，最优选为β-胡萝卜素；且前体物可以用油、水、乙醇中的一种或两种溶剂进行溶解，优选为水和乙醇的混合液进行溶解；流加前体物的浓度为10～300g/L，优选为30～200g/L，最优选为50g/L；同时前体物初次的流加时间是在菌体的对数生长末期，优选为48～72h，前体物后续的多次流加均需与溶氧参数进行关联。
同时发酵至16～18h，溶氧降至低点时，三联罐均需逐步提高搅拌转速与通气量，使发酵罐内溶氧维持在20％左右，每天检测两次发酵液葡萄糖浓度，以54％葡萄糖浓缩液补料维持罐内发酵液残余葡萄糖浓度在1～3g/L；因葡萄糖是红法夫酵母生长与虾青素积累的重要碳源，为避免发生美拉德反应，发酵工艺中的发酵罐步骤所需的葡萄糖采用单独分消制成50％～55％葡萄糖浓缩液，培养基灭菌后再加入分消完成的葡萄糖浓缩液至所需特定浓度，特定葡萄糖浓度为30～60g/L。
发酵至60～64h后逐步降低发酵罐搅拌转速，使罐内溶氧维持在40～50％，在72～84h，待菌体干重达到稳定时，将pH调节至4.0～5.0，优选为72h，将发酵罐的pH均调节至5.0左右，而在此之前酸碱补料以柠檬酸和氨水维持发酵前期的pH稳定在6.0左右，直至发酵结束。
发酵在60～72h，第一次对502#和503#发酵罐流加前体物，前体物后续的多次流加均与溶氧参数进行关联，当溶氧上升到特定数值区间40～50％时，触发流加程序，前体物以低流量进行流加，如此循环，直到溶氧低于该区间20％时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。
通过上述发酵工艺，其检测结果如图1-3所示，其中图1为50L三联罐的对照组501#，发酵175h后可获得108.2g/L菌体干重，423.13mg/L虾青素产量，3.91mg/g虾青素含量；
图2为50L三联罐的实验组502#，发酵175h后可获得109.6g/L菌体干重，566.27mg/L虾青素产量，5.17mg/g虾青素含量；
图3为50L三联罐的实验组503#，发酵175h后可获得110.5g/L菌体干重，635.75mg/L虾青素产量，5.75mg/g虾青素含量。
实施例二
5m3罐发酵工艺
首先，称取葡萄糖500g，酵母浸粉300g，蔗糖150g，硫酸铵150g，MgSO4·7H2O 55g，KH2PO4 50g，CaCl2 2.25g，溶解后加入50L种子罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂12.5g，灭菌后调节pH 6.0。再将红法夫酵母的茄瓶种子洗脱液1L接种到50L种子罐内，通气量1.80Nm3/h，温度22℃，转速200rpm，酸碱补料以柠檬酸和氨水维持整个种子培养周期pH稳定在6.0，培养22～26h后即可获得一级种子液。
其次，称取葡萄糖5000g，酵母浸粉3000g，蔗糖1500g，硫酸铵1500g，MgSO4·7H2O550g，KH2PO4 500g，CaCl2 22.5g，溶解后加入500L种子罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂125g，灭菌后调节pH 6.0。待一级种子生长到特定的菌数与菌体形态时，将一级种子全部转入500L种子罐，通气量18Nm3/h，温度22℃，转速150rpm，酸碱补料以柠檬酸和氨水维持整个种子培养周期pH稳定在6.0，培养22～24h后即可获得二级种子液。
再次，配置5m3罐的发酵培养基，称取酵母浸粉30kg，(NH4)2SO4 15kg，蔗糖15kg，柠檬酸钠12.5kg，谷氨酸钠5kg，MgSO4·7H2O 5.5kg，KH2PO4 5kg，CaCl2 225g，ZnSO4·7H2O50g，CuSO4·5H2O 62.5g，MnSO4·H2O 2.125g，CoSO4·7H2O 15g，Na2MoO4·2H2O 0.5g，KCl12.5g，H3BO3 0.775g，泛酸钙6.25g，生物素0.125g，VB12 2.5g，VB1 2.5g，溶解后加入5m3发酵罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂1250g，加入0.1～1％体积分数的植物油，灭菌后调节pH 6.0，温度22℃。
其中，(NH4)2SO4，MgSO4·7H2O，KH2PO4，CaCl2，ZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，MnSO4·H2O，CoSO4·7H2O，Na2MoO4·2H2O，KCl，H3BO3，泛酸钙，生物素，VB12，VB1在使用过程中尽量逐个单独溶解后再加入培养基中，避免发生沉淀，影响菌株对其利用效率。而植物油的添加量为发酵液体积分数的0.1～1％，优选为0.5％，其次，植物油优选为玉米油、芝麻油、大豆油、橄榄油和花生油，最优选为玉米油，因玉米油含有部分玉米黄素以及丰富的甾醇与脂肪酸，玉米黄素是虾青素生物合成路径中的近末端产物，而甾醇和脂肪酸是红法夫酵母生长过程中所需合成的产物，该产物的合成起始于乙酰辅酶A，而虾青素合成路径上游的萜类骨架合成亦是起始于糖酵解后的乙酰辅酶A，意味着甾醇、脂肪与虾青素的合成同时竞争乙酰辅酶A，从而造成碳代谢通量不足，玉米油中丰富的甾醇与脂肪酸进入菌体后有效的降低了甾醇和脂肪合成路径对乙酰辅酶A的需求，继而增加了乙酰辅酶A流入萜类骨架合成的通量，最终促进菌体虾青素的积累；同时玉米油的添加在一定程度上抑制了红法夫酵母发酵周期内泡沫的产生，同时也降低了聚醚消泡剂的使用量，减少聚醚消泡剂对红法夫酵母菌体生长和虾青素积累的影响。
最后，待二级种子生长到特定的菌数与菌体形态时，将二级种子全部转入5m3发酵罐，开启搅拌150rpm，通气量180Nm3/h，将溶氧校准100％，随后将通气量调整为150Nm3/h，转速120rpm，开始发酵，发酵至一段时间后往发酵罐中流加前体物，直到溶氧低于预设区间时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。
其中，前体物为虾青素生物合成路径中的中间代谢产物，在发酵过程中添加前体物，菌体吸收后，有利于增加其胞内虾青素生物合成路径中的该前体物的代谢通量，进而作为酶促生化反应的底物生成该路径的下一级产物，依次类推，最终会促进该路径的终端产物虾青素的合成；其包括八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、海胆烯酮、3(或3')-羟基海胆酮、玉米黄素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质其中的一种或两种，优选为角黄素和β-胡萝卜素和玉米黄素，最优选为β-胡萝卜素；且前体物可以用油、水、乙醇中的一种或两种溶剂进行溶解，优选为水和乙醇的混合液进行溶解；流加前体物的浓度为10～300g/L，优选为30～200g/L，最优选为50g/L；同时前体物初次的流加时间是在菌体的对数生长末期，优选为48～72h，前体物后续的多次流加均需与溶氧参数进行关联。
发酵至18～22h，溶氧降至低点时，逐步提高发酵罐搅拌转速与通气量，使发酵罐内溶氧维持在25％左右，每天检测四次发酵液葡萄糖浓度，以54％葡萄糖浓缩液补料维持罐内发酵液残余葡萄糖浓度在1～3g/L；因葡萄糖是红法夫酵母生长与虾青素积累的重要碳源，为避免发生美拉德反应，发酵工艺中的发酵罐步骤所需的葡萄糖采用单独分消制成50％～55％葡萄糖浓缩液，培养基灭菌后再加入分消完成的葡萄糖浓缩液至所需特定浓度，特定葡萄糖浓度为30～60g/L。
发酵至60～64h后逐步降低发酵罐搅拌转速，使罐内溶氧维持在40～50％，在72～84h，待菌体干重达到稳定时，将pH调节至4.0～5.0，优选为72h，将发酵罐的pH均调节至5.0左右，而在此之前酸碱补料以柠檬酸和氨水维持发酵前期的pH稳定在6.0左右，直至发酵结束。
发酵在60～72h，第一次对5m3发酵罐流加前体物，前体物后续的多次流加均与溶氧参数进行关联，当溶氧上升到特定数值区间40～50％时，触发流加程序，前体物以低流量进行流加，如此循环，直到溶氧低于该区间25％时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。
通过上述发酵工艺，其检测结果如图4所示，5m3发酵罐，发酵168h后可获得107.1g/L菌体干重，615.72mg/L虾青素产量，5.75mg/g虾青素含量。
实施例三
60m3罐发酵工艺
第一，称取葡萄糖500g，酵母浸粉300g，蔗糖150g，硫酸铵150g，MgSO4·7H2O 55g，KH2PO4 50g，CaCl2 2.25g，溶解后加入50L种子罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂12.5g，灭菌后调节pH 6.0。再将红法夫酵母茄瓶种子洗脱液1L接种到50L种子罐内，通气量1.80Nm3/h，温度22℃，转速200rpm，酸碱补料以柠檬酸和氨水维持整个种子培养周期pH稳定在6.0，培养22～26h后即可获得一级种子液。
第二，称取葡萄糖5000g，酵母浸粉3000g，蔗糖1500g，硫酸铵1500g，MgSO4·7H2O550g，KH2PO4 500g，CaCl2 22.5g，溶解后加入500L种子罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂125g，灭菌后调节pH 6.0。待一级种子生长到特定的菌数与菌体形态时，将一级种子全部转入500L种子罐，通气量18Nm3/h，温度22℃，转速160rpm，酸碱补料以柠檬酸和氨水维持整个种子培养周期pH稳定在6.0，培养22～24h后即可获得二级种子液。
第三，称取葡萄糖50kg，酵母浸粉30kg，蔗糖15kg，硫酸铵15kg，MgSO4·7H2O5.5kg，KH2PO4 5kg，CaCl2 225g，溶解后加入5m3种子罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂1250g，灭菌后调节pH 6.0。待二级种子生长到特定的菌数与菌体形态时，将二级种子全部转入5m3种子罐，通气量150Nm3/h，温度22℃，转速120rpm，酸碱补料以柠檬酸和氨水维持整个种子培养周期pH稳定在6.0，培养20～22h后即可获得三级级种子液。
第四，配置60m3罐的发酵培养基，称取酵母浸粉324kg，(NH4)2SO4 162kg，蔗糖162kg，柠檬酸钠135g，谷氨酸钠54kg，MgSO4·7H2O 59.4kg，KH2PO4 54kg，CaCl2 2.43kg，ZnSO4·7H2O 540g，CuSO4·5H2O 675g，MnSO4·H2O 22.95g，CoSO4·7H2O 162g，Na2MoO4·2H2O 5.4g，KCl 135g，H3BO3 8.37g，泛酸钙67.5g，生物素1.35g，VB12 27g，VB1 27g，溶解后加入60m3发酵罐内，初定容后再加入聚醚消泡剂13.5kg，加入0.1～1％体积分数的植物油，灭菌后调节pH 6.0，温度22℃。
其中，(NH4)2SO4，MgSO4·7H2O，KH2PO4，CaCl2，ZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，MnSO4·H2O，CoSO4·7H2O，Na2MoO4·2H2O，KCl，H3BO3，泛酸钙，生物素，VB12，VB1在使用过程中尽量逐个单独溶解后再加入培养基中，避免发生沉淀，影响菌株对其利用效率。而植物油的添加量为发酵液体积分数的0.1～1％，优选为0.5％，其次，植物油优选为玉米油、芝麻油、大豆油、橄榄油和花生油，最优选为玉米油，因玉米油含有部分玉米黄素以及丰富的甾醇与脂肪酸，玉米黄素是虾青素生物合成路径中的近末端产物，而甾醇和脂肪酸是红法夫酵母生长过程中所需合成的产物，该产物的合成起始于乙酰辅酶A，而虾青素合成路径上游的萜类骨架合成亦是起始于糖酵解后的乙酰辅酶A，意味着甾醇、脂肪与虾青素的合成同时竞争乙酰辅酶A，从而造成碳代谢通量不足，玉米油中丰富的甾醇与脂肪酸进入菌体后有效的降低了甾醇和脂肪合成路径对乙酰辅酶A的需求，继而增加了乙酰辅酶A流入萜类骨架合成的通量，最终促进菌体虾青素的积累；同时玉米油的添加在一定程度上抑制了红法夫酵母发酵周期内泡沫的产生，同时也降低了聚醚消泡剂的使用量，减少聚醚消泡剂对红法夫酵母菌体生长和虾青素积累的影响。
第五，待三级种子生长到特定的菌数与菌体形态时，将三级种子全部转入60m3种子罐，开启搅拌80rpm，通气量1680Nm3/h，将溶氧校准100％，随后将通气量调整为1340Nm3/h，转速40rpm，开始发酵；发酵至一段时间后往发酵罐中流加前体物，直到溶氧低于预设区间时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。
其中，前体物为虾青素生物合成路径中的中间代谢产物，在发酵过程中添加前体物，菌体吸收后，有利于增加其胞内虾青素生物合成路径中的该前体物的代谢通量，进而作为酶促生化反应的底物生成该路径的下一级产物，依次类推，最终会促进该路径的终端产物虾青素的合成；其包括八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、海胆烯酮、3(或3')-羟基海胆酮、玉米黄素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质其中的一种或两种，优选为角黄素和β-胡萝卜素和玉米黄素，最优选为β-胡萝卜素；且前体物可以用油、水、乙醇中的一种或两种溶剂进行溶解，优选为水和乙醇的混合液进行溶解；流加前体物的浓度为10～300g/L，优选为30～200g/L，最优选为50g/L；同时前体物初次的流加时间是在菌体的对数生长末期，优选为48～72h，前体物后续的多次流加均需与溶氧参数进行关联。
同时发酵至18～22h，溶氧降至低点时，逐步提高发酵罐搅拌转速与通气量，使发酵罐内溶氧维持在30％左右，每天检测四次发酵液葡萄糖浓度，以54％葡萄糖浓缩液补料维持罐内发酵液残余葡萄糖浓度在1～3g/L。
发酵至64～68h后逐步降低发酵罐搅拌转速与通气量，使罐内溶氧维持在50～60％，在72～84h，待菌体干重达到稳定时，将pH调节至4.0～5.0，优选为72h，将发酵罐的pH均调节至5.0左右，而在此之前酸碱补料以柠檬酸和氨水维持发酵前期的pH稳定在6.0左右，直至发酵结束。
发酵在60～72h，第一次对60m3发酵罐流加前体物，前体物后续的多次流加均与溶氧参数进行关联，当溶氧上升到特定数值区间50～60％时，触发流加程序，前体物以低流量进行流加，如此循环，直到溶氧低于该区间30％时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。
其中，在上述发酵罐工艺中流加的前体物为虾青素生物合成路径中的某一中间产物，包括八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、海胆烯酮、3(或3')-羟基海胆酮、玉米黄素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质其中的一种或两种，优选为角黄素和β-胡萝卜素和玉米黄素，最优选为β-胡萝卜素；且前体物可以用油、水、乙醇中的一种或两种溶剂进行溶解，优选为水和乙醇的混合液进行溶解；流加前体物的浓度为10～300g/L，优选为30～200g/L，最优选为50g/L；同时前体物初次的流加时间是在菌体的对数生长末期，优选为48～72h，前体物后续的多次流加均需与溶氧参数进行关联。
通过上述发酵工艺，其检测结果如图5所示，60m3发酵罐，发酵168h后可获得102.9g/L菌体干重，612.93mg/L虾青素产量，5.96mg/g虾青素含量。
本发明的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，通过实施例1-3的发酵结果图可知，本发明的基础培养基通过合适的葡萄糖补料工艺即可达到110g/L的菌体干重，远超过目前同类菌株60～70g/L的干重水平；以及在菌体发酵周期内，通过补加合适的前体物，再匹配优化后的发酵工艺，有效的促进了菌体虾青素的积累，虾青素产量达600mg/L以上，大幅超过了目前同类菌株的虾青素产量，也逐渐拉近了与基因工程菌的产量差距。
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。
如1、对于大罐生产中摇瓶种子液的制备，也可以用茄瓶固体培养基(成分同摇瓶培养基一致，与YPD培养基相近)事先对红法夫酵母活化完成，进而使用生理盐水或YPD培养基等无菌液体将茄瓶中的菌落洗脱，汇集多个茄瓶的菌落洗脱液于无菌接种瓶内，按3％～10％接种到一级种子罐中，150～200rpm，温度20～22℃，通气量0.6～1.8vvm，培养22～26h后同样可获得一级种子液。
2、菌体发酵期间所流加的前体物来源可能是化学合成的纯品或复配的低含量粗品，也可能是来自于自然界动植物的粗提取物，例如番茄汁中的番茄红素、玉米汁中的玉米黄素和胡萝卜中的β-胡萝卜素，此外这些前体物在发酵培养基中的添加等同于流加工艺。
3、植物油的种类不局限于上述优选的5种，还包括葵花籽油、菜籽油、棉籽油、胡麻油、核桃油、山茶油、棕榈油等等，因为这些植物油的甾醇与脂肪酸同样是非常丰富，在降低菌体的油脂合成路径对乙酰辅酶A需求方面亦能起作用。
另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (6)

1.一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，所述红法夫酵母菌株于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2020413，其特征在于，包括以下步骤：
S1、摇瓶种子液制备：将事先从甘油管到固体平板活化好的菌株刮取到灭菌的摇瓶种子培养基中，并在转速150~200rpm，温度20~24℃条件下培养24~28h，获得摇瓶种子液；
S2、一级种子液制备：将步骤S1摇瓶种子液按3%~10%接种到一级种子罐中，并在转速150~200rpm，温度20~22℃，通气量0.6~1.8Nm3/h条件下培养22~26h，获得一级种子液；
S3、发酵培养：将步骤S2中一级种子液生长到特定菌数与菌体形态时，按3%~10%体积接种量转接入含有发酵培养基的发酵罐中，开启搅拌，转速200~300rpm，通气量2.4-2000Nm3/h，开始发酵；发酵至一段时间后往发酵罐中流加前体物，直到溶氧低于预设区间时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液；
该发酵前期以柠檬酸和氨水维持pH稳定在6.0左右；发酵至18~22h，溶氧降至低点时，逐步提高发酵罐搅拌转速与通气量，使发酵罐内溶氧维持在25%左右，每天检测四次发酵液葡萄糖浓度，以54%葡萄糖浓缩液补料维持罐内发酵液残余葡萄糖浓度在1~3g/L；60~64h后逐步降低发酵罐搅拌转速，使罐内溶氧维持在40~60%，在72~84h，待菌体干重达到稳定时，将发酵罐的pH均调节至5.0左右，直至发酵结束；
前体物初次的流加时间在菌体发酵至48~72h时；所述前体物后续的多次流加均与溶氧参数进行关联，当溶氧上升到40~60%时，触发流加程序，前体物以低流量进行流加，直到溶氧低于30%时停止流加；
所述前体物包括八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、海胆烯酮、3（或3'）-羟基海胆酮、玉米黄素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质中的一种或两种；且所述前体物用油、水、乙醇中的一种或两种溶剂进行溶解，其浓度为10~300g/L。
2.根据权利要求1所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：所述摇瓶种子培养基包括以下质量浓度的组分：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，pH6.0；所述一级种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸铵6g/L，蔗糖6g/L，MgSO4·7H2O 2.2g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 0.09g/L，聚醚消泡剂0.5g/L，pH6.0。
3.根据权利要求1所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：酵母浸粉6g/L，蔗糖3.0g/L，柠檬酸钠2.5g/L，谷氨酸钠1.0g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L，KH2PO4 1.0g/L，CaCl2 0.045g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，CuSO4·5H2O 0.0125g/L，MnSO4·H2O 0.425mg/L，CoSO4·7H2O 3mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，KCl 2.5mg/L，H3BO3 0.155mg/L，泛酸钙1.25mg/L，生物素0.025mg/L，VB12 0.5mg/L，VB1 0.5mg/L，聚醚消泡剂0.25g/L，体积分数0.1~1%植物油。
4.根据权利要求3所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：所述植物油包括玉米油、芝麻油、大豆油、橄榄油、花生油中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：还包括二级种子液制备：将所述一级种子液按3%~10%接种到含有二级种子培养基的二级种子罐中，并在150~200rpm，温度20~22℃，通气量10~20Nm3/h条件下培养22~24h，获得二级种子液；其中，二级种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸铵6g/L，蔗糖6g/L，MgSO4·7H2O 2.2g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 0.09g/L，聚醚消泡剂0.5g/L，pH6.0。
6.根据权利要求5所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：还包括三级种子液制备：将所述二级种子液按3%~10%接种到含有三级种子培养基的三级种子罐中，并在150~200rpm，温度20~22℃，通气量120~180Nm3/h条件下培养20~22h，获得三级种子液；其中，三级种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸铵6g/L，蔗糖6g/L，MgSO4·7H2O 2.2g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 0.09g/L，聚醚消泡剂0.5g/L，pH6.0。
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