CN105368887B - 一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种ε‑聚‑L‑赖氨酸的发酵生产工艺，采用淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)CGMCC No.3145作为生产菌株，在两阶段分批补料过程中，在补糖的同时复合流加苏氨酸，所加苏氨酸终浓度为2.5‑10g/L，进行ε‑聚‑L‑赖氨酸的发酵生产，产量较不流加苏氨酸提高了60‑110％，不仅提高了ε‑聚‑L‑赖氨酸及其盐的生产能力，而且缩短了发酵周期，从而保证了生产的高效、经济，可用于工业化生产ε‑聚‑L‑赖氨酸及其盐。

Description

一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺

技术领域

本发明涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺。

背景技术

ε-聚-L-赖氨酸(ε-Poly-L-lysine，ε-PL)是一种由25-35个L-赖氨酸通过ε-氨基和α-羧基缩合而成的碱性聚酰胺。ε-PL由于其水溶性好、适用pH广、具有良好的热稳定性、安全性和广谱抑菌性，能够抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、耐热芽孢杆菌及部分病毒的活性。19世纪80年代，日本批准ε-PL可作为食品防腐剂应用于食品。此后，ε-PL出现于韩国食品添加剂法规中。2003年7月10日，日本智索公司向FDA提交申请材料，2004年1月16日FDA对申请作出答复，批准ε-PL为GRAS产品(公告No.GRN 000135)，ε-PL作为防腐剂加入煮熟的大米或寿司中，最大添加量为50mg/kg。2010年，FDA发布了关于ε-PL通过GRAS认证的公告，公告中指出，在特定的条件下ε-PL可作为食品防腐剂应用于各类传统食品。2012年浙江新银象生物工程有限公司等提交ε-PL及其盐酸盐为食品添加剂申请材料，2014年4月国家卫生计生委食品安全标准与监测评估司发布公告(2014年第5号)，批准了ε-PL及其盐酸盐为食品添加剂新品种。因此ε-聚-L-赖氨酸及其盐是一种非常有市场前景的生物防腐剂。

1977年，Shima和Sakai首次在Streptomyces albulus NBRC 14147菌株的发酵上清液中发现这种氨基酸多聚物。近年来，随着菌种性能的改造和发酵调控手段的改进，ε-PL的发酵生产效率不断的提高。2000年7月12日，国家知识产权局公布了日本国岩田敏志等人在中国申请的专利名称为“大量产生ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法”的发明专利，专利号为97182253.0。此专利是在培养基中培养菌株B21021(FERM BP-5926)，然后从发酵液中分离和纯化ε-聚-L-赖氨酸。

通过检索，目前，我国公布的有关ε-PL生产的主要专利有：

1.专利号为ZL 200510037774.2的“利用北里孢菌PL6-3制备ε-PL及其盐的方法”发明专利，其保护点在于提出了一种通过筛选获得的北里孢菌PL6-3，从而发酵生产ε-PL的方法。

2.专利号为ZL 200610013800.2的“回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法”发明专利是由申请人自己申请的。该专利提出了一种回流工艺生产ε-PL的方法，即在ε-PL的发酵过程中，流加提取过程的后期穿透液，然后通过离子交换树脂法提取得到ε-聚-L-赖氨酸。不仅提高了ε-PL的产率，节约了成本，而且减少了发酵废液和洗脱用盐酸废液的排放，减轻了环境污染。

3.专利号为ZL 200710057098.4的“一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的发明专利，也是由申请人申请的。该专利利用从我国海南省土壤中筛选、紫外诱变、紫外和化学诱变相结合，以及N离子注入诱变等手段诱变白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，产量在10～30g/L。

4.专利号为ZL 200910030330.4的“一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺”的发明专利，公开了一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺，将吸附固定化材料固定于发酵罐中，接入ε-聚赖氨酸生产菌株，实现ε-聚赖氨酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定，并利用该生产菌株固定化发酵生产ε-聚赖氨酸。

5.专利号为ZL 200910069517.5的“一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法”，是由申请人自己申请的，是以Streptomyces diastatochromogenes或Streptomyces albulus为生产菌株，在发酵生产ε-聚-L-赖氨酸的过程中，产物开始积累以后，向培养基中流加L-赖氨酸以提高产量，然后将发酵液离心、离子交换吸附、脱色、真空干燥后得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐，产物量比不流加L-赖氨酸的过程提高25～50％。

6.专利号为ZL 200910224087.X的“一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的发明专利，公开了一种灰褐链霉菌菌株LS-H1及利用该菌株制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。在优化条件下能积累0.7～20g/L的ε-聚赖氨酸，然后发酵液经离心、离子交换得到ε-聚赖氨酸及其盐。

7.专利号为ZL 201110049986.8的“一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用”的发明专利，公开一种小白链霉菌，其分类命名为小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1，公开了上述小白链霉菌在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用。采用该菌株作为发酵菌株，经一级、二级种子扩大培养，发酵生产，提取后聚赖氨酸产量达30g/L以上，聚二氨基丁酸产量达12g/L以上。

8.专利号为ZL 201110152802.0的“不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的发明专利，公开了一种不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。

9.专利号为ZL 201110333684.3的“一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法”的发明专利，是由申请人自己申请的，公开了一种ε-聚-L-赖氨酸的生产方法，培养基中含有1～10g/L的甘氨酸，所述甘氨酸在培养前期或中期加入。该发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，甘氨酸可进入叶酸代谢途径，为生物合成过程提供充足的一碳基团，提高菌株合成代谢活力，增加前体L-赖氨酸及ε-聚-L-赖氨酸的合成，使ε-聚-L-赖氨酸积累量比原有工艺提高了20～50％。

10.专利号：ZL 201110362088.8的“链霉菌Streptomyces sp.NK-660及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法”的发明专利，公开了链霉菌Streptomyces sp.NK-660及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。

11.专利号为ZL 201210081685.8的“一株链霉菌及其应用”的发明专利，公开了一株链霉菌Streptomyces sp.NK-49及其应用，即利用该菌生产ε-聚赖氨酸的发酵培养和产物分离纯化的方法。

12.专利号为ZL 201310257217.6的“一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法”的发明专利，公开了一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法，通过在ε-聚赖氨酸发酵过程中分批或连续流加所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠固体或溶液，实现ε-聚赖氨酸产量显著提高。

13.申请号为201410156360.0的“一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法”的发明专利，也是由发明人自己申请的，该发明涉及一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法，采用淀粉酶产色链霉菌CGMCC No.3145作为生产菌株，发酵0～48h，向发酵培养基中添加终浓度为2.5-5.0g/L的L-苏氨酸。本专利与该专利的不同之处在于，苏氨酸的添加方式不同，该专利是直接投料，本专利是与碳源一同补料的复合流加工艺；采用本投料方式一方面可以避免由于直接投料导致营养过剩从而引起的菌体生长抑制及产物合成抑制，另一方面也可以增加物料的利用率，采用直接投料方式后平均单位细胞产率为0.0024(gε-PL/gcell·h)，而采用复合流加工艺后平均单位细胞产率为0.0068(gε-PL/g cell·h)。

14.申请号为201510021744.6的“一种低pH值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法”的发明专利，公开了一种低pH值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法。

15.申请号为201510069494.3的“一种以木薯淀粉发酵生产ε-聚赖氨酸的方法”。该发明以ε-聚赖氨酸产生菌为发酵菌种，木薯淀粉为碳源，在一定条件下发酵生产ε-聚赖氨酸。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，可高效制备ε-聚-L-赖氨酸。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，生产菌株为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)CGMCC No.3145，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期是2009年6月29日，方法包括以下步骤：

(1)采用ε-聚-L-赖氨酸及其盐的生产菌株淀粉酶产色链霉菌(CGMCC No.3145)，将培养好的斜面菌株转接到种子培养基，28-35℃下培养24-48h得到种子液；

(2)种子液按3-15％接种量，转接通风发酵罐进行发酵，或者先转二级或三级种子罐，再转发酵罐进行发酵培养；发酵培养基中有机碳源50-60g/L，有机氮源5-8g/L，无机氮源5-10g/L，磷酸盐2-2.5g/L，微量元素0.01-0.03g/L；发酵条件为初始pH6.6-7.0，温度28-35℃、溶氧20-30％；当发酵液中残糖浓度降至10g/L以下时，流加补料混合液(用量根据实时消耗的糖浓度决定)使糖浓度维持在9-13g/L，并把pH控制在3.9-4.1，培养120-200h得到发酵液；

(3)将发酵液离心或过滤除去菌体及部分固形物，清液采用阳离子交换树脂进行交换吸附后洗脱，收集的前期洗脱液，经活性炭脱色后，再经过滤、浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸及其盐。

优选的，上述ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，步骤(2)所述的发酵培养基中有机碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油、淀粉、糖蜜中的一种或几种；有机氮源为酵母粉、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉中的一种或几种；无机氮源为(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃中的一种或几种；磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钠中的一种或几种；微量元素为FeSO_4、MnSO_4、MgSO₄中的一种或几种。

优选的，上述ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，步骤(2)所述的补料混合液为苏氨酸、(NH₄)₂SO₄、葡萄糖的混合物。

优选的，上述ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，步骤(2)所述的通风发酵罐为机械搅拌式通风发酵罐或气升式发酵罐。

本发明的有益效果是：

上述ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，克服了现有技术中发酵周期长的不足，提高了聚赖氨酸及其盐的产率，通过在发酵过程中控制苏氨酸与葡萄糖、硫酸铵的复合流加，不仅提高了ε-聚-L-赖氨酸及其盐的生产能力，而且缩短了发酵周期，实现了聚赖氨酸及其盐的高效制备，并且可用于工业规模的发酵，保证了生产的高效、经济、环保。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

斜面培养基：

贝特纳(Bennett’s)固体培养基(g/L)：葡萄糖10、牛肉膏1、蛋白胨2、酵母粉1、琼脂20。

种子培养基：

M3G培养基(g/L)：葡萄糖50、酵母粉5、(NH₄)₂SO₄10、MgSO₄·7H₂O0.5、K₂HPO₄·3H₂O0.8、KH₂PO₄1.36、FeSO₄·7H₂O 0.03、ZnSO₄·7H₂O 0.04。

发酵培养基(g/L)：

葡萄糖60，酵母粉8，(NH₄)₂SO₄8，MgSO₄·7H₂O 0.5，K₂HPO₄·3H₂O 0.8，KH₂PO₄1.36，FeSO₄·7H₂O 0.03，ZnSO₄·7H₂O 0.04。

将摇瓶发酵的种子液以6％的接种量转接至5L机械搅拌式通风发酵罐中，当DO降至30％，调节溶氧与搅拌转速关联。培养基pH自然下降至6.0后自动控制pH维持在6.0；当发酵进行到残糖降至10g/L，此时流加葡萄糖和硫酸铵的混合液，补糖至12g/L，且同时流加苏氨酸，使终浓度维持在5g/L，并把pH控制在4.0。

发酵结束后，经检测ε-PL产量最高为38.50g/L。流加苏氨酸较不添加苏氨酸产量提高90％，较一次性添加苏氨酸提高54％。流加苏氨酸后发酵时间由不添加苏氨酸的225h缩短至168h，而一次性添加苏氨酸的发酵时间为192h。

将发酵液离心除去菌体及部分固形物，上清液采用阳离子交换树脂进行交换吸附后洗脱，收集的前期洗脱液，经活性炭脱色后，再经过滤、浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸及其盐。

实施例2

斜面培养基：

贝特纳(Bennett’s)固体培养基(g/L)：葡萄糖10、牛肉膏1、蛋白胨2、酵母粉1、琼脂20。

种子培养基：

M3G培养基(g/L)：葡萄糖50、酵母粉5、(NH₄)₂SO₄10、MgSO₄·7H₂O0.5、K₂HPO₄·3H₂O0.8、KH₂PO₄1.36、FeSO₄·7H₂O 0.03、ZnSO₄·7H₂O 0.04。

发酵培养基(g/L)：

蔗糖50，酵母膏7.5，NH₄Cl 10，MgSO₄·7H₂O 0.5K₂HPO₄·3H₂O 0.8，KH₂PO₄1.36，FeSO₄·7H₂O 0.03，ZnSO₄·7H₂O 0.04。

将摇瓶发酵的种子液以10％的接种量转接至10L气升式发酵罐中，当DO降至30％，调节通风量控制溶氧在20-30％。培养基pH自然下降至6.0后自动控制pH维持在6.0；当发酵进行到残糖降至10g/L，此时流加葡萄糖、硫酸铵和苏氨酸的混合液，补糖至12g/L维持苏氨酸终浓度为7g/L，并把pH通过自动流加氨水控制在4.0。

发酵结束后，经检测ε-PL产量为38.55g/L。流加苏氨酸较不添加苏氨酸产量提高90％，较一次性添加苏氨酸提高65％。流加苏氨酸后发酵时间由不添加苏氨酸的226h缩短至172h，而一次性添加苏氨酸发酵时间为196h。

将发酵液离心除去菌体及部分固形物，清液采用阳离子交换树脂进行交换吸附后洗脱，收集的前期洗脱液，经活性炭脱色后，再经过滤、浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸及其盐。

实施例3

斜面固体培养基(g/L)：葡萄糖10、牛肉膏1、蛋白胨2、酵母粉1、琼脂20。

种子培养基：

M3G培养基(g/L)：葡萄糖50、酵母粉5、(NH₄)₂SO₄10、MgSO₄·7H₂O0.5、K₂HPO₄·3H₂O0.8、KH₂PO₄1.36、FeSO₄·7H₂O 0.03、ZnSO₄·7H₂O 0.04。

发酵培养基(g/L)：

淀粉50，蛋白胨5，NH₄NO₃10，MgSO₄·7H₂O 0.5、K₂HPO₄·3H₂O 0.8、KH₂PO₄1.36、FeSO₄·7H₂O 0.03、ZnSO₄·7H₂O 0.04。

从固体斜面挑一环淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)CGMCC No.3145孢子接至含有100mL M3G液体培养基的500mL三角瓶中，30℃、220r/min条件下摇床培养24h，得到一级种子液。

把一级摇瓶种子培养液以3％的接种量在无菌条件下接入装有50L发酵培养基的100L机械搅拌式通风发酵罐中培养15h，得到二级种子液。

将二级种子培养液以10％的接种量接种至700L中试机械搅拌式通风发酵罐，控制初始装液量为300L左右，pH两阶段控制发酵产ε-PL，溶氧控制在30％左右，通风和搅拌根据溶氧来控制，通风比维持0.5-1.0vvm。待发酵液中糖浓度降至10g/L，流加葡萄糖和硫酸铵的混合液，补糖至12g/L，且同时流加苏氨酸，使其终浓度为3g/L(三者同时流加)，ε-PL发酵水平达27.5g/L，比不添加苏氨酸的发酵水平15g/L要高出83％，较一次性添加苏氨酸对照组发酵水平的18g/L提高53％。发酵周期也缩短至175h，较不添加和一次性添加苏氨酸的对照组分别缩短12％和8％。

放罐后，将发酵液过滤除去菌体及部分固形物，上清液采用阳离子交换树脂进行交换吸附后洗脱，收集的前期洗脱液，经活性炭脱色后，再经过滤、浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸及其盐。

取上述实施例所得产物ε-聚-L-赖氨酸及其盐，根据ZL 200710057098.4的“一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的发明专利中所述方法进行确认，所制备的ε-聚赖氨酸及其盐具有如下理化性质：

(1)本产品溶于水、盐酸，微溶于乙醇，不溶于乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂；

(2)对茚三酮反应呈阳性，用6N HCl水解后对茚三酮呈阳性。

(3)6N HCl水解后，用纸层析和薄层层析检测，发现其水解液呈单一的氨基酸——赖氨酸，表明本产品为赖氨酸的高分子聚合物。

(4)采用液态核磁共振和固态核磁共振分析，鉴定了产品的结构为ε-型结构，由一个L-赖氨酸的ε-NH2与另一个L-赖氨酸的α-COOH形成的肽键连接而聚合成的高分子ε-聚赖氨酸。

(5)通过SDS-PAGE电泳测出ε-PL分子量为4000～6500Da。

从而确定各实施例中所得产物即为目标产物ε-聚-L-赖氨酸及其盐。

上述参照具体实施方式对该一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：生产菌株为淀粉酶产色链霉菌CGMCC No.3145，方法包括以下步骤：

(1)采用ε-聚-L-赖氨酸及其盐的生产菌株淀粉酶产色链霉菌CGMCC No.3145，将培养好的斜面菌株转接到种子培养基，28-35℃下培养24-48h得到种子液；

(2)种子液按3-15％接种量，转接通风发酵罐进行发酵，或者先转二级或三级种子罐，再转发酵罐进行发酵培养；发酵培养基中有机碳源50-60g/L，有机氮源5-8g/L，无机氮源5-10g/L，磷酸盐2-2.5g/L，微量元素0.01-0.03g/L；发酵条件为初始pH6.6-7.0，温度28-35℃、溶氧20-30％；当发酵液中残糖浓度降至10g/L以下时，流加补料混合液使糖浓度维持在9-13g/L，所述补料混合液为苏氨酸、(NH₄)₂SO₄、葡萄糖的混合物，并把pH控制在3.9-4.1，培养120-200h得到发酵液；

(3)将发酵液离心或过滤除去菌体及部分固形物，清液采用阳离子交换树脂进行交换吸附后洗脱，收集的前期洗脱液，经活性炭脱色后，再经过滤、浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸及其盐。

2.根据权利要求1所述的ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：步骤(2)所述的发酵培养基中有机碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油、淀粉、糖蜜中的一种或几种；有机氮源为酵母粉、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉中的一种或几种；无机氮源为(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃中的一种或几种；磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钠中的一种或几种；微量元素为FeSO₄、MnSO₄、MgSO₄中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：步骤(2)所述的通风发酵罐为机械搅拌式通风发酵罐或气升式发酵罐。