CN103333926A - 一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法，通过在ε-聚赖氨酸发酵过程中分批或连续流加所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠固体或溶液，实现ε-聚赖氨酸产量显著提高。所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠加终浓度为1～20g/L，优选在在发酵开始12h-18h后进行添加。本发明易于在ε-聚赖氨酸发酵过程中实施，且对产业化大规模生产ε-聚赖氨酸的发酵水平提升具有重要指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法，具体地说是在ε-聚赖氨酸发酵过程中添加一定浓度所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠，提高ε-聚赖氨酸的产量，属工业生物技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简写ε-PL）是一种具有广谱抑菌作用的生物食品防腐剂。相比于苯甲酸钠和山梨酸钾等传统化学食品防腐剂，ε-PL具有水溶性好、适用pH宽、热稳定强、使用量低、抑菌谱广和安全性高等优点。目前，ε-PL已在日本、韩国、美国和欧洲等国家和地区得到了应用。此外，ε-PL作为一种生物聚合物还被用于药物载体、抗癌增进剂和生物芯片外被等领域。由此可见，ε-PL是一种应用范围广和市场潜力大的新兴生物技术产品。
微生物发酵是目前生产ε-PL的唯一途径。为了实现高产量、高产率和高生产强度ε-PL发酵生产模式，选育并获得ε-PL高产菌是重要前提之一（岩田敏治，等.中国专利，ZL97182253.0）。菌株选育的核心是借助诱变或代谢工程手段提高ε-PL合成相关途径代谢通量（尤其是限制性代谢途径），以加快目标产物的合成速率。然而，不管是利用传统的诱变方法还是定向改造的基因工程策略，获得高产菌实现ε-PL发酵水平提升都是十分具有挑战性的工作。实际上，利用生化工程的方法，在发酵过程中添加前体往往也能够达到提高ε-PL发酵水平的效果。Bankar SB和Singhal RS发现在利用Streptomyces noursei NRRL5126发酵生产ε-PL过程中同时添加L-天门冬氨酸和柠檬酸可以实现ε-PL产量从97.08mg/L提高到497.67mg/L（Bankar SB et al.Eng Life Sci,2011,11(3):253–258）。贾士儒等公开了一种在发酵过程中流加L-赖氨酸提高ε-PL产量的方法，成功实现ε-PL产量提高25～50%（贾士儒，等.中国专利，ZL200910069517.5）。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法，通过添加所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠来促进ε-PL产生菌的生长和ε-PL的合成，从而达到提高ε-PL产量的目的。
本发明提供的技术方案，主要采用以下步骤实现：
所述ε-聚赖氨酸发酵所用生产菌为链霉菌属或芽孢杆菌属ε-聚赖氨酸产生菌微生物。
发酵方法具体步骤参见Bioprocess Biosyst Eng(2011)34:561–567和Bioprocess Biosyst Eng(2012)35:469–475。
所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠添加方式为一次性添加、多批次添加或以一定速度连续流加；可以是经过灭菌处理的固体，也可以是无菌的溶液。
ε-聚赖氨酸发酵过程中，维持发酵液中L-谷氨酸的浓度为1～20g/L。
所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠添加时间优选发酵开始后12-18h之间。
本发明所述的发酵所需pH为3.5-4.0。
本发明所述的发酵起始阶段，即ε-PL刚刚开始合成时，为发酵进行到12h-18h之间。
本发明所涉及的发酵罐的形式和体积不限。
本发明与已有技术相比具有以下优点：
1、操作方式简单，且能显著提高ε-PL产量和产率，增加ε-PL生产的经济效益。
2、为高值化转化L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠提供新的途径，降低所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠价格波动给企业带来的经济损失。
具体实施方式
以下是实施例，对本发明作进一步说明，但对本发明没有限制。
实施例1：添加L-谷氨酸提高ε-聚赖氨酸合成的方法
在5L发酵罐中装3.26L的ε-PL发酵培养基进行分批发酵，将培养24h的Streptomyces sp.M-Z18种子液240mL接种到发酵培养基中后，发酵开始。发酵过程中控制搅拌转速为200-700r/min，通风量为0.5-1.5vvm，DO为30%，温度保持在30℃；在发酵进行到14h、30h和42h时，以无菌操作方式分别添加L-谷氨酸高浓悬浮液，使得发酵体系中L-谷氨酸浓度达到15g/L。同时，pH自动反馈流加2mol/L硫酸以维持发酵pH3.5±0.03。
L-谷氨酸和碳源消耗完毕，结束发酵。发酵时间为56.5h，ε-PL产量和产率分别达到11.01g/L和4.68g/（L·d）。比相同条件下未添加L-谷氨酸的ε-PL产量和产率分别提高了67%和58%。
实施例2：添加L-谷氨酸钠促进ε-聚赖氨酸合成的方法，采用以下工艺步骤：
在5L发酵罐中装3.26L的ε-PL发酵培养基，进行补料-分批发酵，将培养24h的Streptomycesgraminearus CCTCC M209211种子液240mL接种到发酵培养基中后，发酵开始。发酵过程中控制搅拌转速为200-700r/min，通风量为0.5-1.5vvm，DO为30%，温度保持在30℃；在发酵进行到14h、28h、42h、54h、64h、76h、88h、104h和126h时，以无菌操作方式分别添加所述L-谷氨酸钠高浓悬浮液，使得发酵体系中L-谷氨酸浓度达到10g/L。同时，pH自动反馈流加2mol/L硫酸以维持发酵pH4.00±0.03。当碳源（葡萄糖和/或甘油）浓度低于10g/L时，启动碳源流加，以维持发酵过程碳源浓度保持在5～15g/L。
L-谷氨酸钠消耗完毕时结束发酵。发酵时间174h，ε-PL产量和产率分别为31.65g/L和4.36g/（L·d）。比相同条件下未添加谷氨酸的产量和产率分别提高了50%和44%。
实施例3：添加所述L-谷氨酸和L-谷氨酸钠促进ε-聚赖氨酸合成的方法
在5L发酵罐中装3.26L的发酵培养基，进行分批发酵，将培养24h的Streptomyces sp.M-Z18种子液240mL接种到发酵培养基中后，发酵开始。发酵过程中控制搅拌转速为200-700r/min，通风量为0.5-1.5vvm，DO为30%，温度保持在30℃；在发酵16h时，以无菌操作方式添加L-谷氨酸和L-谷氨酸钠高浓悬浮液，使得发酵体系中L-谷氨酸和L-谷氨酸钠浓度达到10g/L。在发酵22h、30h、37h、55h、61h时，以无菌操作方式分别添加所述L-谷氨酸和L-谷氨酸钠无菌固体粉末，使得发酵体系中L-谷氨酸浓度达到20g/L。同时，pH自动反馈流加2mol/L硫酸以维持发酵pH4.00±0.03。
L-谷氨酸消耗完毕，结束发酵。发酵时长70h，ε-PL产量和产率分别为11.89g/L和4.07g/（L·d）。比相同条件下未添加谷氨酸的产量和产率均提高了50%左右。
实施例4：添加L-谷氨酸和L-谷氨酸钠促进ε-聚赖氨酸合成的方法
在5L发酵罐中装3.26L的发酵培养基，进行补料-分批发酵；将培养24h的Streptomyces sp.M-Z18种子液240mL接种到发酵培养基中后，发酵开始。发酵过程中控制搅拌转速为200-700r/min，通风量为0.5-1.5vvm，DO为30%，温度保持在30℃；在发酵16h时，通过蠕动泵连续流加L-谷氨酸和L-谷氨酸钠溶液，使得发酵体系中L-谷氨酸浓度维持在1g/L。同时，pH自动反馈流加2mol/L硫酸以维持发酵pH3.50±0.03。当碳源（葡萄糖和/或甘油）浓度低于10g/L时，启动碳源流加，以维持发酵过程碳源浓度保持在5～15g/L。
L-谷氨酸和L-谷氨酸钠消耗完毕，结束发酵。发酵时长168h，ε-PL产量和产率分别为37.56g/L和4.57g/（L·d）。比相同条件下未添加谷氨酸的产量和产率均提高了30%左右。
Claims (6)
1.一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法，其特征在于：在ε-聚赖氨酸发酵过程中添加L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述ε-聚赖氨酸发酵所用生产菌为链霉菌属或芽孢杆菌属ε-聚赖氨酸产生菌微生物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠为一次性添加、多批次添加或以一定速度连续流加。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠可以是经过灭菌处理的固体，也可以是无菌的溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠添加终浓度为1～20g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸钠添加优选在发酵开始12h-18h后进行添加。
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