KR20190070986A

KR20190070986A - D-락트산 또는 그의 염을 생산하기 위한 발효 방법

Info

Publication number: KR20190070986A
Application number: KR1020197015591A
Authority: KR
Inventors: 팟타논 프라싯촉; 크레이얼락 킷티수리야논; 나롱 캐우수완; 낫타웃 품실라; 누따 통출
Original assignee: 피티티 글로벌 케미칼 피씨엘
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2019-06-21
Also published as: US20200056212A1; EP3535384A4; JP2019536445A; EP3535384A1; CN109906268A; WO2018084813A1

Abstract

본 발명은 D-락트산 또는 그의 염을 생산하기 위한 발효 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하기 단계들: 사탕수수 주스와 발효에 의해 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주를 배양하여 시드 배양물을 수득하는 단계; 수득된 시드 배양물을 사탕수수 주스에서 발효시키는 단계를 포함하고, 상기 배양하는 단계에서 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 균주의 최종 농도가 1 리터당 건조 세포 400 내지 1,600 mg의 범위가 되는 시간 동안 상기 배양하는 단계를 수행한다. 본 발명에 따른 방법은 높은 광학 순도를 갖는 D-락트산을 높은 생산성 및 수득율로 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 방법은 용이하게 수행될 수 있고 복잡한 단계를 줄일 수 있다.

Description

D-락트산 또는 그의 염을 생산하기 위한 발효 방법

생물공학기술은 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 (Sporolactobacillus laevolacticus) 박테리아 균주를 사용하여 D-락트산 또는 그의 염을 생산하기 위한 발효 방법에 관한 것이다.

락트산은 플라스틱 산업, 식품 및 의약품 산업, 및 화장품 산업에 널리 사용되는 것으로 잘 알려져 있다. 플라스틱 산업의 경우, 락트산은 구체적으로 폴리에스테르, 예컨대 폴리락트산, 또는 폴리(락틱-코-글리콜산)의 제조에서 널리 사용되고 있다. 락트산으로부터 제조된 폴리머는 생분해성 및 생체적합성의 이점을 갖는다. 상기 폴리머는 의료 분야에서 직물 섬유 (textile fiber), 필름, 포장, 창자실 (catgut), 및 스캐폴드 (scaffold)와 같은 많은 용도로 사용될 수 있다.

현재, 미생물 발효에서 카사바 콘 (cassava corn), 밀, 또는 사탕수수 (sugarcane)와 같이 원료 물질로서 자연 자원의 사용을 포함하는 몇 가지 이점을 갖는, 화학 합성 및 생명공학적 방법과 같이 락트산을 생산하는 몇 가지 방법이 있다. 상기 원료 물질은 지속적으로 재생산될 수 있다. 또한, 상기 미생물 발효는 광학 순도가 높은 락트산을 생산할 수 있다는 또 하나의 이점을 갖는다.

대부분의 산업적 규모로 락트산 생산은 당 예컨대 글루코스, 수크로스, 말토스, 또는 기타 탄수화물 예컨대 전분 또는 셀룰로스의 발효에 의해 생산되며, 여기서 락트산을 생산할 수 있는 미생물은 박테리아와 진균 (fungi)이다. 현재, L-락트산은 산업적 규모로 널리 생산되고 있다.

그러나, 산업적 규모로 D-락트산의 생산은 개시되어 있지 않다. 대부분의 자연에서 발견되는 박테리아 또는 진균은 L-락트산을 높은 광학 순도로 생산하고, 극소수만이 D-락트산은 생산할 수 있다는 몇 가지 문제가 있다. 이러한 이유로, 상기 박테리아 또는 진균에 대한 세부 연구는 거의 이루어지지 않았다. 그러므로, 자연에서 발견되는 미생물에 의한 D-락트산의 생산 개발은 더욱 어려웠다.

현재 폴리머 생산의 또 다른 문제는 원료 물질이 고가라는 것이다. 락트산을 생산 개발하는데 효율적이고, 생산 비용을 줄이고, 높은 수득율 및 생산성으로 제공하는 것이 필요하다. 양호하게 성장 및 재현될 수 있는 미생물 및 미생물 배양 단계를 개발하려는 시도가 있었다. 락토바실루스 (Lactobacillus), 레우코노스톡 (Leuconostoc), 및 스트렙토코쿠스 (Streptococcus)가 혐기성 조건하에 당으로부터 락트산을 생산하는 것으로 잘 알려져 있는 박테리아 균주이고, 이는 진균이 생산하는 것보다 비용을 절약하고, 더 높은 농도로 산물을 제공한다. 그러나, 상기 박테리아 그룹은 까다로운 (fastidious) 박테리아이다. 그러므로, 이들의 성장에서 몇몇 비타민과 필수 아미노산을 사용할 필요가 있다. 더욱이, 상기 박테리아 그룹은 전분 가수분해를 위한 효소를 생산할 수 없다. 그러므로, 원료 물질로 사용된 전분은 발효에 사용되기 전에 당으로 가수분해될 필요가 있다. 이는 생산 비용을 증가시키는 원인이 된다.

락트산의 생산 비용을 줄이려는 한가지 시도로 락트산을 생산하기 위해 발효에서 사탕수수 주스를 적용하여 당 정제 단계를 줄이는 것이다. 이는 건조 단계를 줄일 수 있고, 사탕수수 주스를 발효액으로 직접 활용할 수 있으며, 미생물 영양 공급원으로 사탕수수 주스 중의 영양을 이용할 수 있다.

그러나, 락트산 구체적으로 D-락트산을 생산하는데 사탕수수 주스를 사용하는 것은 미생물 발효 단계가 복잡하기 때문에 달성하는 것이 어렵다. 그러므로, D-락트산 산물이 높은 농도 및 생산성으로 수득될 수 없다.

Prachamorn 등 (The production of the lactic acid using sugarcane juice as precursor, KKU Research Journal, 2008, 8(3), July - September, 2008)은 락토바실루스 (Lactobacillus) 속 박테리아로 L-락트산을 생산하는데 사탕수수 주스를 사용하는 방법을 개시하였다. 그 결과는, 효모 추출물로부터 질소 화합물이 강화된 150 g/L의 수크로스 농도를 갖는 사탕수수 주스를 사용하였음에도 23 g/L보다 높은 농도의 L-락트산은 생산될 수 없음을 보여주었다.

US2010/0112652는 스포로락토바실루스속 박테리아를 사용하여 사탕수수 주스에서 D-락트산의 발효 단계를 개시하였다. 상기 개시내용으로부터, D-락트산의 최대 농도는, 효모 추출물로부터의 질소 화합물이 첨가되었음에도, 단지 20 g/L인 것으로 밝혀졌다.

Kanwar 등 (Lactic acid production from molasses by Sporolactobacillus cellulosolvens. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 1995. 42 (4), 331-318)은 D-락트산 생산에서 스포로락토바실루스 셀룰로솔벤스 (Sporolactobacillus cellulosolvens)로 당밀을 발효시킨 결과 락트산의 최종 농도가 24.2 g/L로 제공되는 것을 보고하였고, 이는 산업적 규모의 생산에는 충분하지 않다.

Sawai 등 (Membrane-integrated fermentation system for improving the optical purity of the D-lactic acid produced during continuous fermentation. Bioscience and Biotechnology Biochemistry. 2011. 75 (12), 2326 - 2332)은 스포 로락토바실루스 이눌리누스 (Sporolactobacillus inulinus), 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스, 및 스포로락토바실루스 테레 (Sporolactobacillus terrae)와 순수한 수크로스와의 발효를 보고하였다. 이는 높은 농도의 D-락트산을 생산할 수 있지만, 발효에 120시간이 소요되므로 상기 방법은 매우 높은 생산 비용을 야기하였다.

상기 모든 이유로부터, 본 발명은 사탕수수 주스와 같은 저렴한 원료 물질을 사용하여 D-락트산을 생산하는 발효 방법을 개발하여 상기 문제들을 극복하는 것을 목적으로 한다. 개발된 방법은 높은 광학 순도를 갖는 D-락트산을 높은 생산성 및 수득율로 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 방법은 용이하게 수행될 수 있고, 복잡한 단계를 줄일 수 있다.

본 발명은 D-락트산 또는 그의 염을 생산하기 위한 발효 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하기 단계들: 사탕수수 주스와의 발효에 의해 스포로락토바실루 스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주를 배양하여 (cultivating) 시드 배양물 (seed culture)을 수득하는 단계; 수득된 시드 배양물을 사탕수수 주스에서 발효시키는 단계를 포함하고, 상기 배양하는 단계에서 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 균주의 최종 농도가 1 리터당 건조 세포 400 내지 1,600 mg의 범위가 되는 시간 동안 상기 배양하는 단계를 수행한다. 본 발명에 따른 방법은 높은 광학 순도를 갖는 D-락트산을 높은 생산성 및 수득율로 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 방법은 용이하게 수행될 수 있고, 복잡한 단계를 줄일 수 있다.

도 1은 미생물 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 2는 미생물 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주의 형태를 나타낸다.
도 3은 미생물 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주의 포지티브 카탈라제 테스트 (positive catalase test)를 나타낸다.

정의

본원에 사용된 기술 용어 또는 과학 용어는 달리 언급하지 않는 한, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 정의를 갖는다.

본원에 언급된 수단, 장치, 방법, 또는 화학물질은, 본 발명에서 구체적으로 수단, 장치, 방법, 또는 화학물질을 달리 명시하지 않는 한, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 수행되거나 또는 사용되는 수단, 장치, 방법, 또는 화학물질을 의미한다.

청구범위 또는 명세서에서 "포함하는 (comprising)"이라는 용어를 갖는 단수 명사 또는 단수 대명사의 사용은 "하나" 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"를 나타낸다.

본 출원에서, 용어 "약 (about)"은 본원에서 제시되거나 또는 나타낸 임의의 값이 물리적 특성의 변화로부터 야기되는 변동 또는 편차를 포함하는 개별 작업자 구현 장치 또는 방법으로부터 변동 및 편향될 수 있음을 나타내기 위해 사용된다.

"사탕수수 주스 (sugarcane juice)"는 사탕수수 압착 과정으로부터 수득되는, 다른 가공을 포함하거나 또는 포함하지 않은 산물을 나타낸다. 상기 산물은 이에 한정되는 것은 아니지만, 당, 전분, 유기산, 폴리페놀, 단백질, 아미노산, 파이버, 클로로필, 황산 회분 (sulfated ash), 검, 왁스, 실리카의 SiO₂ 형태, 포스페이트의 P₂O₅ 형태, 칼슘의 CaO 형태, 칼륨의 K₂O 형태, 마그네슘의 MgO 형태, 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다.

당은 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 또는 그의 혼합물로부터 선택되는 1분자 당 (monomolecular sugar); 수크로스, 락토스, 말토스, 셀로비오스, 또는 그의 혼합물로부터 선택되는 2분자 당 (dimolecular sugar); 라피노스, 이소말토트리오스, 말토트리오스, 니게로트리오스 (nigerotriose), 케스토스 (kestose), 또는 그의 혼합물로부터 선택되는 트리사카라이드 (trisaccharide)일 수 있다.

본 발명에서, 사탕수수 주스는, 사탕수수 주스를 농축 과정으로 처리하여 수득되는 산물을 포함하는 사탕수수 주스로부터 수득되는 용액을 나타낸다. 사탕수수 주스로부터 수득된 용액의 예로는, 증발시켜서 고농도로 불리우는 고도의 당밀 및 사탕수수 주스에서 당의 침전으로부터 얻어지는 산물을 수득하고, 그 다음에 상기 침전물을 물에 다시 재용해시킨 용액이 있다.

"미세호기성 조건 (microaerobic condition)"은 기존의 공기를 대체하기 위해 공기의 부가 또는 비활성 기체의 부가에 관계 없이 임의의 추가의 기체를 부가하지 않고 공기의 양이 제한되도록 제어되는 조건을 나타낸다.

이후에, 본 발명의 구체예는 본 발명의 범위를 제한하려는 목적 없이 개시된다.

본 발명은 D-락트산 또는 그의 염을 생산하기 위한 발효 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계:

(a) 사탕수수 주스에서 미생물 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실 루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주를 배양하여 시드 배양물을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)로부터 수득된 시드 배양물을 사탕수수 주스에서 발효시키는 단계를 포함하고;

상기 단계 (a)에서 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 균주의 최종 농도가 1 리터당 건조 세포 약 400 내지 1,600 mg, 바람직하게는 1 리터당 건조 세포 약 1,000 내지 1,400 mg의 범위가 되는 시간 동안 상기 단계 (a)를 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 단계 (a)는 호기성 조건하에 수행된다.

본 발명의 일 구체예에서, 단계 (a)는 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 균주의 개시 농도를 1 리터당 건조 세포 약 40 내지 240 mg의 범위, 바람직하게는 1 리터당 건조 세포 약 120 내지 160 mg의 범위로 갖는다.

본 발명의 일 구체예에서, 단계 (b)는 약 12 내지 50 시간 범위, 바람직하게는 약 45 내지 50 시간 범위의 시간 동안 수행된다.

본 발명의 일 구체예에서, 단계 (b)에서 사탕수수 주스는, 단계 (b)에서 당 농도가 약 4 내지 15 부피% 범위가 되는 당을 포함하고, 상기 사탕수수 주스는 가공된 또는 미-가공된 사탕수수 주스로부터 수득되는 사탕수수 주스일 수 있다.

일 구체예에서, 단계 (a) 및 (b)는 약 35 내지 40 ℃ 범위의 온도에서 수행되고, 바람직하게는 약 37 ℃의 온도에서 수행된다.

일 구체예에서, 단계 (a) 및 (b)는 진탕기 (shaker) 혼합 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 단계 (a)에서 진탕기 혼합 속도는 10 내지 1,200 rpm의 범위일 수 있고, 상기 단계 (b)에서 진탕기 혼합 속도는 10 내지 1,200 rpm의 범위일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 발효 방법으로부터 수득된 D-락트산 또는 그의 염은 95 % 이상의 광학 순도, 더 바람직하게는 99 % 이상의 광학 순도를 갖는다.

본 발명에 따른 적합한 미생물

본 발명에 따른 적합한 미생물은 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주, 구체적으로 일본 NITE 특허 미생물 기탁기관 (NPMD)에 기탁된, 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주이다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스는 30 ℃ 이상의 온도에서 호기성 조건 하에 성장할 수 있고, D-락트산 또는 그의 염을 높은 광학 순도로 생산할 수 있다.

바람직하게, 상기 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스는 30 내지 42 ℃ 범위의 온도에서 호기성 조건하에 성장할 수 있고, D-락트산 또는 그의 염을 95 % 이상의 광학 순도로 생산할 수 있다.

가장 바람직하게, 상기 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스는 약 37 ℃ 온도에서 호기성 조건하에 성장할 수 있고, D-락트산 또는 그의 염을 99 % 이상의 광학 순도로 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스는 도 1에 개시된 바와 같이 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 도 2에 개시된 바와 같은 형태를 나타내고, 도 3에 개시된 바와 같이 카탈라제 테스트에서 양성인, 그람-양성 박테리아이다.

스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주의 배양 및 D-락트산을 생산하기 위해 사탕수수 주스로부터 제조된 시드 배양물의 발효

하기는 본 발명에 따른 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주의 배양 및 D-락트산의 생산을 위한 사탕수수 주스로부터 제조된 시드 배양물의 발효의 예이다. 상기 예는 본 발명의 목적을 입증하기 위한 것으로, 본 발명은 어떠한 방법으로도 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 각 특성의 결정은 하기에 설명되는 바와 같은 방법 및 장치에 의해 수행되었고, 각 테스트 방법 및 장치는 통상적으로 사용되는 방법 및 장치이고, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

당, 락트산, 및 부산물의 양은 50 ℃의 온도에서 Biorad 컬럼, Aminex HPX-87H 이온 배제 유기산 300 mm x 7.8 mm가 구비된 고성능 액체 크로마토그래피 (Agilent Technology)를 사용하여 결정되었다. 사용된 검출기는 표준 용액에 대한 신호 장치와 비교되는 굴절율 검출기 (Agilent Technology)이다.

광학 순도는 40 ℃의 온도에서 키랄 컬럼 (Sumipack, Sumichiral OA5000)을 사용하여 결정되었다. 황산구리 (CuSO₄)를 용출액으로 사용하였다. 유속은 1 mL/분이다. 신호는 254 nm의 파장에서 UV 검출기에 의해 검출되었다.

배양 또는 발효 중에 광학 밀도 (optical density: OD)는 600 nm의 파장에서 분광광도계에 의해 결정되었다.

수득율은 발효 중에 사용된 당에 대해 생산된 락트산 사이의 비율로부터 산출되었다.

실시예 1: 배양 및 발효 단계가 진탕기 혼합을 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 사용한 D-락트산의 생산

배양 단계에서 사용된 미생물 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주의 준비는, 상기 박테리아를 1 리터당 하기 조성을 갖는 고체 배지에 첨가하여 수행될 수 있다: 약 10 g의 수크로스, 약 15 g의 효모 추출물, 약 4 g의 암모늄 클로리드 (NH₄Cl), 약 0.25 g의 디포타슘 포스페이트 (K₂HPO₄), 약 0.25 g의 디히드로겐 포스페이트 (KH₂PO₄), 약 5 g의 칼슘 카르보네이트 (CaCO₃), 약 5 g의 마그네슘 술페이트 (MgSO₄), 약 400 mg의 망간 술페이트 (MnSO₄), 약 20 mg의 페로스 술페이트 (ferrous sulfate), 약 20 mg의 소듐 클로리드 (NaCl), 및 약 20 g의 아가 (agar). 상기 믹서를 약 37 ℃에서 약 24시간 동안 인큐베이트하였다.

시드 배양물을 생산하기 위한 배양은, 상기 박테리아를 약 0.5 - 2 %의 소듐 클로리드 (NaCl) 용액을 갖는 상기 고체 배지에서 희석시켜서, 박테리아 세포 1 리터당 건조 세포 약 12,000 내지 16,000 mg을 수득함으로써 수행될 수 있다. 그 다음에, 상기 희석된 박테리아 약 250 μL를, 약 1 중량%의 당 농도를 갖는, 25 L의 사탕수수 주스, 약 0.38 g의 효모 추출물, 약 0.10 g의 암모늄 클로리드, 약 6.25 mg의 디포타슘 포스페이트, 약 6.25 mg의 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 약 0.13 g의 칼슘 카르보네이트, 약 10 mg의 마그네슘 술페이트, 약 0.5 mg의 망간 술페이트, 약 0.5 mg의 페로스 술페이트, 및 약 0.5 mg의 염을 포함하는 250 mL 플라스크에 첨가하였다. 상기 단계에 따라, 1 리터당 건조 세포 약 120 - 160 mg의 박테리아 세포의 개시 농도가 수득될 수 있다. 그 다음에, 호기성 조건하에 약 37 ℃ 온도에서 시드 배양물을 수득하기 위한 배양이 수행되었다. 상기 진탕기 혼합 속도는, 박테리아 세포의 최종 농도가 1 리터당 건조 세포 약 1,000 내지 1,400 mg이 될 때까지 약 5시간 동안 약 200 rpm이었다.

그 후, 상기 시드 배양물은, 약 20 중량%의 당 농도를 갖는 약 25 mL의 사탕수수 주스를 첨가하여 발효되었다. pH는 칼슘 카르보네이트로 약 5.5 내지 6.5가 되도록 조절되었다. 약 37 ℃의 온도에서 미세호기성 조건하에 발효가 수행되었다. 진탕기 혼합 속도는 약 48시간 동안 약 250 rpm이었다.

실시예 2: 배양 단계가 진탕기 혼합 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 방법에 의한 D-락트산의 생산

시드 배양물이 실시예 1에 개시된 바와 같은 방법에 따라 제조되었다. 그 후, 상기 시드 배양물은 진탕기 혼합 없이 실시예 1에 개시된 바와 같은 방법에 따라 발효되었다.

실시예 3: 배양 및 발효 단계가 진탕기 혼합 단계를 포함하고, 상기 발효는 5 L 발효기에서 수행되는, 본 발명에 따른 방법에 의한 D-락트산의 생산

시드 배양물을 생산하기 위한 배양은 상기 박테리아를, 약 0.5 - 2 %의 소듐 클로리드 (NaCl) 용액을 갖는 실시예 1에 개시된 단계로부터 수득된 고체 배지에서 희석하여, 박테리아 세포 1 리터당 건조 세포 약 12,000 내지 16,000 mg의 농도를 수득함으로써 수행될 수 있다. 그 다음에, 상기 희석된 박테리아 약 750 μL를, 약 1 중량%의 당 농도를 갖는 75 L의 사탕수수 주스, 약 1.14 g의 효모 추출물, 약 0.30 g의 암모늄 클로리드, 약 18.75 mg의 디포타슘 포스페이트, 약 18.75 mg의 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 약 0.39 g의 칼슘 카르보네이트, 약 30 mg의 마그네슘 술페이트, 약 1.50 mg의 망간 술페이트, 약 1.50 mg의 페로스 술페이트, 및 약 1.50 mg의 염을 포함하는 500 mL 플라스크에 첨가하였다. 상기 단계에 따라, 1 리터당 건조 세포 약 120 - 160 mg의 박테리아 세포의 개시 농도가 수득될 수 있다. 그 다음에 약 37 ℃의 온도에서 세포 배양물을 수득하기 위한 배양이 수행되었다. pH는 칼슘 카르보네이트로 호기성 조건하에 약 5.5 내지 6.5가 되도록 조절되었다. 진탕기 혼합 속도는, 박테리아 세포의 최종 농도가 1 리터당 건조 세포 약 1,000 내지 1,400 mg이 될 때까지 약 200 rpm이었다. 그 후에, 수득된 용액을, 약 1 중량%의 당 농도를 갖는 약 1.5 L의 사탕수수 주스, 약 22.5 g의 효모 추출물, 약 6.0 g의 암모늄 클로리드, 약 0.38 g의 디포타슘 포스페이트, 약 0.38 g의 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 약 7.5 g의 칼슘 카르보네이트, 약 600 mg의 마그네슘 술페이트, 약 30 mg의 망간 술페이트, 약 30 mg의 페로스 술페이트, 및 약 30 mg의 염을 포함하는, 5 L 발효기로 첨가하였다. 그 후에, 상기 박테리아를 약 37 ℃의 온도에서 배양하였고, pH를 칼슘 카르보네이트로 호기성 조건하에 약 5.5 내지 6.5가 되도록 조절하였다. 공기는 1.5 L/분의 속도로 부가하였다. 진탕기 혼합 속도는, 박테리아 세포의 농도가 1 리터당 건조 중량 약 1,000 내지 1,400 mg이 될 때까지 약 300 rpm이었다.

그 후에, 상기 단계들로부터 제조된 시드 배양물을, 약 20 중량%의 당 농도를 갖는 약 1.5 L의 사탕수수 주스를 첨가하여 발효시켰다. pH는 칼슘 카르보네이트로 약 5.5 내지 6.5가 되도록 조절하였다. 발효는 약 37 ℃의 온도에서 미세호기성 조건하에 수행되었다. 진탕기 혼합 속도는 약 45시간 동안 약 300 rpm이었다.

표 1은 본 발명에 따른 사탕수수 주스와의 발효 공정으로 미생물 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 박테리아 균주의 D-락트산 생산을 보여주었다.

실시예	최대 세포 농도 (g/L)	D-락트산의 양 (g/L)	수득율 (g/L)	잔류하는 당 (g/L)	D-락트산의 광학 순도
실시예 1	4.4	70	0.9	13.7	98%
실시예 2	2.9	82	0.9	14.3	99%
실시예 3	2.7	117	1.0	15.95	99%

상기 표 1로부터, 사탕수수 주스와 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스의 배양을 수행하고, 수득된 시드 배양물을 본 발명에 따른 방법으로 발효시키는 실시예 1, 2, 및 3은 양호한 D-락트산을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 즉, D-락트산의 최대량은 약 117 g/L, 개시하는 당에 대한 최대 수득율은 약 1.0 g/g, 수득된 D-락트산의 광학 순도는 약 99 %로 제공되었다.

본 발명의 최선의 형태

본 발명의 최선의 형태는 상세한 설명에 개시된 바와 같다.

NITE Patent Microorganisms Depositary National Institute of Technology and Evaluation

NITEABP-02334

20160819

Claims

D-락트산 또는 그의 염을 생산하기 위한 발효 방법으로서,
(a) 사탕수수 주스에서 미생물 수탁 번호 NITE ABP-02334의 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 (Sporolactobacillus laevolacticus) 박테리아 균주를 배양하여 (cultivating) 시드 배양물 (seed culture)을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)로부터 수득된 시드 배양물을 사탕수수 주스에서 발효시키는 (fermenting) 단계를 포함하고;
상기 단계 (a)에서 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 균주의 최종 농도가 1 리터당 건조 세포 400 내지 1,600 mg의 범위가 되는 시간 동안 상기 단계 (a)를 수행하는 것을 특징으로 하는 발효 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (a)에서 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 균주의 최종 농도가 1 리터당 건조 세포 1,000 내지 1,400 mg의 범위에 있는 것인 발효 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 단계 (a)는 호기성 조건 (aerobic condition)하에 수행되는 것인 발효 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 스포로락토바실 루스 라에볼락티쿠스 균주의 개시 농도를 1 리터당 건조 세포 40 내지 240 mg 범위로 갖는 것인 발효 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 단계 (a)는 스포로락토바실루스 라에볼락티쿠스 균주의 개시 농도를 1 리터당 건조 세포 120 내지 160 mg 범위로 갖는 것인 발효 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (b)는 미세호기성 조건 (mircoaerobic condition)하에 수행되는 것인 발효 방법.
청구항 1 또는 6에 있어서, 상기 단계 (b)는 12 내지 50 시간 범위의 시간 동안 수행되는 것인 발효 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 단계 (b)는 45 내지 50 시간 범위의 시간 동안 수행되는 것인 발효 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (b)에서 사탕수수 주스는, 단계 (b)에서 당 (sugar) 농도가 4 내지 15 부피% 범위가 되는 당을 포함하는 것인 발효 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)는 35 내지 40 ℃ 범위의 온도에서 수행되는 것인 발효 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)는 37 ℃의 온도에서 수행되는 것인 발효 방법.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D-락트산 또는 그의 염은 95 % 이상의 광학 순도 (optical purity)를 갖는 것인 발효 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 D-락트산 또는 그의 염은 99 % 이상의 광학 순도를 갖는 것인 발효 방법.