JP2003088392A - Ｄ−乳酸の製造方法 - Google Patents
Ｄ−乳酸の製造方法Info
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- JP2003088392A JP2003088392A JP2001279110A JP2001279110A JP2003088392A JP 2003088392 A JP2003088392 A JP 2003088392A JP 2001279110 A JP2001279110 A JP 2001279110A JP 2001279110 A JP2001279110 A JP 2001279110A JP 2003088392 A JP2003088392 A JP 2003088392A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】安価にＤ−乳酸を製造する。
【解決手段】資化可能な炭素源から光学純度９０％以上
のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス属（Bacill
us）に属する微生物を３１〜４５℃で培養する。培養条
件として、二酸化炭素、窒素あるいはアルゴンを通気し
ながら嫌気的条件下で行い、水酸化ナトリウム、炭酸ナ
トリウム、重炭酸ナトリウムあるいはアンモニアでpH4.
5〜7.0に維持し、発酵培地中の酵母エキス濃度0.1%以上
0.5%未満の低濃度で培養する。この培養物から高収率、
高光学純度かつ高化学純度でＤ−乳酸を採取する。
のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス属（Bacill
us）に属する微生物を３１〜４５℃で培養する。培養条
件として、二酸化炭素、窒素あるいはアルゴンを通気し
ながら嫌気的条件下で行い、水酸化ナトリウム、炭酸ナ
トリウム、重炭酸ナトリウムあるいはアンモニアでpH4.
5〜7.0に維持し、発酵培地中の酵母エキス濃度0.1%以上
0.5%未満の低濃度で培養する。この培養物から高収率、
高光学純度かつ高化学純度でＤ−乳酸を採取する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法による高純
度D-乳酸の安価な製造方法に関する。より詳しくは、資
化可能な炭素源から光学純度９０％以上のＤ-乳酸を生
産する能力を有するバシラス属に属する微生物を用いて
D-乳酸を製造するにあたり、培養液を水酸化ナトリウ
ム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムあるいはアンモ
ニアでpH4.5〜7.0に維持し、二酸化炭素、窒素、アンモ
ニアあるいはアルゴンを通気しながら嫌気的条件下で行
う。発酵温度を33℃以上45℃以下で行うことにより乳酸
生産速度を増加させなおかつ収率を向上させ、培地中の
酵母エキス濃度を0.1%以上0.5%未満の低濃度で培養する
ことで、D-乳酸のコストを下げなおかつ化学純度を上げ
ることにより乳酸精製を容易にする。高収率、高光学純
度、高化学純度でD-乳酸を安価に製造する方法に関す
る。
度D-乳酸の安価な製造方法に関する。より詳しくは、資
化可能な炭素源から光学純度９０％以上のＤ-乳酸を生
産する能力を有するバシラス属に属する微生物を用いて
D-乳酸を製造するにあたり、培養液を水酸化ナトリウ
ム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムあるいはアンモ
ニアでpH4.5〜7.0に維持し、二酸化炭素、窒素、アンモ
ニアあるいはアルゴンを通気しながら嫌気的条件下で行
う。発酵温度を33℃以上45℃以下で行うことにより乳酸
生産速度を増加させなおかつ収率を向上させ、培地中の
酵母エキス濃度を0.1%以上0.5%未満の低濃度で培養する
ことで、D-乳酸のコストを下げなおかつ化学純度を上げ
ることにより乳酸精製を容易にする。高収率、高光学純
度、高化学純度でD-乳酸を安価に製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】D-乳酸は、生分解性プラスチックである
ポリ乳酸の原料、農薬や医薬原料等に用いられる。
ポリ乳酸の原料、農薬や医薬原料等に用いられる。
【０００３】乳酸をポリ乳酸の原料として用いる場合、
光学純度の高い乳酸を原料とする方が、結晶性の高いポ
リマーが得られる。このことは例えば、ジャーナル オ
ブバイオメディカルマテリアル リサーチ, 5:169-181
(1971).に記載されている。そして、結晶性の高いポリ
乳酸は、延伸フィルム、紡糸に適している。
光学純度の高い乳酸を原料とする方が、結晶性の高いポ
リマーが得られる。このことは例えば、ジャーナル オ
ブバイオメディカルマテリアル リサーチ, 5:169-181
(1971).に記載されている。そして、結晶性の高いポリ
乳酸は、延伸フィルム、紡糸に適している。
【０００４】このように、D-乳酸は有用であり、しかも
高光学純度、高化学純度かつ安価であることが要求され
ている。
高光学純度、高化学純度かつ安価であることが要求され
ている。
【０００５】従来から、発酵によりD-乳酸を製造する方
法が知られている。例えば（1）ラクトバシラス・ブル
ガリカス（Lactobacillus bulgaricus）を用いたD-乳酸
の製造が、米国特許第 5322781号公報に記載されてい
る。（2）ラクトバシラス・ラクティス（Lactobacillus
lactis）を用いたD-乳酸の製造が、特開平2-076592号
公報に記載されている。
法が知られている。例えば（1）ラクトバシラス・ブル
ガリカス（Lactobacillus bulgaricus）を用いたD-乳酸
の製造が、米国特許第 5322781号公報に記載されてい
る。（2）ラクトバシラス・ラクティス（Lactobacillus
lactis）を用いたD-乳酸の製造が、特開平2-076592号
公報に記載されている。
【０００６】また、バシラス属に属する微生物がD-乳酸
を生産することは知られている。例えば、バシラス・ラ
エボラクティカスが挙げられる。このことは、ジャーナ
ルオブ ジェネラル アプライド マイクロバイオロジ
ー,13:139-153(1967)に記載されている。この微生物の
適温は30℃であると知られている。また、バシラス属に
属する微生物がL-乳酸を生産することも知られている。
例えば、バシラス・コアグランスが挙げられる。このこ
とは、特開平58-40093号公報、特公昭60-6200号公報に
記載されている。
を生産することは知られている。例えば、バシラス・ラ
エボラクティカスが挙げられる。このことは、ジャーナ
ルオブ ジェネラル アプライド マイクロバイオロジ
ー,13:139-153(1967)に記載されている。この微生物の
適温は30℃であると知られている。また、バシラス属に
属する微生物がL-乳酸を生産することも知られている。
例えば、バシラス・コアグランスが挙げられる。このこ
とは、特開平58-40093号公報、特公昭60-6200号公報に
記載されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記（1）〜（2）は乳
酸菌を用いたD-乳酸の製造法である。しかし、これらの
乳酸菌は栄養要求性が高く、培地がコスト高となる。培
地がコスト高となる原因は、高価な材料である酵母エキ
スが0.5%以上添加されているためであり、そのために発
酵製品であるD-乳酸が高価なものとなる。（２）は、そ
の問題を回避するために他の栄養源として魚タンパク質
加水分解生成物や濃縮トウモロコシを加えるといった試
みである。しかし、それら酵母エキス以外の栄養源は、
品質が優れていないため多量に添加する必要が生じてし
まう。また栄養源として添加されるそれら化合物が不純
物として、乳酸精製工程に悪影響を及ぼしてしまう。
酸菌を用いたD-乳酸の製造法である。しかし、これらの
乳酸菌は栄養要求性が高く、培地がコスト高となる。培
地がコスト高となる原因は、高価な材料である酵母エキ
スが0.5%以上添加されているためであり、そのために発
酵製品であるD-乳酸が高価なものとなる。（２）は、そ
の問題を回避するために他の栄養源として魚タンパク質
加水分解生成物や濃縮トウモロコシを加えるといった試
みである。しかし、それら酵母エキス以外の栄養源は、
品質が優れていないため多量に添加する必要が生じてし
まう。また栄養源として添加されるそれら化合物が不純
物として、乳酸精製工程に悪影響を及ぼしてしまう。
【０００８】一般的にバシラス属は乳酸菌よりも栄養要
求生が少ないことが知られており、バシラス属に属する
微生物がD-乳酸を生産することが知られていた。しか
し、そのD-乳酸生産性はこれら乳酸菌よりも劣っている
と考えられていた。そのためD-乳酸生産条件等について
は全く知られていなかった。
求生が少ないことが知られており、バシラス属に属する
微生物がD-乳酸を生産することが知られていた。しか
し、そのD-乳酸生産性はこれら乳酸菌よりも劣っている
と考えられていた。そのためD-乳酸生産条件等について
は全く知られていなかった。
【０００９】そこで、本発明の目的は、従来技術の問題
点を解決すべく、バシラス属に属する微生物を用いてD-
乳酸をより安価に製造する方法を提供することにある。
点を解決すべく、バシラス属に属する微生物を用いてD-
乳酸をより安価に製造する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、資化可能な炭
素源から光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力
を有するバシラス（Bacillus）属に属する微生物を３３
℃以上４５℃以下で嫌気培養し、この培養物からＤ−乳
酸を単離精製することを特徴とするＤ-乳酸の製造方法
である。
素源から光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能力
を有するバシラス（Bacillus）属に属する微生物を３３
℃以上４５℃以下で嫌気培養し、この培養物からＤ−乳
酸を単離精製することを特徴とするＤ-乳酸の製造方法
である。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳しく説明
する。
する。
【００１２】本発明において用いることのできる微生物
としては、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能
力を有するバシラス属に属するD-乳酸生産菌であればい
かなる微生物でもよく、好ましくは、バシラス・ラエボ
ラクティカスが使用できる。さらに好ましくは、バシラ
ス・ラエボラクティカス ATCC 23492、ATCC 23493、ATC
C 23494、ATCC 23495、ATCC 23496、ATCC 223549、IAM
12326、IAM 12327、IAM 12328、IAM 12329、IAM 1233
0、IAM 12331、IAM 12379、DSM 2315、DSM6477、DSM 65
10、DSM 6511、DSM 6763、DSM 6764、DSM 6771などが挙
げられる。
としては、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する能
力を有するバシラス属に属するD-乳酸生産菌であればい
かなる微生物でもよく、好ましくは、バシラス・ラエボ
ラクティカスが使用できる。さらに好ましくは、バシラ
ス・ラエボラクティカス ATCC 23492、ATCC 23493、ATC
C 23494、ATCC 23495、ATCC 23496、ATCC 223549、IAM
12326、IAM 12327、IAM 12328、IAM 12329、IAM 1233
0、IAM 12331、IAM 12379、DSM 2315、DSM6477、DSM 65
10、DSM 6511、DSM 6763、DSM 6764、DSM 6771などが挙
げられる。
【００１３】光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産する
能力を有するバシラス属は、培地中の成分の９０％以上
が資化可能な炭素源であり、なおかつ乳酸が含まれてい
ない培養液で、バシラス属に属するＤ-乳酸生産菌の適
温で、嫌気的条件下で、炭酸カルシウムにより中和しな
がら培養し、資化可能な炭素源が完全に消費された後の
培養液中に生産された乳酸の光学純度が９０％以上であ
ればよい。
能力を有するバシラス属は、培地中の成分の９０％以上
が資化可能な炭素源であり、なおかつ乳酸が含まれてい
ない培養液で、バシラス属に属するＤ-乳酸生産菌の適
温で、嫌気的条件下で、炭酸カルシウムにより中和しな
がら培養し、資化可能な炭素源が完全に消費された後の
培養液中に生産された乳酸の光学純度が９０％以上であ
ればよい。
【００１４】例えば、Ｄ-乳酸を製造したときに以下の
ような方法で、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産す
る能力を有するバシラス属であるか判断できる。滅菌し
たグルコース100g/l、酵母エキス5g/l、硫酸マグネシウ
ム0.2g/l、硫酸第二鉄0.01g/l、硫酸マンガン0.01g/l、
塩化ナトリウム0.01g/l、炭酸カルシウム60g/lの培養液
にバシラス属に属する微生物を接種し、37℃で、静置培
養を行う。経時的に培養液中のグルコース濃度を測定
し、グルコースが完全に消費された後の培養液中に生産
された乳酸の光学純度を測定する。Ｄ-乳酸の光学純度
が９０％以上であれば、光学純度９０％以上のＤ-乳酸
を生産する能力を有する微生物であると判断することが
できる。またここで資化可能な炭素源とは、例えばグル
コース、フラクトース、ガラクトース、アラビノース、
セルビオース、ラクトース、メリビオース、サリシン、
マンニトール、ソルビトール、シュークロース、イヌリ
ン、マルトース、マンノース、ラフィノース、トレハロ
ース、スターチ等の糖類、あるいは澱粉加水分解物、糖
蜜が挙げられる。さらに好ましくは、グルコース、マン
ノース、フラクトース、スクロース、トレハロース、イ
ヌリン、スターチが挙げられる。
ような方法で、光学純度９０％以上のＤ−乳酸を生産す
る能力を有するバシラス属であるか判断できる。滅菌し
たグルコース100g/l、酵母エキス5g/l、硫酸マグネシウ
ム0.2g/l、硫酸第二鉄0.01g/l、硫酸マンガン0.01g/l、
塩化ナトリウム0.01g/l、炭酸カルシウム60g/lの培養液
にバシラス属に属する微生物を接種し、37℃で、静置培
養を行う。経時的に培養液中のグルコース濃度を測定
し、グルコースが完全に消費された後の培養液中に生産
された乳酸の光学純度を測定する。Ｄ-乳酸の光学純度
が９０％以上であれば、光学純度９０％以上のＤ-乳酸
を生産する能力を有する微生物であると判断することが
できる。またここで資化可能な炭素源とは、例えばグル
コース、フラクトース、ガラクトース、アラビノース、
セルビオース、ラクトース、メリビオース、サリシン、
マンニトール、ソルビトール、シュークロース、イヌリ
ン、マルトース、マンノース、ラフィノース、トレハロ
ース、スターチ等の糖類、あるいは澱粉加水分解物、糖
蜜が挙げられる。さらに好ましくは、グルコース、マン
ノース、フラクトース、スクロース、トレハロース、イ
ヌリン、スターチが挙げられる。
【００１５】光学純度を測定する方法は、従来より知ら
れているいかなる方法によってでも行うことができる。
例えば、乳酸の全量が0.2 g/lになるように試料を1mM硫
酸銅水溶液で調整し、この溶液0.01 mlを以下の条件の
カラムにインジェクトし、HPLC法により測定できる。
れているいかなる方法によってでも行うことができる。
例えば、乳酸の全量が0.2 g/lになるように試料を1mM硫
酸銅水溶液で調整し、この溶液0.01 mlを以下の条件の
カラムにインジェクトし、HPLC法により測定できる。
【００１６】カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社
製） 溶媒 ：1mM 硫酸銅水溶液 流速 ：1.0ml/min 検出 ：UV254nm 温度 ：30℃ また、D-乳酸の光学純度は次式で計算すればよい。 光学純度（%）＝100×（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ） ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表
す。
製） 溶媒 ：1mM 硫酸銅水溶液 流速 ：1.0ml/min 検出 ：UV254nm 温度 ：30℃ また、D-乳酸の光学純度は次式で計算すればよい。 光学純度（%）＝100×（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ） ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表
す。
【００１７】従来バシラス・ラエボラクティカスの発酵
温度における適温は30℃であると知られていた。しかし
ながら、Ｄ-乳酸生産性における適温は33℃以上45℃以
下であり、これら温度で発酵を行うことにより、乳酸生
産速度および収率が向上することにより、より安価にＤ
−乳酸を製造できる。発酵温度は、さらに好ましくは３
５℃以上４５℃以下である。
温度における適温は30℃であると知られていた。しかし
ながら、Ｄ-乳酸生産性における適温は33℃以上45℃以
下であり、これら温度で発酵を行うことにより、乳酸生
産速度および収率が向上することにより、より安価にＤ
−乳酸を製造できる。発酵温度は、さらに好ましくは３
５℃以上４５℃以下である。
【００１８】バシラス属に属するＤ−乳酸生産菌はまず
通常の回分発酵法における操作と同様の操作で前培養を
行い種菌を調整する。つまりは表−１に示した滅菌した
ＧＹＰ培地などで培養し、Ｄ−乳酸生産菌の生育が十分
に達したら順次培養液量を増加させＤ−乳酸発酵培地の
種菌を調整する。この場合、培養液量の増加は10倍から
1000倍程度で増加させればよい。
通常の回分発酵法における操作と同様の操作で前培養を
行い種菌を調整する。つまりは表−１に示した滅菌した
ＧＹＰ培地などで培養し、Ｄ−乳酸生産菌の生育が十分
に達したら順次培養液量を増加させＤ−乳酸発酵培地の
種菌を調整する。この場合、培養液量の増加は10倍から
1000倍程度で増加させればよい。
【００１９】
【表１】
【００２０】このようにして順次培養液量を増加させて
得た種菌を用い、滅菌したＤ−乳酸発酵培地でＤ−乳酸
を生産すればよい。
得た種菌を用い、滅菌したＤ−乳酸発酵培地でＤ−乳酸
を生産すればよい。
【００２１】培地の滅菌方法は、従来より知られている
いかなる方法によってでも行うことができる。例えば、
１２０℃、２０分間オートクレイブ滅菌すればよい。オ
ートクレイブ滅菌の際に培地成分が化学反応し組成が変
化する恐れのある場合には、別々にオートクレイブ滅菌
すればよい。例えば、グルコースと他の培地成分は別々
にわけてオートクレイブ滅菌するほうが好ましい。
いかなる方法によってでも行うことができる。例えば、
１２０℃、２０分間オートクレイブ滅菌すればよい。オ
ートクレイブ滅菌の際に培地成分が化学反応し組成が変
化する恐れのある場合には、別々にオートクレイブ滅菌
すればよい。例えば、グルコースと他の培地成分は別々
にわけてオートクレイブ滅菌するほうが好ましい。
【００２２】最終的な発酵培地での培養は好気的条件下
で行うこともできるが、嫌気的条件下で行うことが好ま
しい。バシラス属は好気性または通性好気性の微生物で
あり、通常、通気等を行うことにより好気的条件下で培
養する。この様な好気的条件下では、グルコース等の糖
はピルビン酸からクレブス回路を経て代謝される。その
ため好気的条件下では、収率が著しく低下する。本発明
ではバシラス属の微生物を嫌気的条件下で培養すること
により、ピルビン酸からＤ−乳酸を、より高収率で得る
ことができる。嫌気的条件下で培養を行うためには、静
置して行うこともできるが、不活性ガスを通気しながら
行うことが好ましい。不活性ガスとしては、二酸化炭
素、窒素、アンモニア、アルゴン等を用いればよく、通
気量、通気手段はＤ−乳酸生産性を考え適宜決めればよ
い。。
で行うこともできるが、嫌気的条件下で行うことが好ま
しい。バシラス属は好気性または通性好気性の微生物で
あり、通常、通気等を行うことにより好気的条件下で培
養する。この様な好気的条件下では、グルコース等の糖
はピルビン酸からクレブス回路を経て代謝される。その
ため好気的条件下では、収率が著しく低下する。本発明
ではバシラス属の微生物を嫌気的条件下で培養すること
により、ピルビン酸からＤ−乳酸を、より高収率で得る
ことができる。嫌気的条件下で培養を行うためには、静
置して行うこともできるが、不活性ガスを通気しながら
行うことが好ましい。不活性ガスとしては、二酸化炭
素、窒素、アンモニア、アルゴン等を用いればよく、通
気量、通気手段はＤ−乳酸生産性を考え適宜決めればよ
い。。
【００２３】Ｄ−乳酸発酵培地の組成は、用いるバシラ
ス属に適した培地を用いればよいが、基本的にはグルコ
ース、フラクトース、ガラクトース、アラビノース、セ
ルビオース、ラクトース、メリビオース、サリシン、マ
ンニトール、ソルビトール、シュークロース、イヌリ
ン、マルトース、マンノース、ラフィノース、トレハロ
ース、スターチ等の糖類、あるいは澱粉加水分解物、糖
蜜のようにこれらの糖類を含有するもののうち一種類及
び二種類以上に対し、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸第一カルシウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガ
ン、塩化ナトリウム等の無機塩類を必要に応じて加え、
増殖促進成分として酵母エキス、ペプトン、肉エキス、
大豆粉の成分を添加するのが好ましい。乳酸生産菌は一
般に多くの栄養要求性を示すために、これら増殖促進成
分の添加が好ましい。
ス属に適した培地を用いればよいが、基本的にはグルコ
ース、フラクトース、ガラクトース、アラビノース、セ
ルビオース、ラクトース、メリビオース、サリシン、マ
ンニトール、ソルビトール、シュークロース、イヌリ
ン、マルトース、マンノース、ラフィノース、トレハロ
ース、スターチ等の糖類、あるいは澱粉加水分解物、糖
蜜のようにこれらの糖類を含有するもののうち一種類及
び二種類以上に対し、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸第一カルシウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガ
ン、塩化ナトリウム等の無機塩類を必要に応じて加え、
増殖促進成分として酵母エキス、ペプトン、肉エキス、
大豆粉の成分を添加するのが好ましい。乳酸生産菌は一
般に多くの栄養要求性を示すために、これら増殖促進成
分の添加が好ましい。
【００２４】従来、高価な材料である酵母エキスが培地
中に0.5%以上添加されており、発酵製品であるＤ−乳酸
のコストに影響を与え、乳酸の精製工程に悪影響を及ぼ
していた。
中に0.5%以上添加されており、発酵製品であるＤ−乳酸
のコストに影響を与え、乳酸の精製工程に悪影響を及ぼ
していた。
【００２５】しかしながら、バシラス属に属する微生物
では酵母エキスが０．１％以上０．５％未満の濃度でも
Ｄ−乳酸生産性に影響を及ぼさず、より安価にＤ−乳酸
を製造することができる。酵母エキスの濃度はさらに好
ましくは0.2%以上0.4%以下である。
では酵母エキスが０．１％以上０．５％未満の濃度でも
Ｄ−乳酸生産性に影響を及ぼさず、より安価にＤ−乳酸
を製造することができる。酵母エキスの濃度はさらに好
ましくは0.2%以上0.4%以下である。
【００２６】発酵液のpHは乳酸の生産に伴い徐々に低下
する。バシラス属のＤ−乳酸生産菌は酸感受性を有する
ため、中和剤でpHを4.5以上7.0以下に保つのが好まし
い。さらに好ましくはpHを5.5以上6.8以下に保つのが好
ましい。ｐＨをこの範囲に保つには、中和剤を使用する
のが好ましく、中和剤とてしては、水酸化ナトリウム、
炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムあ
るいはアンモニアを用いればよい。さらに好ましくはア
ンモニアが挙げられる。水溶性、粉末、ガスいかなる種
類のものでもよく操作性を考え適宜決めればよい。
する。バシラス属のＤ−乳酸生産菌は酸感受性を有する
ため、中和剤でpHを4.5以上7.0以下に保つのが好まし
い。さらに好ましくはpHを5.5以上6.8以下に保つのが好
ましい。ｐＨをこの範囲に保つには、中和剤を使用する
のが好ましく、中和剤とてしては、水酸化ナトリウム、
炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムあ
るいはアンモニアを用いればよい。さらに好ましくはア
ンモニアが挙げられる。水溶性、粉末、ガスいかなる種
類のものでもよく操作性を考え適宜決めればよい。
【００２７】こうして得られた発酵液中の乳酸は、従来
より知られている方法によって、精製することができ
る。例えば、微生物を遠心分離した発酵液をpH１以下に
してからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方
法、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方
法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステル
とし、蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として
晶析する方法などがある。
より知られている方法によって、精製することができ
る。例えば、微生物を遠心分離した発酵液をpH１以下に
してからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方
法、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方
法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステル
とし、蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として
晶析する方法などがある。
【００２８】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。なお、実施例におけるＤ−乳酸の光学純度測定は
以下の条件でHPLC法により測定した。 カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製） 溶媒 ：1mM 硫酸銅水溶液 流速 ：1.0ml/min 検出 ：UV254nm 温度 ：30℃ また、D-乳酸の光学純度は次式で計算される。 光学純度（%）＝100×（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ） ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表
す。
する。なお、実施例におけるＤ−乳酸の光学純度測定は
以下の条件でHPLC法により測定した。 カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製） 溶媒 ：1mM 硫酸銅水溶液 流速 ：1.0ml/min 検出 ：UV254nm 温度 ：30℃ また、D-乳酸の光学純度は次式で計算される。 光学純度（%）＝100×（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ） ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表
す。
【００２９】また、実施例における化学純度は乳酸カル
シウムを濃塩酸で溶解し、以下の条件でHPLC法により測
定した。 カラム：イオン交換カラム SGR101（島津製作所製） 溶媒 ：0.25%硫酸水溶液 流速 ：1.0ml/min 検出 ：UV214nm、RI（示差屈折計） 温度 ：40℃ また、実施例における各種培地はすべて、グルコースと
他の培地成分をわけて、120℃、20分間オートクレイブ
滅菌した。
シウムを濃塩酸で溶解し、以下の条件でHPLC法により測
定した。 カラム：イオン交換カラム SGR101（島津製作所製） 溶媒 ：0.25%硫酸水溶液 流速 ：1.0ml/min 検出 ：UV214nm、RI（示差屈折計） 温度 ：40℃ また、実施例における各種培地はすべて、グルコースと
他の培地成分をわけて、120℃、20分間オートクレイブ
滅菌した。
【００３０】実施例１、比較例１（発酵温度による効
果） バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492を滅菌したG
YP培地5mlに接種し、37℃、3日間静置培養した。この培
養液0.25mlを表２に示す滅菌した発酵培地5mlに接種
し、30℃（比較例１）および37℃（実施例１）で発酵が
終了するまで培養した。その培養液を分析した。その結
果を表３に示す。
果） バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492を滅菌したG
YP培地5mlに接種し、37℃、3日間静置培養した。この培
養液0.25mlを表２に示す滅菌した発酵培地5mlに接種
し、30℃（比較例１）および37℃（実施例１）で発酵が
終了するまで培養した。その培養液を分析した。その結
果を表３に示す。
【００３１】
【表2】
【００３２】
【表3】
【００３３】以上の結果より、従来から知られていたバ
シラス・ラエボラクティカスの適温30℃よりも高温でＤ
−乳酸発酵を行うほうが、D-乳酸生産速度（発酵終了時
間が11日から7日）および収率（100g/Lグルコースから
得られる乳酸が88.0g/Lから95.3g/L）が優れていること
が明らかになった。
シラス・ラエボラクティカスの適温30℃よりも高温でＤ
−乳酸発酵を行うほうが、D-乳酸生産速度（発酵終了時
間が11日から7日）および収率（100g/Lグルコースから
得られる乳酸が88.0g/Lから95.3g/L）が優れていること
が明らかになった。
【００３４】実施例２、比較例２（嫌気培養による効
果） バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492を滅菌したG
YP培地5mlに接種し、37℃、3日間静置培養した。この培
養液0.25mlを表２に示した滅菌した発酵培地5mlに接種
し、発酵が終了するまで37℃、静地培養（実施例２）お
よび37℃、150rpmで振とう培養（比較例２）した。その
培養液を分析した。その結果を表４に示す。
果） バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492を滅菌したG
YP培地5mlに接種し、37℃、3日間静置培養した。この培
養液0.25mlを表２に示した滅菌した発酵培地5mlに接種
し、発酵が終了するまで37℃、静地培養（実施例２）お
よび37℃、150rpmで振とう培養（比較例２）した。その
培養液を分析した。その結果を表４に示す。
【００３５】
【表４】
【００３６】以上の結果より、Ｄ−乳酸生産には嫌気的
条件下で培養を行うほうが、好気的条件下で培養を行う
よりも収率（100g/Lグルコースから得られる乳酸が10.2
g/Lから95.3g/L）が優れていることが明らかになった。
条件下で培養を行うほうが、好気的条件下で培養を行う
よりも収率（100g/Lグルコースから得られる乳酸が10.2
g/Lから95.3g/L）が優れていることが明らかになった。
【００３７】実施例３（中和剤による効果）
バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492を滅菌したG
YP培地5mlに接種し、37℃、3日間静置培養した。この培
養液1mlを炭酸カルシウムを1%含む滅菌したGYP培地25ml
に接種し、37℃、1日静置培養し種菌を調整した。この
種菌50mlを表５に示す滅菌した発酵培地950mlに接種
し、二酸化炭素を通気させながら、37℃、8.5%アンモニ
ア水によりpHを5.8〜6.2にコントロールしながら発酵を
行った。
YP培地5mlに接種し、37℃、3日間静置培養した。この培
養液1mlを炭酸カルシウムを1%含む滅菌したGYP培地25ml
に接種し、37℃、1日静置培養し種菌を調整した。この
種菌50mlを表５に示す滅菌した発酵培地950mlに接種
し、二酸化炭素を通気させながら、37℃、8.5%アンモニ
ア水によりpHを5.8〜6.2にコントロールしながら発酵を
行った。
【００３８】
【表５】
【００３９】60時間において発酵が終了し、この発酵液
を4000rpmで5分間遠心分離し、菌体を除去し、この上清
に55gの炭酸カルシウムを添加し、80℃で1時間加熱する
ことにより塩交換を行った。これを室温まで冷却し、析
出した結晶を濾別した後、濾液を再び濃縮して析出した
結晶を濾別し、両者を合わせて乳酸カルシウムの白色結
晶117g（乳酸97g）を得た。このもののD-乳酸の光学純
度は97%であった。
を4000rpmで5分間遠心分離し、菌体を除去し、この上清
に55gの炭酸カルシウムを添加し、80℃で1時間加熱する
ことにより塩交換を行った。これを室温まで冷却し、析
出した結晶を濾別した後、濾液を再び濃縮して析出した
結晶を濾別し、両者を合わせて乳酸カルシウムの白色結
晶117g（乳酸97g）を得た。このもののD-乳酸の光学純
度は97%であった。
【００４０】実施例４（中和剤による効果）
バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492を実施例３
と同じように調整した種菌50mlを表５に示した滅菌した
発酵培地950mlに接種し、二酸化炭素を通気させなが
ら、37℃、5N水酸化ナトリウムによりpHを5.8〜6.2にコ
ントロールしながら発酵を行った。
と同じように調整した種菌50mlを表５に示した滅菌した
発酵培地950mlに接種し、二酸化炭素を通気させなが
ら、37℃、5N水酸化ナトリウムによりpHを5.8〜6.2にコ
ントロールしながら発酵を行った。
【００４１】110時間において発酵が終了し、実施例３
と同じように乳酸カルシウムを調整したところ、乳酸カ
ルシウムの白色結晶107g（乳酸88g）を得た。このもの
のD-乳酸の光学純度は97%であった。以上の結果を表６
にまとめる。
と同じように乳酸カルシウムを調整したところ、乳酸カ
ルシウムの白色結晶107g（乳酸88g）を得た。このもの
のD-乳酸の光学純度は97%であった。以上の結果を表６
にまとめる。
【００４２】中和剤としてアンモニア水を用いD-乳酸発
酵を行うほうが、水酸化ナトリウムを用いＤ−乳酸発酵
を行うよりも乳酸生産性（発酵終了時間が110時間から6
0時間）および収率（100g/Lグルコースから得られる乳
酸が88g/Lから97g/L）が優れていることが明らかになっ
た。
酵を行うほうが、水酸化ナトリウムを用いＤ−乳酸発酵
を行うよりも乳酸生産性（発酵終了時間が110時間から6
0時間）および収率（100g/Lグルコースから得られる乳
酸が88g/Lから97g/L）が優れていることが明らかになっ
た。
【００４３】
【表６】
【００４４】実施例５（酵母エキスによる効果）
バシラス・ラエボラクティカス ATCC 23492を実施例３
と同じように調整した種菌50mlを表７に示した滅菌した
発酵培地950mlに接種し、二酸化炭素を通気させなが
ら、37℃、8.5%アンモニア水によりpHを5.8〜6.2にコン
トロールしながら発酵を行った。
と同じように調整した種菌50mlを表７に示した滅菌した
発酵培地950mlに接種し、二酸化炭素を通気させなが
ら、37℃、8.5%アンモニア水によりpHを5.8〜6.2にコン
トロールしながら発酵を行った。
【００４５】
【表７】
【００４６】発酵が終了後、実施例３と同じように乳酸
カルシウムを調整し、このものの化学純度HPLC法により
測定した。その結果を表８に示す。
カルシウムを調整し、このものの化学純度HPLC法により
測定した。その結果を表８に示す。
【００４７】
【表８】
【００４８】以上の結果より、培地中の酵母エキス濃度
を０．１％以上０．５％未満においてＤ−乳酸発酵を行
うほうが、培地中の酵母エキス濃度を０．５％以上にお
いてＤ−乳酸発酵を行うよりも、収率に違いはなく、な
おかつ乳酸精製後の化学純度が優れていることが明らか
になった。
を０．１％以上０．５％未満においてＤ−乳酸発酵を行
うほうが、培地中の酵母エキス濃度を０．５％以上にお
いてＤ−乳酸発酵を行うよりも、収率に違いはなく、な
おかつ乳酸精製後の化学純度が優れていることが明らか
になった。
【００４９】
【発明の効果】Ｄ−乳酸発酵において、培養条件とし
て、二酸化炭素などを通気することにより嫌気的条件下
で行うことにより収率を向上させ、培養温度を30℃より
高温にすることにより、乳酸生産速度を向上させ、収率
も向上させることが可能になった。また、培養液を中和
する際に、中和剤として水酸化ナトリウムを用いるより
アンモニア水を用いることにより、乳酸生産速度を向上
させることが可能になった。発酵培地中の酵母エキス濃
度0.1%以上0.5%未満の濃度で培養しても、発酵終了時間
および収率に影響はなく、Ｄ−乳酸コストを抑え、化学
純度を向上させることができた。
て、二酸化炭素などを通気することにより嫌気的条件下
で行うことにより収率を向上させ、培養温度を30℃より
高温にすることにより、乳酸生産速度を向上させ、収率
も向上させることが可能になった。また、培養液を中和
する際に、中和剤として水酸化ナトリウムを用いるより
アンモニア水を用いることにより、乳酸生産速度を向上
させることが可能になった。発酵培地中の酵母エキス濃
度0.1%以上0.5%未満の濃度で培養しても、発酵終了時間
および収率に影響はなく、Ｄ−乳酸コストを抑え、化学
純度を向上させることができた。
【００５０】Ｄ−乳酸は各種光学活性化合物を合成する
ための出発原料として、また生分解プラスチックの原料
として重要であり、近年Ｄ−乳酸に対する需要が増大し
つつあり、本発明により工業的規模での安価で効率的な
Ｄ−乳酸の製造が可能となった。
ための出発原料として、また生分解プラスチックの原料
として重要であり、近年Ｄ−乳酸に対する需要が増大し
つつあり、本発明により工業的規模での安価で効率的な
Ｄ−乳酸の製造が可能となった。
Claims (5)
- 【請求項１】資化可能な炭素源から光学純度９０％以上
のＤ−乳酸を生産する能力を有するバシラス（Bacillu
s）属に属する微生物を３３℃以上４５℃以下で嫌気培
養し、この培養物からＤ−乳酸を単離精製することを特
徴とするＤ-乳酸の製造方法。 - 【請求項２】二酸化炭素、窒素、アンモニアおよびアル
ゴンから選ばれる少なくとも１種類を通気しながら嫌気
培養することを特徴とする、請求項1に記載のD-乳酸の
製造方法。 - 【請求項３】水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭
酸ナトリウムおよびアンモニアから選ばれる少なくとも
１種類でpH4.5〜7.0に維持しながら培養することを特徴
とする、請求項1または2に記載のD-乳酸の製造方法。 - 【請求項４】酵母エキス濃度0.1%以上0.5%未満の培地で
培養することを特徴とする、請求項1から３のいずれか
１項に記載のD-乳酸の製造方法。 - 【請求項５】バシラス属に属する微生物がバシラス・ラ
エボラクティカス（Bacillus laevolacticus）であるこ
とを特徴とする請求項1から４のいずれか１項に記載のD
-乳酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001279110A JP4742475B2 (ja) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Ｄ−乳酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001279110A JP4742475B2 (ja) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Ｄ−乳酸の製造方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003088392A true JP2003088392A (ja) | 2003-03-25 |
| JP2003088392A5 JP2003088392A5 (ja) | 2008-06-05 |
| JP4742475B2 JP4742475B2 (ja) | 2011-08-10 |
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ID=19103364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001279110A Expired - Fee Related JP4742475B2 (ja) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Ｄ−乳酸の製造方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP4742475B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007074939A (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-29 | Toray Ind Inc | Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子およびｄ−乳酸の製造方法 |
| JP2008104451A (ja) * | 2006-09-26 | 2008-05-08 | Toray Ind Inc | 連続発酵によるｄ−乳酸の製造方法 |
| WO2008126667A2 (en) | 2007-03-19 | 2008-10-23 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for producing lactic acid |
| JP2008283917A (ja) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | Toray Ind Inc | 乳酸の製造方法 |
| WO2010084972A1 (ja) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | 株式会社アグリバイオインダストリ | Ｄ－乳酸の製造方法および乳酸においてｄ－乳酸の光学純度または対糖収率を高める方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07327693A (ja) * | 1993-11-18 | 1995-12-19 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Ｄ−乳酸及びｌ−ラクトアミドの製造法 |
| JPH09121877A (ja) * | 1995-10-27 | 1997-05-13 | Shimadzu Corp | バチルス属微生物を用いた高純度ｌ−乳酸の製造方法 |
| JP2001029063A (ja) * | 1999-07-19 | 2001-02-06 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 高純度のｄ−乳酸を生成する微細藻と、これを用いたｄ−乳酸製造方法及び装置 |
-
2001
- 2001-09-14 JP JP2001279110A patent/JP4742475B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6011000512, Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９０， Ｖｏｌ．３４， ｐ．１４９−１５３ * |
| JPN6011000513, Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９３， Ｖｏｌ．５９， Ｎｏ．８， ｐ．２４７４−２４７８ * |
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|---|---|---|---|---|
| JP2007074939A (ja) * | 2005-09-13 | 2007-03-29 | Toray Ind Inc | Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子およびｄ−乳酸の製造方法 |
| JP4692173B2 (ja) * | 2005-09-13 | 2011-06-01 | 東レ株式会社 | Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子およびｄ−乳酸の製造方法 |
| JP2008104451A (ja) * | 2006-09-26 | 2008-05-08 | Toray Ind Inc | 連続発酵によるｄ−乳酸の製造方法 |
| WO2008126667A2 (en) | 2007-03-19 | 2008-10-23 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for producing lactic acid |
| EP2484771A1 (en) | 2007-03-19 | 2012-08-08 | Sumitomo Chemical Company Limited | Process for producing D-lactic acid from glycerol employing Serratia marcescens |
| EP2487247A1 (en) | 2007-03-19 | 2012-08-15 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Process for producing D-lactic acid from glycerol employing Frateuria aurantia |
| EP2492348A1 (en) | 2007-03-19 | 2012-08-29 | Sumitomo Chemical Company Limited | Process for producing D-lactic acid from glycerol employing Pseudomonas auricularis, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas taetrolens, or Pseuomonas sp. |
| EP2492349A1 (en) | 2007-03-19 | 2012-08-29 | Sumitomo Chemical Company Limited | Process for producing D-lactic acid from glycerol employing Achromobacter denitrificans |
| EP2492350A1 (en) | 2007-03-19 | 2012-08-29 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Process for producing D-lactic acid from glycerol employing Brevibacterium butanicum |
| EP2495330A1 (en) | 2007-03-19 | 2012-09-05 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Process for producing D-lactic acid from glycerol employing Escherichia coli ATCC 700926 |
| JP2008283917A (ja) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | Toray Ind Inc | 乳酸の製造方法 |
| WO2010084972A1 (ja) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | 株式会社アグリバイオインダストリ | Ｄ－乳酸の製造方法および乳酸においてｄ－乳酸の光学純度または対糖収率を高める方法 |
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| JP4742475B2 (ja) | 2011-08-10 |
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