JPH07327693A - Ｄ−乳酸及びｌ−ラクトアミドの製造法 - Google Patents
Ｄ−乳酸及びｌ−ラクトアミドの製造法Info
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- JPH07327693A JPH07327693A JP28550394A JP28550394A JPH07327693A JP H07327693 A JPH07327693 A JP H07327693A JP 28550394 A JP28550394 A JP 28550394A JP 28550394 A JP28550394 A JP 28550394A JP H07327693 A JPH07327693 A JP H07327693A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 アルカリゲネス属、シュードモナス属、アグ
ロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アシネトバ
クター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター
属、ミクロコッカス属及びロドコッカス属に属し、ＤＬ
−ラクトアミドを不斉加水分解する能力を有する微生物
の培養液、菌体、菌体処理物、あるいは固定化物をＤＬ
−ラクトアミドに作用させることを特徴とするＤ−乳酸
及びＬ−ラクトアミドの製造法。 【効果】 ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解する能力
を有する微生物の作用により、Ｄ−乳酸及びＬ−ラクト
アミドを効率よく得ることができる。
ロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アシネトバ
クター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター
属、ミクロコッカス属及びロドコッカス属に属し、ＤＬ
−ラクトアミドを不斉加水分解する能力を有する微生物
の培養液、菌体、菌体処理物、あるいは固定化物をＤＬ
−ラクトアミドに作用させることを特徴とするＤ−乳酸
及びＬ−ラクトアミドの製造法。 【効果】 ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解する能力
を有する微生物の作用により、Ｄ−乳酸及びＬ−ラクト
アミドを効率よく得ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＬ−ラクトアミドを
生物化学的に不斉加水分解してＤ−乳酸及びＬ−ラクト
アミドを製造する方法に関する。本発明で得られるＤ−
乳酸は光学活性フェノキシプロピオン酸系あるいはジフ
ェニルエーテル系除草剤の原料として有用な化合物であ
る。また生分解性ポリマーの原料としての利用も見込ま
れている。
生物化学的に不斉加水分解してＤ−乳酸及びＬ−ラクト
アミドを製造する方法に関する。本発明で得られるＤ−
乳酸は光学活性フェノキシプロピオン酸系あるいはジフ
ェニルエーテル系除草剤の原料として有用な化合物であ
る。また生分解性ポリマーの原料としての利用も見込ま
れている。
【０００２】
【従来の技術】光学活性乳酸は、従来糖質を原料とする
発酵法で製造されているが、この方法では発酵終了まで
にかなりの時間を要し、その蓄積濃度は十数％以下と低
く、また生成される乳酸の分離、精製等には煩雑な操作
を必要とする。Ｄ−乳酸の発酵法による製造は特開昭63
-173596号公報、特公平５-38593号公報等に記載されて
いる。
発酵法で製造されているが、この方法では発酵終了まで
にかなりの時間を要し、その蓄積濃度は十数％以下と低
く、また生成される乳酸の分離、精製等には煩雑な操作
を必要とする。Ｄ−乳酸の発酵法による製造は特開昭63
-173596号公報、特公平５-38593号公報等に記載されて
いる。
【０００３】酵素学的方法による乳酸の製造法に関して
は、ニトリル化合物を原料として、光学活性α−置換有
機酸を製造する方法 (特開平2-84198号公報及び特開平3
-224496号公報参照) 及び光学活性乳酸を製造する方法
(特開平4-99497号、特開平5-219987号公報参照) が知ら
れている。
は、ニトリル化合物を原料として、光学活性α−置換有
機酸を製造する方法 (特開平2-84198号公報及び特開平3
-224496号公報参照) 及び光学活性乳酸を製造する方法
(特開平4-99497号、特開平5-219987号公報参照) が知ら
れている。
【０００４】また、α−ヒドロキシメチルエステル化合
物を原料として、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸誘
導体を製造する方法 (特開昭63-63397号公報参照) 及び
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法 (特
開平2-156892号公報参照) 、更に２−ハロゲノプロピオ
ン酸から光学活性乳酸を製造する方法 (特開昭59-31690
号公報参照) 、１,２−プロパンジオールからＤ−乳酸
を製造する方法 (特開平4-271787号公報参照) 等が知ら
れている。
物を原料として、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸誘
導体を製造する方法 (特開昭63-63397号公報参照) 及び
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を製造する方法 (特
開平2-156892号公報参照) 、更に２−ハロゲノプロピオ
ン酸から光学活性乳酸を製造する方法 (特開昭59-31690
号公報参照) 、１,２−プロパンジオールからＤ−乳酸
を製造する方法 (特開平4-271787号公報参照) 等が知ら
れている。
【０００５】一方、アミド化合物を原料とする方法とし
ては、微生物による光学活性α−オキシ酸の製法 (特開
昭61-88894号公報参照) 、光学活性α−オキシ酸の製造
法 (特開昭62-55098号公報参照) 、光学活性α−置換有
機酸の製造方法 (特開平2-84198号公報参照) 及び光学
活性α−置換有機酸を製造する方法 (特開平3-224496号
公報参照) が知られている。
ては、微生物による光学活性α−オキシ酸の製法 (特開
昭61-88894号公報参照) 、光学活性α−オキシ酸の製造
法 (特開昭62-55098号公報参照) 、光学活性α−置換有
機酸の製造方法 (特開平2-84198号公報参照) 及び光学
活性α−置換有機酸を製造する方法 (特開平3-224496号
公報参照) が知られている。
【０００６】上記の特開昭61-88894号、特開平2-84198
号及び特開平3-224496号公報には一般論としてラセミの
アミド体から対応する光学活性カルボン酸を生成させる
可能性が示されているものの、ＤＬ−ラクトアミドから
直接光学活性乳酸を製造することに関する具体的な記述
はなく、ＤＬ−ラクトアミドから直接光学活性乳酸を製
造しうるかどうか全く不明である。特開昭61-88894号公
報には僅か２種の微生物により特定のα−ヒドロキシア
ミドから対応する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を
製造する方法が記載されているに過ぎない。また、特開
平2-84198号及び特開平3-224496号公報ではα−置換ニ
トリル及びα−置換アミドから微生物酵素の作用により
対応するα−置換酸を製造するという方法が示されてい
る。しかしながら、本公報で例示されている方法の大半
はα−置換ニトリルからの光学活性なα−置換酸の製造
であり、また、α−置換アミドからの対応するα−置換
酸の製造に関する例示化合物はすべて光学活性炭素にハ
ロゲン、アリール基、アリールオキシ基、複素環基等が
結合したものであり、乳酸のようにヒドロキシ基と低分
子のアルキル基の組み合わせを有するＤ−α−置換酸の
製造についてはまだ知られていない。
号及び特開平3-224496号公報には一般論としてラセミの
アミド体から対応する光学活性カルボン酸を生成させる
可能性が示されているものの、ＤＬ−ラクトアミドから
直接光学活性乳酸を製造することに関する具体的な記述
はなく、ＤＬ−ラクトアミドから直接光学活性乳酸を製
造しうるかどうか全く不明である。特開昭61-88894号公
報には僅か２種の微生物により特定のα−ヒドロキシア
ミドから対応する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を
製造する方法が記載されているに過ぎない。また、特開
平2-84198号及び特開平3-224496号公報ではα−置換ニ
トリル及びα−置換アミドから微生物酵素の作用により
対応するα−置換酸を製造するという方法が示されてい
る。しかしながら、本公報で例示されている方法の大半
はα−置換ニトリルからの光学活性なα−置換酸の製造
であり、また、α−置換アミドからの対応するα−置換
酸の製造に関する例示化合物はすべて光学活性炭素にハ
ロゲン、アリール基、アリールオキシ基、複素環基等が
結合したものであり、乳酸のようにヒドロキシ基と低分
子のアルキル基の組み合わせを有するＤ−α−置換酸の
製造についてはまだ知られていない。
【０００７】一方、特開昭62-55098号公報はＤＬ−ラク
トアミドからＬ−乳酸を製造する方法を開示している
が、ＤＬ−ラクトアミドから優位量のＤ−乳酸を製造す
る方法についてはまだ知られていない。
トアミドからＬ−乳酸を製造する方法を開示している
が、ＤＬ−ラクトアミドから優位量のＤ−乳酸を製造す
る方法についてはまだ知られていない。
【０００８】また、これらの公知技術にはそれぞれの反
応において酵素や菌体の効率的な利用方法については何
等触れられていない。さらに、これらの公知技術には光
学活性体の蓄積濃度に関しても何等特別な記述はなく、
開示されていたとしても数％以下の蓄積濃度の具体例が
あるのみである。
応において酵素や菌体の効率的な利用方法については何
等触れられていない。さらに、これらの公知技術には光
学活性体の蓄積濃度に関しても何等特別な記述はなく、
開示されていたとしても数％以下の蓄積濃度の具体例が
あるのみである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、反応
時の酵素や菌体を効率的に利用するとともに、Ｄ−乳酸
及びＬ−ラクトアミドを高濃度に蓄積せしめることので
きる工業的な製造法を提供することである。
時の酵素や菌体を効率的に利用するとともに、Ｄ−乳酸
及びＬ−ラクトアミドを高濃度に蓄積せしめることので
きる工業的な製造法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、ＤＬ−ラ
クトアミドを原料として直接優位量のＤ−乳酸及びＬ−
ラクトアミドを製造すべく、鋭意検討を重ねた結果、本
発明に到達した。即ち、本発明は、アルカリゲネス属、
シュードモナス属、アグロバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属、アシネトバクター属、コリネバクテリウム
属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属及びロドコ
ッカス属に属し、ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解す
る能力を有する微生物の培養液、菌体、菌体処理物、あ
るいは固定化物をＤＬ−ラクトアミドに作用させること
を特徴とするＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミドの製造法で
ある。
クトアミドを原料として直接優位量のＤ−乳酸及びＬ−
ラクトアミドを製造すべく、鋭意検討を重ねた結果、本
発明に到達した。即ち、本発明は、アルカリゲネス属、
シュードモナス属、アグロバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属、アシネトバクター属、コリネバクテリウム
属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属及びロドコ
ッカス属に属し、ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解す
る能力を有する微生物の培養液、菌体、菌体処理物、あ
るいは固定化物をＤＬ−ラクトアミドに作用させること
を特徴とするＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミドの製造法で
ある。
【００１１】また、本発明は、前記微生物の培養液、菌
体、菌体処理物、あるいは固定化物をＤＬ−ラクトアミ
ドに作用させ、生成するＤ−乳酸を取得することを特徴
とするＤ−乳酸の製造法、及び前記微生物の培養液、菌
体、菌体処理物あるいは固定化物をＤＬ−ラクトアミド
に作用させ、残存するＬ−ラクトアミドを取得すること
を特徴とするＬ−ラクトアミドの製造法を包含する。
体、菌体処理物、あるいは固定化物をＤＬ−ラクトアミ
ドに作用させ、生成するＤ−乳酸を取得することを特徴
とするＤ−乳酸の製造法、及び前記微生物の培養液、菌
体、菌体処理物あるいは固定化物をＤＬ−ラクトアミド
に作用させ、残存するＬ−ラクトアミドを取得すること
を特徴とするＬ−ラクトアミドの製造法を包含する。
【００１２】本発明に用いる微生物としては、アルカリ
ゲネス属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属、アシネトバクター属、コリネバ
クテリウム属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属
及びロドコッカス属に属し、且つＤＬ−ラクトアミドを
Ｄ−乳酸に不斉加水分解する能力を有するものであれ
ば、特に制限はない。
ゲネス属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、
ブレビバクテリウム属、アシネトバクター属、コリネバ
クテリウム属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属
及びロドコッカス属に属し、且つＤＬ−ラクトアミドを
Ｄ−乳酸に不斉加水分解する能力を有するものであれ
ば、特に制限はない。
【００１３】かかる微生物としては、例えばアルカリゲ
ネス sp. MR-2201株 (FERM P-13958)、アルカリゲネス
・ファエカリス (Alcaligenes faecalis) IFO 13111、
シュードモナス sp. MR-2301株 (FERM P-13959)、シュ
ードモナス・プチダ(Pseudomonas putida) IFO 12996、
シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluores
cens) IFO 3903、アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス(Agrobacterium tumefaciens) IAM 1037、アグロバク
テリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacie
ns) ATCC 4720、アグロバクテリウム・ラディオバクタ
ー(Agrobacterium radiobacter) IFO 12607、アグロバ
クテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium radioba
cter) IAM 1526、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
ス(Brevibacterium ammoniagenes) IFO 12072、ブレビ
バクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammo
niagenes) IAM 1645、アシネトバクター sp. MR-2302株
(FERM P-14268)、コリネバクテリウム・ニトリロフィル
ス(Corynebacteirum nitrilophilus) ATCC21419、エン
テロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae) IFO
3320、ミクロコッカス・バリアンス(Micrococcus vari
ans) IAM 1099、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcu
s luteus) IFO 12708、ロドコッカス・エクイ(Rhodococ
cus equi) IFO 3730、ロドコッカス・エクイ(Rhodococc
us equi) IFM152、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhod
ococcus erythropolis) IFM 155、ロドコッカス・エリ
スロポリス(Rhodococcus erythropolis) IFO 12320、ロ
ドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropoli
s) IFO 12538、及びロドコッカス・ロドニィ(Rhodococc
us rhodonii) IFM 148が挙げられる。
ネス sp. MR-2201株 (FERM P-13958)、アルカリゲネス
・ファエカリス (Alcaligenes faecalis) IFO 13111、
シュードモナス sp. MR-2301株 (FERM P-13959)、シュ
ードモナス・プチダ(Pseudomonas putida) IFO 12996、
シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluores
cens) IFO 3903、アグロバクテリウム・ツメファシエン
ス(Agrobacterium tumefaciens) IAM 1037、アグロバク
テリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacie
ns) ATCC 4720、アグロバクテリウム・ラディオバクタ
ー(Agrobacterium radiobacter) IFO 12607、アグロバ
クテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium radioba
cter) IAM 1526、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
ス(Brevibacterium ammoniagenes) IFO 12072、ブレビ
バクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammo
niagenes) IAM 1645、アシネトバクター sp. MR-2302株
(FERM P-14268)、コリネバクテリウム・ニトリロフィル
ス(Corynebacteirum nitrilophilus) ATCC21419、エン
テロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae) IFO
3320、ミクロコッカス・バリアンス(Micrococcus vari
ans) IAM 1099、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcu
s luteus) IFO 12708、ロドコッカス・エクイ(Rhodococ
cus equi) IFO 3730、ロドコッカス・エクイ(Rhodococc
us equi) IFM152、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhod
ococcus erythropolis) IFM 155、ロドコッカス・エリ
スロポリス(Rhodococcus erythropolis) IFO 12320、ロ
ドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropoli
s) IFO 12538、及びロドコッカス・ロドニィ(Rhodococc
us rhodonii) IFM 148が挙げられる。
【００１４】これらのうち、アルカリゲネス sp. MR-22
01株 (FERM P-13958)、シュードモナス sp. MR-2301株
(FERM P-13959)、及びアシネトバクターsp.MR-2302株(F
ERMP-14268)が好ましく用いられる。
01株 (FERM P-13958)、シュードモナス sp. MR-2301株
(FERM P-13959)、及びアシネトバクターsp.MR-2302株(F
ERMP-14268)が好ましく用いられる。
【００１５】アルカリゲネス sp. MR-2201株、シュード
モナス sp. MR-2301株、及びアシネトバクターsp. MR-2
302株は、本発明者等が新たに土壌中より分離したもの
で、上記寄託番号にて通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されており、その菌学的性質はそれ
ぞれ以下に示す通りである。
モナス sp. MR-2301株、及びアシネトバクターsp. MR-2
302株は、本発明者等が新たに土壌中より分離したもの
で、上記寄託番号にて通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されており、その菌学的性質はそれ
ぞれ以下に示す通りである。
【００１６】アルカリゲネス sp. MR-2201株: 形態 桿 菌 グラム染色性 − 胞子 − 運動性 ＋ 鞭毛 周 毛 オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ 酸素に対する態度 好気性 ＯＦテスト − キノン系 Ｑ−８
【００１７】シュードモナス sp. MR-2301株: 形態 桿 菌 グラム染色性 − 胞子 − 運動性 ＋ 鞭毛 極 毛 オキシターゼ ＋ カタラーゼ ＋ 酸素に対する態度 好気性 ＯＦテスト Ｏ キノン系 Ｑ−８ メタノール資化性 − pH 3.6での生育 −
【００１８】アシネトバクター sp. MR-2302株: 形態 短桿菌 グラム染色性 − 胞子 − 運動性 − オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ 酸素に対する態度 好気性 ＯＦテスト − ＧＣ含量（モル％） 38
【００１９】以上の菌学的性質をBergey's Manual of S
ystematic Bacteriology (1986) に基づいて分類する
と、アルカリゲネス sp. MR-2201株はアルカリゲネス属
に属する細菌、シュードモナス sp. MR-2301株はシュー
ドモナス属に属する細菌、アシネトバクター sp. MR-23
02株はアシネトバクター属に属する細菌であると同定さ
れた。
ystematic Bacteriology (1986) に基づいて分類する
と、アルカリゲネス sp. MR-2201株はアルカリゲネス属
に属する細菌、シュードモナス sp. MR-2301株はシュー
ドモナス属に属する細菌、アシネトバクター sp. MR-23
02株はアシネトバクター属に属する細菌であると同定さ
れた。
【００２０】本発明においては、通常これらの菌株の一
種を用いるが、同様の能力を有する二種以上の混合菌体
を用いることも可能である。
種を用いるが、同様の能力を有する二種以上の混合菌体
を用いることも可能である。
【００２１】また、さらに、本発明者らは、Ｄ−乳酸及
びＬ−ラクトアミドの効率的な製造方法を鋭意検討し
た。まず、上記ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解する
能力を有する上記酵素を含む菌体を固定化して、得られ
た固定化菌体を不斉加水分解反応に用いることに着想
し、最初にアクリルアミド系の重合体ゲルによって、酵
素含有菌体を包括して固定化することを試みた。このア
クリルアミド系の重合体ゲルを用いる固定化法は従来か
らよく研究されており〔例えば「発酵と工業」vol.35,
No.3, P.281 〜293, (1977年) 参照〕、例えば酵素とア
クリルアミドの混合液を調製して、これを重合させ、生
成したゲル内に酵素を包括する方法等が挙げられる。
びＬ−ラクトアミドの効率的な製造方法を鋭意検討し
た。まず、上記ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解する
能力を有する上記酵素を含む菌体を固定化して、得られ
た固定化菌体を不斉加水分解反応に用いることに着想
し、最初にアクリルアミド系の重合体ゲルによって、酵
素含有菌体を包括して固定化することを試みた。このア
クリルアミド系の重合体ゲルを用いる固定化法は従来か
らよく研究されており〔例えば「発酵と工業」vol.35,
No.3, P.281 〜293, (1977年) 参照〕、例えば酵素とア
クリルアミドの混合液を調製して、これを重合させ、生
成したゲル内に酵素を包括する方法等が挙げられる。
【００２２】しかしながら、この方法によって製造した
固定化菌体は、繰り返しの使用による活性低下が著し
く、また懸濁中にゲルが破損するという問題があった。
本発明者らは、上記問題点の発生原因について究明した
ところ、活性低下に関しては、菌体から遊離した酵素が
ゲルから反応液側に漏出するために生じることが判っ
た。ゲルからの酵素の漏失を防止するには、酵素分子を
多官能性架橋剤で処理することにより、さらに高分子化
してゲルの網目構造からの溶出を防止する方法が知られ
ている（例えば特公昭58-36959号公報参照）。
固定化菌体は、繰り返しの使用による活性低下が著し
く、また懸濁中にゲルが破損するという問題があった。
本発明者らは、上記問題点の発生原因について究明した
ところ、活性低下に関しては、菌体から遊離した酵素が
ゲルから反応液側に漏出するために生じることが判っ
た。ゲルからの酵素の漏失を防止するには、酵素分子を
多官能性架橋剤で処理することにより、さらに高分子化
してゲルの網目構造からの溶出を防止する方法が知られ
ている（例えば特公昭58-36959号公報参照）。
【００２３】しかしながら、上記のように架橋剤で酵素
を化学修飾する場合、酵素の活性を損なわないような架
橋剤を選択する必要があり、いかなる酵素に対しても酵
素の活性を損なうことなく安定した架橋処理が可能なも
のは現在のところ知られていない。ＤＬ−ラクトアミド
を生物化学的に不斉加水分解してＤ−乳酸及びＬ−ラク
トアミドを生成する能力を有する酵素についても同様で
あり、当該酵素に適した架橋剤及びその使用条件を見出
す必要がある。
を化学修飾する場合、酵素の活性を損なわないような架
橋剤を選択する必要があり、いかなる酵素に対しても酵
素の活性を損なうことなく安定した架橋処理が可能なも
のは現在のところ知られていない。ＤＬ−ラクトアミド
を生物化学的に不斉加水分解してＤ−乳酸及びＬ−ラク
トアミドを生成する能力を有する酵素についても同様で
あり、当該酵素に適した架橋剤及びその使用条件を見出
す必要がある。
【００２４】上記課題に対して鋭意研究した結果、本発
明者等は、ＤＬ−ラクトアミドを生物化学的に不斉加水
分解してＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを生成する能力
を有する酵素を含む微生物の菌体又は菌体処理物に、ア
ルデヒド基を有する多官能性架橋剤及びアクリルアミド
系の単量体を含有する包括材を添加し、重合させた後、
得られた重合物を任意の形状に成形した固定化物はその
活性を損なうことなく、安定であることを見出した。ま
た、ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解してＤ−乳酸及
びＬ−ラクトアミドを生成する能力を有する微生物菌
体、アルデヒド基を有する多官能性架橋剤、及びアクリ
ルアミド系の単量体を含有する包括材を所定の割合で、
例えば微生物菌体１重量部／多官能性架橋剤0.01〜0.25
重量部／包括材0.5〜10重量部の割合で均一に混合し、
重合することにより、懸濁状態で繰り返し反応に使用し
ても酵素の漏失がなく、しかも破損の少ない固定化菌体
が得られることを見出した。
明者等は、ＤＬ−ラクトアミドを生物化学的に不斉加水
分解してＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを生成する能力
を有する酵素を含む微生物の菌体又は菌体処理物に、ア
ルデヒド基を有する多官能性架橋剤及びアクリルアミド
系の単量体を含有する包括材を添加し、重合させた後、
得られた重合物を任意の形状に成形した固定化物はその
活性を損なうことなく、安定であることを見出した。ま
た、ＤＬ−ラクトアミドを不斉加水分解してＤ−乳酸及
びＬ−ラクトアミドを生成する能力を有する微生物菌
体、アルデヒド基を有する多官能性架橋剤、及びアクリ
ルアミド系の単量体を含有する包括材を所定の割合で、
例えば微生物菌体１重量部／多官能性架橋剤0.01〜0.25
重量部／包括材0.5〜10重量部の割合で均一に混合し、
重合することにより、懸濁状態で繰り返し反応に使用し
ても酵素の漏失がなく、しかも破損の少ない固定化菌体
が得られることを見出した。
【００２５】さらに、本発明者等は、ＤＬ−ラクトアミ
ドを原料として高濃度のＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミド
を製造すべく、加水分解反応の諸要因の影響について鋭
意検討を重ねた結果、反応系のＤＬ−ラクトアミドが40
重量％を超えると反応速度が極端に低下し、実質的なＤ
−乳酸及びＬ−ラクトアミドの製造が困難になるが、Ｄ
Ｌ−ラクトアミドの濃度を制御することにより、目的物
をそれぞれ高濃度で蓄積できることがわかった。
ドを原料として高濃度のＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミド
を製造すべく、加水分解反応の諸要因の影響について鋭
意検討を重ねた結果、反応系のＤＬ−ラクトアミドが40
重量％を超えると反応速度が極端に低下し、実質的なＤ
−乳酸及びＬ−ラクトアミドの製造が困難になるが、Ｄ
Ｌ−ラクトアミドの濃度を制御することにより、目的物
をそれぞれ高濃度で蓄積できることがわかった。
【００２６】すなわち、ＤＬ−ラクトアミドに、ＤＬ−
ラクトアミドを不斉加水分解する能力を有する微生物の
培養物、菌体、菌体処理物、あるいは固定化物を作用さ
せてＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを生成させる際に、
反応系内のＤＬ−ラクトアミド濃度を40重量％以下とな
るように維持させることにより、Ｄ−乳酸及びＬ−ラク
トアミドがそれぞれ10重量％以上の高濃度で蓄積できる
ことを見出した。
ラクトアミドを不斉加水分解する能力を有する微生物の
培養物、菌体、菌体処理物、あるいは固定化物を作用さ
せてＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを生成させる際に、
反応系内のＤＬ−ラクトアミド濃度を40重量％以下とな
るように維持させることにより、Ｄ−乳酸及びＬ−ラク
トアミドがそれぞれ10重量％以上の高濃度で蓄積できる
ことを見出した。
【００２７】次に、本発明の一般的実施態様について説
明する。 〔１〕菌体調製 本発明に使用される微生物の培養には、ラクトアミド、
プロピオンアミド等のアミド化合物及びそれらの誘導物
質を唯一炭素源、窒素源として用いるか、又は炭素源と
しては通常資化しうるものを、一方窒素源としては前記
アミド化合物を用いるか、又は炭素源、窒素源双方とも
通常資化しうるものを用いるかいずれかの栄養源に微生
物の生育に必要な無機栄養源を添加した培地が用いられ
る。例えば、炭素源としてグリセロール、グルコース、
シュークロース等、窒素源として酵母エキス、ペプト
ン、硫酸アンモニウム等、無機栄養源としてリン酸塩、
ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マ
ンガン塩、亜鉛塩等が用いられる。
明する。 〔１〕菌体調製 本発明に使用される微生物の培養には、ラクトアミド、
プロピオンアミド等のアミド化合物及びそれらの誘導物
質を唯一炭素源、窒素源として用いるか、又は炭素源と
しては通常資化しうるものを、一方窒素源としては前記
アミド化合物を用いるか、又は炭素源、窒素源双方とも
通常資化しうるものを用いるかいずれかの栄養源に微生
物の生育に必要な無機栄養源を添加した培地が用いられ
る。例えば、炭素源としてグリセロール、グルコース、
シュークロース等、窒素源として酵母エキス、ペプト
ン、硫酸アンモニウム等、無機栄養源としてリン酸塩、
ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マ
ンガン塩、亜鉛塩等が用いられる。
【００２８】培養は、好気的条件下、pH４〜10、温度20
〜50℃、培養時間１〜７日間行えば良い。更に、培養初
期から中期にラクトアミド、プロピオンアミド等のアミ
ド化合物及びそれらの誘導物質を酵素誘導物質として添
加することにより高い酵素活性が得られる。
〜50℃、培養時間１〜７日間行えば良い。更に、培養初
期から中期にラクトアミド、プロピオンアミド等のアミ
ド化合物及びそれらの誘導物質を酵素誘導物質として添
加することにより高い酵素活性が得られる。
【００２９】このようにして得られた培養液、菌体また
はその処理物 (破砕菌体、粗・精製酵素、固定化菌体・
酵素等) はいずれの形でも反応に使用することができ
る。菌体の固定化処理を行う場合について以下に説明す
る。
はその処理物 (破砕菌体、粗・精製酵素、固定化菌体・
酵素等) はいずれの形でも反応に使用することができ
る。菌体の固定化処理を行う場合について以下に説明す
る。
【００３０】〔２〕固定化菌体の調製 架橋剤 本発明において使用する固定化架橋剤は、アルデヒド基
を有する多官能性のものである。アルデヒド基を有する
多官能性架橋剤とは、１分子中に２個以上のアルデヒド
基を有する化合物を意味する。このような化合物として
は、グルタルアルデヒドやグリオキサール等が挙げら
れ、それらの混合物を使用することもできるが、特にグ
ルタルアルデヒドを使用するのが好ましい。
を有する多官能性のものである。アルデヒド基を有する
多官能性架橋剤とは、１分子中に２個以上のアルデヒド
基を有する化合物を意味する。このような化合物として
は、グルタルアルデヒドやグリオキサール等が挙げら
れ、それらの混合物を使用することもできるが、特にグ
ルタルアルデヒドを使用するのが好ましい。
【００３１】 包括材 包括材としてはアクリルアミド系の単量体を含有するも
のを使用する。本明細書において包括材とは、重合する
ことによってゲル化して、微生物の菌体を包括すること
のできるものをいう。アクリルアミド系の単量体として
は、アクリルアミド、メタクリルアミド、N,N ’−メチ
レンビスアクリルアミド等が挙げられ、１種又は２種以
上を適宜使用すればよい。
のを使用する。本明細書において包括材とは、重合する
ことによってゲル化して、微生物の菌体を包括すること
のできるものをいう。アクリルアミド系の単量体として
は、アクリルアミド、メタクリルアミド、N,N ’−メチ
レンビスアクリルアミド等が挙げられ、１種又は２種以
上を適宜使用すればよい。
【００３２】また、菌体との固定を強固にするために、
さらにアクリルアミド系の単量体と共重合可能なエチレ
ン系不飽和単量体を併用してもよい。エチレン系不飽和
単量体としては、ジメチルアミノエチルメタクリレー
ト、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルア
ミノプロピルメタクリレート、ジエチルアミノプロピル
メタクリルアミドや、これらの第４級化物等が挙げら
れ、これらは１種又は２種以上を適宜使用することがで
きる。
さらにアクリルアミド系の単量体と共重合可能なエチレ
ン系不飽和単量体を併用してもよい。エチレン系不飽和
単量体としては、ジメチルアミノエチルメタクリレー
ト、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルア
ミノプロピルメタクリレート、ジエチルアミノプロピル
メタクリルアミドや、これらの第４級化物等が挙げら
れ、これらは１種又は２種以上を適宜使用することがで
きる。
【００３３】エチレン系不飽和単量体を併用する場合、
アクリルアミド系の単量体１重量部に対して、0.01〜0.
5重量部、特に0.05〜0.2重量部の混合比で使用するのが
好ましい。
アクリルアミド系の単量体１重量部に対して、0.01〜0.
5重量部、特に0.05〜0.2重量部の混合比で使用するのが
好ましい。
【００３４】 混合 以上の微生物の菌体、架橋剤、及び包括材を水性媒体中
で均一に混合する。そのとき、微生物の菌体１重量部に
対して、架橋剤を0.01〜0.25重量部、及び包括材を 0.5
〜10重量部を添加するのが好ましい。架橋剤の使用量が
これより少ないと、微生物の固定化が不完全となり、漏
失が起こる。一方、これより多量に添加すると、包括材
の重合が阻害され、機械的強度の大きい重合体ゲルが得
られにくい。また、包括材の使用量も生成する重合体ゲ
ルの強度及び活性の発現に大きく影響を与え、使用量が
上記よりも少ないと菌体の固定化が不完全となり、一方
上記より多量に添加すると、菌体酵素の活性発現が不完
全となる。特に好ましくは、菌体１重量部に対して架橋
剤を0.03〜0.2重量部、及び包括材を0.8〜８重量部を添
加する。
で均一に混合する。そのとき、微生物の菌体１重量部に
対して、架橋剤を0.01〜0.25重量部、及び包括材を 0.5
〜10重量部を添加するのが好ましい。架橋剤の使用量が
これより少ないと、微生物の固定化が不完全となり、漏
失が起こる。一方、これより多量に添加すると、包括材
の重合が阻害され、機械的強度の大きい重合体ゲルが得
られにくい。また、包括材の使用量も生成する重合体ゲ
ルの強度及び活性の発現に大きく影響を与え、使用量が
上記よりも少ないと菌体の固定化が不完全となり、一方
上記より多量に添加すると、菌体酵素の活性発現が不完
全となる。特に好ましくは、菌体１重量部に対して架橋
剤を0.03〜0.2重量部、及び包括材を0.8〜８重量部を添
加する。
【００３５】水性媒体としては、水、生理食塩水、リン
酸緩衝液等の溶媒、又は前記溶媒を主成分とし、これに
水に溶解しうる範囲で有機溶媒等を混合させた混合系を
使用することができる。用いうる有機溶媒の代表的な例
としては、メタノール、エタノール、ジメチルホルムア
ミド、ジオキサン等が例示できるが、これらに限定され
るものではない。
酸緩衝液等の溶媒、又は前記溶媒を主成分とし、これに
水に溶解しうる範囲で有機溶媒等を混合させた混合系を
使用することができる。用いうる有機溶媒の代表的な例
としては、メタノール、エタノール、ジメチルホルムア
ミド、ジオキサン等が例示できるが、これらに限定され
るものではない。
【００３６】水性媒体の使用量としては、菌体、架橋剤
及び包括材の合計１重量部に対して、１〜50重量部であ
るのが好ましく、特に２〜10重量部であるのが好まし
い。混合は、機械的手段、例えばプロペラ付き攪拌機、
ホモジナイザー等を使用して行うのが好ましい。
及び包括材の合計１重量部に対して、１〜50重量部であ
るのが好ましく、特に２〜10重量部であるのが好まし
い。混合は、機械的手段、例えばプロペラ付き攪拌機、
ホモジナイザー等を使用して行うのが好ましい。
【００３７】 重合 上記混合物を重合させるには、重合開始剤を使用する。
重合開始剤としては、特に制限されるものではないが、
過硫酸カリや過硫酸アンモニウム等のレドックス系の開
始剤を用いるのが好ましい。重合開始剤は、混合物（上
記水性媒体は含まない）１重量部に対して、0.0001〜0.
1重量部使用するのが好ましく、特に0.0005〜0.01重量
部使用するのが好ましい。
重合開始剤としては、特に制限されるものではないが、
過硫酸カリや過硫酸アンモニウム等のレドックス系の開
始剤を用いるのが好ましい。重合開始剤は、混合物（上
記水性媒体は含まない）１重量部に対して、0.0001〜0.
1重量部使用するのが好ましく、特に0.0005〜0.01重量
部使用するのが好ましい。
【００３８】さらに重合を促進させるために、ジメチル
アミノプロピオニトリルやトリエタノールアミン等の重
合促進剤を使用してもよい。重合促進剤は、混合物（上
記水性媒体は含まない）１重量部に対して、0.0001〜0.
1重量部使用するのが好ましく、特に0.0005〜0.1重量部
使用するのが好ましい。なお、この重合促進剤は、上記
混合工程においてあらかじめ添加しておいてもよい。
アミノプロピオニトリルやトリエタノールアミン等の重
合促進剤を使用してもよい。重合促進剤は、混合物（上
記水性媒体は含まない）１重量部に対して、0.0001〜0.
1重量部使用するのが好ましく、特に0.0005〜0.1重量部
使用するのが好ましい。なお、この重合促進剤は、上記
混合工程においてあらかじめ添加しておいてもよい。
【００３９】いずれの添加剤を使用する場合において
も、重合反応系内の菌体の量を0.1〜50重量％、特に１
〜20重量％の範囲に維持するのが好ましい。重合は、特
に制限されるものではないが、ｐＨ５〜10及び−10℃〜
＋30℃の温度下で行うのが好ましく、特にｐＨ６〜８及
び０〜20℃の温度の下で行うのが好ましい。また、雰囲
気は、酸素を除去した雰囲気、例えば窒素ガス雰囲気と
するのが重合を円滑に進めるために好ましい。この重合
は、一般的には10秒〜10時間行う。
も、重合反応系内の菌体の量を0.1〜50重量％、特に１
〜20重量％の範囲に維持するのが好ましい。重合は、特
に制限されるものではないが、ｐＨ５〜10及び−10℃〜
＋30℃の温度下で行うのが好ましく、特にｐＨ６〜８及
び０〜20℃の温度の下で行うのが好ましい。また、雰囲
気は、酸素を除去した雰囲気、例えば窒素ガス雰囲気と
するのが重合を円滑に進めるために好ましい。この重合
は、一般的には10秒〜10時間行う。
【００４０】 成形 重合終了後、得られた重合物を成形し、固定化菌体とす
る。その形状は特に制限されるものではないが、通常は
粒状であり、球状、円柱状、角柱状等いずれの形状から
なる粒状であってもよい。反応液からの生成物の回収の
容易性や、菌体酵素の活性発現の度合い等を考慮して、
粒径は 0.1〜２mmとするのが好ましく、特に 0.5〜１mm
とするのが好ましい。成形手段としてはいかなる方法を
使用してもよいが、例えば細断機（金網）で押し出した
後、刃物で切断する方法がとられる。
る。その形状は特に制限されるものではないが、通常は
粒状であり、球状、円柱状、角柱状等いずれの形状から
なる粒状であってもよい。反応液からの生成物の回収の
容易性や、菌体酵素の活性発現の度合い等を考慮して、
粒径は 0.1〜２mmとするのが好ましく、特に 0.5〜１mm
とするのが好ましい。成形手段としてはいかなる方法を
使用してもよいが、例えば細断機（金網）で押し出した
後、刃物で切断する方法がとられる。
【００４１】以上のようにして得られた固定化菌体にお
いて、菌体の酵素はアルデヒド基を有する多官能性架橋
剤で架橋され、アクリルアミド系の重合体ゲル中に包括
されていると考えられる。
いて、菌体の酵素はアルデヒド基を有する多官能性架橋
剤で架橋され、アクリルアミド系の重合体ゲル中に包括
されていると考えられる。
【００４２】〔３〕不斉加水分解 このようにして得られた培養液、菌体またはその処理物
(破砕菌体、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等) を含
む水性媒体中にＤＬ−ラクトアミドを共存させることに
より、速やかに加水分解が進行し、Ｄ−乳酸とアンモニ
アを生成する。反応系内でＤＬ−ラクトアミド濃度は特
に制限されるものではないが、一般には0.01〜60重量％
を用いるとよい。しかし、円滑且つ効率的に加水分解反
応を進行させるためには、菌体またはその処理物 (破砕
菌体、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等) を含む水性
媒体中でのＤＬ−ラクトアミド濃度を40重量％以下、好
ましくは５〜30重量％となるように調整維持すること
で、速やかに且つ高濃度にＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミ
ドを、それぞれ10重量％以上、さらには20重量％以上蓄
積せしめることが可能である。
(破砕菌体、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等) を含
む水性媒体中にＤＬ−ラクトアミドを共存させることに
より、速やかに加水分解が進行し、Ｄ−乳酸とアンモニ
アを生成する。反応系内でＤＬ−ラクトアミド濃度は特
に制限されるものではないが、一般には0.01〜60重量％
を用いるとよい。しかし、円滑且つ効率的に加水分解反
応を進行させるためには、菌体またはその処理物 (破砕
菌体、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等) を含む水性
媒体中でのＤＬ−ラクトアミド濃度を40重量％以下、好
ましくは５〜30重量％となるように調整維持すること
で、速やかに且つ高濃度にＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミ
ドを、それぞれ10重量％以上、さらには20重量％以上蓄
積せしめることが可能である。
【００４３】本発明では、ＤＬ−ラクトアミドの反応系
内の濃度を40重量％以下となるように調整維持すること
とは、反応初期から終期を通じてＤＬ−ラクトアミドの
濃度を40重量％以下に調整維持することである。ＤＬ−
ラクトアミドの濃度が40重量％を超えると、酵素失活に
よると考えられる反応速度の低下が観察される。反応が
進行するに従ってＤＬ−ラクトアミドの濃度は低下する
が、当該濃度を40重量％、好ましくは30重量％を超えな
い範囲でＤＬ−ラクトアミドを連続的又は間欠的に添加
すればよい。勿論、反応開始時にＤＬ−ラクトアミドを
40重量％濃度以下で一括混合して、その後はＤＬ−ラク
トアミドを添加しない方法をとってもよいことはいうま
でもない。このようにＤＬ−ラクトアミドの濃度を調整
維持することによって、Ｄ−乳酸及びＬ−ラクトアミド
をそれぞれ10重量％以上の高濃度で蓄積することができ
る。
内の濃度を40重量％以下となるように調整維持すること
とは、反応初期から終期を通じてＤＬ−ラクトアミドの
濃度を40重量％以下に調整維持することである。ＤＬ−
ラクトアミドの濃度が40重量％を超えると、酵素失活に
よると考えられる反応速度の低下が観察される。反応が
進行するに従ってＤＬ−ラクトアミドの濃度は低下する
が、当該濃度を40重量％、好ましくは30重量％を超えな
い範囲でＤＬ−ラクトアミドを連続的又は間欠的に添加
すればよい。勿論、反応開始時にＤＬ−ラクトアミドを
40重量％濃度以下で一括混合して、その後はＤＬ−ラク
トアミドを添加しない方法をとってもよいことはいうま
でもない。このようにＤＬ−ラクトアミドの濃度を調整
維持することによって、Ｄ−乳酸及びＬ−ラクトアミド
をそれぞれ10重量％以上の高濃度で蓄積することができ
る。
【００４４】反応系中における微生物の培養液、菌体、
菌体処理物の使用量は特に制限されるものではないが、
例えば微生物菌体をそのまま用いる場合は、乾燥菌体と
して0.001〜10重量％になるようにするとよい。特に好
ましくは0.01〜２重量％である。固定化菌体を用いる場
合は、0.01〜10重量％使用すればよい。
菌体処理物の使用量は特に制限されるものではないが、
例えば微生物菌体をそのまま用いる場合は、乾燥菌体と
して0.001〜10重量％になるようにするとよい。特に好
ましくは0.01〜２重量％である。固定化菌体を用いる場
合は、0.01〜10重量％使用すればよい。
【００４５】反応条件は、特に制限されるものではない
が、酵素の安定性を考慮に入れ、反応媒体のpHは３〜1
2、好ましくは５〜９、反応温度は５〜70℃、好ましく
は10〜50℃、反応時間は0.5〜120時間、好ましくは５〜
24時間で反応させればよい。
が、酵素の安定性を考慮に入れ、反応媒体のpHは３〜1
2、好ましくは５〜９、反応温度は５〜70℃、好ましく
は10〜50℃、反応時間は0.5〜120時間、好ましくは５〜
24時間で反応させればよい。
【００４６】製造されたＬ−ラクトアミドはいったん単
離後、化学的加水分解によりＬ−乳酸を生成せしめるこ
ともできる。従って、本発明はこれら一連の操作により
Ｄ体及びＬ体の双方の製造を可能にするものである。
離後、化学的加水分解によりＬ−乳酸を生成せしめるこ
ともできる。従って、本発明はこれら一連の操作により
Ｄ体及びＬ体の双方の製造を可能にするものである。
【００４７】尚、前記反応は菌体または酵素を一般的な
手法に従って固定化されたものを使用することもでき
る。反応方式に関してはバッチ式、連続式及び再使用式
のいずれの方法でも可能である。
手法に従って固定化されたものを使用することもでき
る。反応方式に関してはバッチ式、連続式及び再使用式
のいずれの方法でも可能である。
【００４８】反応液からの光学活性乳酸の分離は、遠心
分離あるいは瀘過等により菌体または菌体処理物を除去
後、抽出、イオン交換、電気透析、その他の公知の方法
を利用することができる。
分離あるいは瀘過等により菌体または菌体処理物を除去
後、抽出、イオン交換、電気透析、その他の公知の方法
を利用することができる。
【００４９】
【発明の効果】本発明によれば、ＤＬ−ラクトアミドを
不斉加水分解する能力を有する微生物の作用により、Ｄ
−乳酸及びＬ−ラクトアミドを効率よく得ることができ
る。
不斉加水分解する能力を有する微生物の作用により、Ｄ
−乳酸及びＬ−ラクトアミドを効率よく得ることができ
る。
【００５０】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等制限す
るものではない。
明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等制限す
るものではない。
【００５１】〔実施例１〕アルカリゲネス sp. MR-2201
株を下記に示す培地により30℃で48時間振盪培養した。 培地組成 ペプトン 16ｇ 酵母エキス 10ｇ 塩化ナトリウム 5ｇ ラクトアミド 1ｇ 水 1000ml 得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸
緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を乾
燥菌体量として２重量％、ＤＬ−ラクトアミド５重量％
となるように調整し、30℃で反応開始した。ＤＬ−ラク
トアミド及び乳酸はＨＰＬＣ (高速液体クロマトグラフ
ィー) 法により分析した。反応40時間後、Ｄ−ラクトア
ミドからのモル収率約100％でＤ−乳酸（100％ ee)が生
成された。なお、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工
業株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
株を下記に示す培地により30℃で48時間振盪培養した。 培地組成 ペプトン 16ｇ 酵母エキス 10ｇ 塩化ナトリウム 5ｇ ラクトアミド 1ｇ 水 1000ml 得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸
緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を乾
燥菌体量として２重量％、ＤＬ−ラクトアミド５重量％
となるように調整し、30℃で反応開始した。ＤＬ−ラク
トアミド及び乳酸はＨＰＬＣ (高速液体クロマトグラフ
ィー) 法により分析した。反応40時間後、Ｄ−ラクトア
ミドからのモル収率約100％でＤ−乳酸（100％ ee)が生
成された。なお、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工
業株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
【００５２】〔実施例２〕アルカリゲネス・ファエカリ
ス (Alcaligenes faecalis) IFO 13111 を実施例１に示
す培地により30℃で48時間振盪培養した。得られた培養
液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH
７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を約10重量％、
ＤＬ−ラクトアミド２重量％となるように調整し、30℃
で反応開始した。ＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬ
Ｃ法により分析した。反応18時間後、Ｄ−ラクトアミド
からのモル収率ほぼ 100％でＤ−乳酸 (60％ee) が生成
された。なお、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工業
株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
ス (Alcaligenes faecalis) IFO 13111 を実施例１に示
す培地により30℃で48時間振盪培養した。得られた培養
液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH
７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を約10重量％、
ＤＬ−ラクトアミド２重量％となるように調整し、30℃
で反応開始した。ＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬ
Ｃ法により分析した。反応18時間後、Ｄ−ラクトアミド
からのモル収率ほぼ 100％でＤ−乳酸 (60％ee) が生成
された。なお、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工業
株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
【００５３】〔実施例３〕シュードモナス sp. MR-2301
株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養し
た。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリ
ン酸緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体
を乾燥菌体量として２重量％、ＤＬ−ラクトアミド５重
量％となるように調整し、30℃で反応開始した。経時的
にＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬＣ法により分析
した。結果を図１に示す。反応８時間後、Ｄ−ラクトア
ミドからのモル収率ほぼ100％でＤ−乳酸(96％ ee)及び
Ｌ−ラクトアミドが生成された。なお、Ｄ−乳酸の光学
純度はダイセル化学工業株式会社製 CHIRALPAK WH カラ
ムにより分析した。
株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養し
た。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリ
ン酸緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体
を乾燥菌体量として２重量％、ＤＬ−ラクトアミド５重
量％となるように調整し、30℃で反応開始した。経時的
にＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬＣ法により分析
した。結果を図１に示す。反応８時間後、Ｄ−ラクトア
ミドからのモル収率ほぼ100％でＤ−乳酸(96％ ee)及び
Ｌ−ラクトアミドが生成された。なお、Ｄ−乳酸の光学
純度はダイセル化学工業株式会社製 CHIRALPAK WH カラ
ムにより分析した。
【００５４】〔実施例４〕シュードモナス・プチダ(Pse
udomonas putida) IFO 12996を実施例１に示す培地によ
り30℃で48時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分
離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH７) で洗浄し
た。同緩衝液中、洗浄菌体を約10重量％、ＤＬ−ラクト
アミド１重量％となるように調整し、30℃で反応開始し
た。ＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬＣ法により分
析した。反応15時間後、Ｄ−ラクトアミドからのモル収
率ほぼ100％でＤ−乳酸 (80％ee) が生成された。な
お、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工業株式会社製
CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
udomonas putida) IFO 12996を実施例１に示す培地によ
り30℃で48時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分
離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH７) で洗浄し
た。同緩衝液中、洗浄菌体を約10重量％、ＤＬ−ラクト
アミド１重量％となるように調整し、30℃で反応開始し
た。ＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬＣ法により分
析した。反応15時間後、Ｄ−ラクトアミドからのモル収
率ほぼ100％でＤ−乳酸 (80％ee) が生成された。な
お、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工業株式会社製
CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
【００５５】〔実施例５〕シュードモナス・フルオレセ
ンス(Pseudomonas fluorescens) IFO 3903を実施例１に
示す培地により30℃で48時間振盪培養した。得られた培
養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH
７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を約10重量％、
ＤＬ−ラクトアミド１重量％となるように調整し、30℃
で反応開始した。ＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬ
Ｃ法により分析した。反応48時間後、Ｄ−ラクトアミド
からのモル収率ほぼ100％でＤ−乳酸 (92％ee) が生成
された。なお、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工業
株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
ンス(Pseudomonas fluorescens) IFO 3903を実施例１に
示す培地により30℃で48時間振盪培養した。得られた培
養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH
７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を約10重量％、
ＤＬ−ラクトアミド１重量％となるように調整し、30℃
で反応開始した。ＤＬ−ラクトアミド及び乳酸をＨＰＬ
Ｃ法により分析した。反応48時間後、Ｄ−ラクトアミド
からのモル収率ほぼ100％でＤ−乳酸 (92％ee) が生成
された。なお、Ｄ−乳酸の光学純度はダイセル化学工業
株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより分析した。
【００５６】〔実施例６〕アシネトバクター sp. MR-23
02株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養
した。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05M
リン酸緩衝液（pH7 ）で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌
体を乾燥菌体量として１重量％、ＤＬ−ラクトアミド５
重量％となるように調整し、30℃で反応開始した。ＤＬ
−ラクトアミド及びＤＬ−乳酸をＨＰＬＣ法により分析
した。反応６時間後、Ｄ−ラクトアミドからのモル収率
ほぼ100％でＤ−乳酸（96％ee) 及びＬ−ラクトアミド
が得られた。なお、Ｄ−乳酸の光学純度は株式会社住化
分析センター製 SUMICHIRALOA-5000 カラムにより分析
した。
02株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養
した。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05M
リン酸緩衝液（pH7 ）で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌
体を乾燥菌体量として１重量％、ＤＬ−ラクトアミド５
重量％となるように調整し、30℃で反応開始した。ＤＬ
−ラクトアミド及びＤＬ−乳酸をＨＰＬＣ法により分析
した。反応６時間後、Ｄ−ラクトアミドからのモル収率
ほぼ100％でＤ−乳酸（96％ee) 及びＬ−ラクトアミド
が得られた。なお、Ｄ−乳酸の光学純度は株式会社住化
分析センター製 SUMICHIRALOA-5000 カラムにより分析
した。
【００５７】〔実施例７〕アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス(Agrobacterium tumefaciens) IAM 1037、ア
グロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium t
umefaciens) ATCC4720、アグロバクテリウム・ラディオ
バクター(Agrobacterium radiobacter) IFO 12607、ア
グロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium r
adiobacter) IAM 1526、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス(Brevibacterium ammoniagenes) IFO 12072、
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacteriu
m ammoniagenes) IAM 1645、コリネバクテリウム・ニト
リロフィルス(Corynebacteirum nitrilophilus) ATCC21
419、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter clo
acae) IFO 3320、ミクロコッカス・バリアンス(Microco
ccus varians) IAM 1099、ミクロコッカス・ルテウス(M
icrococcus luteus) IFO 12708、ロドコッカス・エクイ
(Rhodococcus equi) IFO 3730、ロドコッカス・エクイ
(Rhodococcus equi) IFM152、ロドコッカス・エリスロ
ポリス(Rhodococcus erythropolis) IFM 155、ロドコッ
カス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis) IFO
12320、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus e
rythropolis) IFO 12538、及びロドコッカス・ロドニィ
(Rhodococcus rhodonii) IFM 148株を実施例１に示す培
地により30℃で48時間振盪培養した。得られた培養液を
遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH７) で
洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を10重量％、ＤＬ−ラ
クトアミド１重量％となるように調整し、30℃で反応開
始した。Ｄ−乳酸をＨＰＬＣ法により分析した。反応24
時間後の結果を表１に示す。なお、Ｄ−乳酸の光学純度
はダイセル化学工業株式会社製 CHIRALPAK WH カラムに
より分析した。
ァシエンス(Agrobacterium tumefaciens) IAM 1037、ア
グロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium t
umefaciens) ATCC4720、アグロバクテリウム・ラディオ
バクター(Agrobacterium radiobacter) IFO 12607、ア
グロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium r
adiobacter) IAM 1526、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス(Brevibacterium ammoniagenes) IFO 12072、
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacteriu
m ammoniagenes) IAM 1645、コリネバクテリウム・ニト
リロフィルス(Corynebacteirum nitrilophilus) ATCC21
419、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter clo
acae) IFO 3320、ミクロコッカス・バリアンス(Microco
ccus varians) IAM 1099、ミクロコッカス・ルテウス(M
icrococcus luteus) IFO 12708、ロドコッカス・エクイ
(Rhodococcus equi) IFO 3730、ロドコッカス・エクイ
(Rhodococcus equi) IFM152、ロドコッカス・エリスロ
ポリス(Rhodococcus erythropolis) IFM 155、ロドコッ
カス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis) IFO
12320、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus e
rythropolis) IFO 12538、及びロドコッカス・ロドニィ
(Rhodococcus rhodonii) IFM 148株を実施例１に示す培
地により30℃で48時間振盪培養した。得られた培養液を
遠心分離により集菌し、0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH７) で
洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体を10重量％、ＤＬ−ラ
クトアミド１重量％となるように調整し、30℃で反応開
始した。Ｄ−乳酸をＨＰＬＣ法により分析した。反応24
時間後の結果を表１に示す。なお、Ｄ−乳酸の光学純度
はダイセル化学工業株式会社製 CHIRALPAK WH カラムに
より分析した。
【００５８】
【表１】
【００５９】〔実施例８〕シュードモナス sp. MR-2301
株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養し
た。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05M リ
ン酸緩衝液(pH7)で洗浄し、凍結融解菌体（含水率87.9
重量％）30ｇを得た。これに、ポリアクリルアミド８
ｇ、メチレンビスアクリルアミド0.4ｇを溶解した生理
的食塩水10ｇを加え、ミキサーで十分に混合した。次い
で、上記混合物48ｇに25重量％濃度のグルタルアルデヒ
ド水溶液１ｇ、５重量％濃度のジメチルアミノプロピオ
ニトリル水溶液５ｇ及び2.5重量％濃度の過硫酸カリ水
溶液５ｇを加え、窒素雰囲気下で十分混合した後、５℃
で約２時間重合反応を行った。反応終了後、得られた重
合物を10メッシュの金網上で押しつぶし、この網目を通
った破砕物を0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）で洗浄
して固定化菌体を得た。この湿潤状態の固定化菌体10ｇ
をイオン交換水180gに懸濁した後、ＤＬ−ラクトアミド
10ｇを加え、30℃で24時間不斉加水分解反応を行った。
反応終了後、固定化菌体を60メッシュの金網を用いて回
収して、再度上記と同一条件で反応を繰り返した。この
繰り返し回数に対するＤ−乳酸の生成量の推移を調べ
た。結果を表２に示す。なお、反応生成物であるＤ−乳
酸の定量は、ＨＰＬＣ法を使用して行った。
株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養し
た。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05M リ
ン酸緩衝液(pH7)で洗浄し、凍結融解菌体（含水率87.9
重量％）30ｇを得た。これに、ポリアクリルアミド８
ｇ、メチレンビスアクリルアミド0.4ｇを溶解した生理
的食塩水10ｇを加え、ミキサーで十分に混合した。次い
で、上記混合物48ｇに25重量％濃度のグルタルアルデヒ
ド水溶液１ｇ、５重量％濃度のジメチルアミノプロピオ
ニトリル水溶液５ｇ及び2.5重量％濃度の過硫酸カリ水
溶液５ｇを加え、窒素雰囲気下で十分混合した後、５℃
で約２時間重合反応を行った。反応終了後、得られた重
合物を10メッシュの金網上で押しつぶし、この網目を通
った破砕物を0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）で洗浄
して固定化菌体を得た。この湿潤状態の固定化菌体10ｇ
をイオン交換水180gに懸濁した後、ＤＬ−ラクトアミド
10ｇを加え、30℃で24時間不斉加水分解反応を行った。
反応終了後、固定化菌体を60メッシュの金網を用いて回
収して、再度上記と同一条件で反応を繰り返した。この
繰り返し回数に対するＤ−乳酸の生成量の推移を調べ
た。結果を表２に示す。なお、反応生成物であるＤ−乳
酸の定量は、ＨＰＬＣ法を使用して行った。
【００６０】〔比較例１〕グルタルアルデヒド水溶液を
添加しない以外、実施例８と同様にしてＤ−乳酸の生成
量の推移を調べた。結果を併せて表２に示す。
添加しない以外、実施例８と同様にしてＤ−乳酸の生成
量の推移を調べた。結果を併せて表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】表２から明らかなように、グルタルアルデ
ヒドによって菌体の酵素を架橋した場合には、酵素の活
性持続性が非常に優れている。
ヒドによって菌体の酵素を架橋した場合には、酵素の活
性持続性が非常に優れている。
【００６３】〔実施例９〕実施例８と同様の凍結融解菌
体（含水率80.0重量％）450ｇを、0.05Ｍのリン酸緩衝
液（ｐＨ7.0）150ｇに懸濁し、これに27.5重量％濃度の
単量体混合液〔アクリルアミド／N,N ’−メチレンビス
アクリルアミド／ジメチルアミノエチルメタクリレート
を10／１／１（重量比）で混合した単量体混合物を27.5
重量％含有する0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）〕312
ｇ及び重合促進剤として５重量％濃度のジメチルアミノ
プロピオニトリル水溶液88ｇを加えてミキサーで混合
し、菌体−単量体混合液1000ｇを調製した。得られた混
合液1000ｇに対し、25重量％濃度のグルタルアルデヒド
水溶液と、５重量％濃度の過硫酸カリ水溶液11ｇとを加
え、窒素雰囲気中、５℃で混合した。このとき、グルタ
ルアルデヒド水溶液の添加量を0.1〜16ｇまで変化させ
た。混合後、約20秒でゲル化した。この重合反応は、容
器を氷水で冷却して重合物の中心部の温度を30℃以下に
維持して行った。
体（含水率80.0重量％）450ｇを、0.05Ｍのリン酸緩衝
液（ｐＨ7.0）150ｇに懸濁し、これに27.5重量％濃度の
単量体混合液〔アクリルアミド／N,N ’−メチレンビス
アクリルアミド／ジメチルアミノエチルメタクリレート
を10／１／１（重量比）で混合した単量体混合物を27.5
重量％含有する0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）〕312
ｇ及び重合促進剤として５重量％濃度のジメチルアミノ
プロピオニトリル水溶液88ｇを加えてミキサーで混合
し、菌体−単量体混合液1000ｇを調製した。得られた混
合液1000ｇに対し、25重量％濃度のグルタルアルデヒド
水溶液と、５重量％濃度の過硫酸カリ水溶液11ｇとを加
え、窒素雰囲気中、５℃で混合した。このとき、グルタ
ルアルデヒド水溶液の添加量を0.1〜16ｇまで変化させ
た。混合後、約20秒でゲル化した。この重合反応は、容
器を氷水で冷却して重合物の中心部の温度を30℃以下に
維持して行った。
【００６４】反応終了後、重合物を５℃の下で一晩放置
し、その後10メッシュの金網から押し出して破砕した。
得られた破砕物を0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）500
mlで１時間洗浄したのち、60メッシュの金網で固液分離
して、粒状の固定化菌体を調製した。得られた固定化菌
体について、グルタルアルデヒドの仕込み量の変化に伴
う漏失性を調べるため、酵素の漏失試験を行った。酵素
の漏失試験は、湿潤状態の固定化菌体10ｇを0.05Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.0）100mlに加え、25℃で15日間洗浄
し、その状態における残存活性と未洗浄時における活性
との比率を調べることによって行った。活性及び残存活
性については、固定化菌体10ｇをイオン交換水180gに懸
濁した後、ＤＬ−ラクトアミド10ｇを加え、30℃、ｐＨ
7.0下で１時間反応させ、得られたＤ−乳酸の生成量か
ら調べた。結果を表３に示す。
し、その後10メッシュの金網から押し出して破砕した。
得られた破砕物を0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）500
mlで１時間洗浄したのち、60メッシュの金網で固液分離
して、粒状の固定化菌体を調製した。得られた固定化菌
体について、グルタルアルデヒドの仕込み量の変化に伴
う漏失性を調べるため、酵素の漏失試験を行った。酵素
の漏失試験は、湿潤状態の固定化菌体10ｇを0.05Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ7.0）100mlに加え、25℃で15日間洗浄
し、その状態における残存活性と未洗浄時における活性
との比率を調べることによって行った。活性及び残存活
性については、固定化菌体10ｇをイオン交換水180gに懸
濁した後、ＤＬ−ラクトアミド10ｇを加え、30℃、ｐＨ
7.0下で１時間反応させ、得られたＤ−乳酸の生成量か
ら調べた。結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】表３から明らかなように、菌体１重量部に
対してグルタルアルデヒドを0.01〜0.25重量部用いる
と、耐漏失性に優れた固定化菌体が得られる。
対してグルタルアルデヒドを0.01〜0.25重量部用いる
と、耐漏失性に優れた固定化菌体が得られる。
【００６７】〔実施例10〕実施例８と同様の凍結融解菌
体（含水率80重量％）を、0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
7.0）150ｇに懸濁し、これに実施例８と同様の単量体混
合液及び5.0重量％濃度のジメチルアミノプロピオニト
リルを加えてミキサーで混合し、表４に示す仕込み比の
６種の菌体−単量体混合液を調製した。このとき、５重
量％濃度のジメチルアミノプロピオニトリル水溶液の添
加量は、単量体混合液１重量部に対して0.3重量部の割
合で添加したものである。得られた菌体−単量体混合液
に、菌体１重量部に対しグルタルアルデヒドが0.11重量
部となるように、25重量％濃度のグルタルアルデヒド水
溶液を加えた。さらに、５重量％濃度の過硫酸カリ水溶
液を、菌体−単量体混合液１重量部に対して0.35重量部
となるように加え、実施例９と同様にして混合・重合し
た。得られた重合物について、単量体の仕込み量の変化
に伴う漏失性を実施例９と同様にして調べた。結果を表
４に示す。
体（含水率80重量％）を、0.05Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
7.0）150ｇに懸濁し、これに実施例８と同様の単量体混
合液及び5.0重量％濃度のジメチルアミノプロピオニト
リルを加えてミキサーで混合し、表４に示す仕込み比の
６種の菌体−単量体混合液を調製した。このとき、５重
量％濃度のジメチルアミノプロピオニトリル水溶液の添
加量は、単量体混合液１重量部に対して0.3重量部の割
合で添加したものである。得られた菌体−単量体混合液
に、菌体１重量部に対しグルタルアルデヒドが0.11重量
部となるように、25重量％濃度のグルタルアルデヒド水
溶液を加えた。さらに、５重量％濃度の過硫酸カリ水溶
液を、菌体−単量体混合液１重量部に対して0.35重量部
となるように加え、実施例９と同様にして混合・重合し
た。得られた重合物について、単量体の仕込み量の変化
に伴う漏失性を実施例９と同様にして調べた。結果を表
４に示す。
【００６８】
【表４】
【００６９】表４から明らかなように、菌体１重量部に
対して単量体（包括材）を0.5〜10重量部用いると、耐
漏失性に優れた固定化菌体が得られる。
対して単量体（包括材）を0.5〜10重量部用いると、耐
漏失性に優れた固定化菌体が得られる。
【００７０】〔実施例11〕シュードモナス sp. MR-2301
株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養し
た。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリ
ン酸緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体
を乾燥菌体量として２重量％、及びＤＬ−ラクトアミド
を５、10、20、30、40及び50重量％となるように初期濃
度を調整し、各々30℃の温度下で反応させた。反応開始
から１時間経過後、不斉加水分解によって得られたＤ−
乳酸をＨＰＬＣ法により定量し、ＤＬ−ラクトアミドの
初期濃度が反応初期速度に及ぼす影響を調べた。ＤＬ−
ラクトアミドの初期濃度と、反応開始１時間経過後にお
けるＤ−乳酸の生成量との関係を図２に示す。また、図
３〜５に30、40及び50重量％ラクトアミドによる反応経
時変化を示す。なお、得られたＤ−乳酸の光学純度をダ
イセル化学工業株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより
分析した結果、96％eeであった。
株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養し
た。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍリ
ン酸緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌体
を乾燥菌体量として２重量％、及びＤＬ−ラクトアミド
を５、10、20、30、40及び50重量％となるように初期濃
度を調整し、各々30℃の温度下で反応させた。反応開始
から１時間経過後、不斉加水分解によって得られたＤ−
乳酸をＨＰＬＣ法により定量し、ＤＬ−ラクトアミドの
初期濃度が反応初期速度に及ぼす影響を調べた。ＤＬ−
ラクトアミドの初期濃度と、反応開始１時間経過後にお
けるＤ−乳酸の生成量との関係を図２に示す。また、図
３〜５に30、40及び50重量％ラクトアミドによる反応経
時変化を示す。なお、得られたＤ−乳酸の光学純度をダ
イセル化学工業株式会社製 CHIRALPAK WH カラムにより
分析した結果、96％eeであった。
【００７１】図２から明らかなように、ＤＬ−ラクトア
ミドの初期濃度が40重量％を超えると反応速度が低下
し、50重量％においては著しく低下する。また、図３〜
５から明らかなように、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度
が40重量％を超えると、Ｄ−乳酸の蓄積性が著しく低下
する。
ミドの初期濃度が40重量％を超えると反応速度が低下
し、50重量％においては著しく低下する。また、図３〜
５から明らかなように、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度
が40重量％を超えると、Ｄ−乳酸の蓄積性が著しく低下
する。
【００７２】〔実施例12〕アシネトバクターsp. MR-230
2 株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養
した。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍ
リン酸緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌
体を乾燥菌体量として２重量％、及びＤＬ−ラクトアミ
ドを20、30、40及び50重量％となるように初期濃度を調
整し、各々30℃の温度下で反応させた。反応開始から１
時間経過後、不斉加水分解によって得られたＤ−乳酸を
ＨＰＬＣ法により定量し、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃
度が反応初期速度に及ぼす影響を調べた。ＤＬ−ラクト
アミドの初期濃度と、反応開始１時間経過後におけるＤ
−乳酸の生成量との関係を図６に示す。図６から明らか
なように、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度が40重量％を
超えると反応速度が低下し、50重量％においては著しく
低下する。
2 株を実施例１に示す培地により30℃で48時間振盪培養
した。得られた培養液を遠心分離により集菌し、0.05Ｍ
リン酸緩衝液 (pH７) で洗浄した。同緩衝液中、洗浄菌
体を乾燥菌体量として２重量％、及びＤＬ−ラクトアミ
ドを20、30、40及び50重量％となるように初期濃度を調
整し、各々30℃の温度下で反応させた。反応開始から１
時間経過後、不斉加水分解によって得られたＤ−乳酸を
ＨＰＬＣ法により定量し、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃
度が反応初期速度に及ぼす影響を調べた。ＤＬ−ラクト
アミドの初期濃度と、反応開始１時間経過後におけるＤ
−乳酸の生成量との関係を図６に示す。図６から明らか
なように、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度が40重量％を
超えると反応速度が低下し、50重量％においては著しく
低下する。
【００７３】〔実施例13〕実施例１と同様にMR-2301 洗
浄菌体を調製した。0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH７)中、当
該洗浄菌体を乾燥菌体量として２重量％、及びＤＬ−ラ
クトアミドを30重量％となるように調整し、30℃の温度
下で反応開始した。ＤＬ−ラクトアミドを、反応開始20
時間経過後に10重量％量、40時間経過後に同じく10重量
％量添加し、D-乳酸の蓄積状況を観察した。反応時間に
対するD-乳酸の濃度とＤＬ−ラクトアミドの濃度との関
係を図７に示す。尚、反応65時間後、Ｄ−乳酸約25重量
％の蓄積が確認された。図７より明らかなように、ＤＬ
−ラクトアミドを、15〜30重量％濃度に維持することに
より、高濃度のＤ−乳酸を蓄積することができる。
浄菌体を調製した。0.05Ｍリン酸緩衝液 (pH７)中、当
該洗浄菌体を乾燥菌体量として２重量％、及びＤＬ−ラ
クトアミドを30重量％となるように調整し、30℃の温度
下で反応開始した。ＤＬ−ラクトアミドを、反応開始20
時間経過後に10重量％量、40時間経過後に同じく10重量
％量添加し、D-乳酸の蓄積状況を観察した。反応時間に
対するD-乳酸の濃度とＤＬ−ラクトアミドの濃度との関
係を図７に示す。尚、反応65時間後、Ｄ−乳酸約25重量
％の蓄積が確認された。図７より明らかなように、ＤＬ
−ラクトアミドを、15〜30重量％濃度に維持することに
より、高濃度のＤ−乳酸を蓄積することができる。
【図１】 シュードモナス sp. MR-2301株による反応を
経時的にＨＰＬＣ法で分析した結果を示す。
経時的にＨＰＬＣ法で分析した結果を示す。
【図２】 シュードモナス sp. MR-2301株による反応に
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度と反応開始１時
間経過後におけるＤ−乳酸の生成量との関係を示す。
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度と反応開始１時
間経過後におけるＤ−乳酸の生成量との関係を示す。
【図３】 シュードモナス sp. MR-2301株による反応に
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度を30重量％とし
た場合の、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラ
クトアミドの濃度との関係を示す。
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度を30重量％とし
た場合の、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラ
クトアミドの濃度との関係を示す。
【図４】 シュードモナス sp. MR-2301株による反応に
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度を40重量％とし
た場合の、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラ
クトアミドの濃度との関係を示す。
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度を40重量％とし
た場合の、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラ
クトアミドの濃度との関係を示す。
【図５】 シュードモナス sp. MR-2301株による反応に
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度を50重量％とし
た場合の、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラ
クトアミドの濃度との関係を示す。
おいて、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度を50重量％とし
た場合の、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラ
クトアミドの濃度との関係を示す。
【図６】 アシネトバクターsp. MR-2302 株による反応
において、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度と、反応開始
１時間経過後におけるＤ−乳酸の生成量との関係を示
す。
において、ＤＬ−ラクトアミドの初期濃度と、反応開始
１時間経過後におけるＤ−乳酸の生成量との関係を示
す。
【図７】 シュードモナス sp. MR-2301株による反応に
おいて、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラク
トアミドの濃度との関係を示す。
おいて、反応時間に対するＤ−乳酸の濃度とＤＬ−ラク
トアミドの濃度との関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:265） (31)優先権主張番号 特願平6−77603 (32)優先日 平６(1994)４月15日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 古林 祥正 東京都中央区京橋二丁目３番19号 三菱レ イヨン株式会社内 (72)発明者 崎前 明宏 広島県大竹市御幸町20番１号 三菱レイヨ ン株式会社中央研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 アルカリゲネス属、シュードモナス属、
アグロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アシネ
トバクター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクタ
ー属、ミクロコッカス属及びロドコッカス属に属し、Ｄ
Ｌ−ラクトアミドを不斉加水分解する能力を有する微生
物の培養液、菌体、菌体処理物、あるいは固定化物をＤ
Ｌ−ラクトアミドに作用させることを特徴とするＤ−乳
酸及びＬ−ラクトアミドの製造法。 - 【請求項２】 アルカリゲネス属、シュードモナス属、
アグロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アシネ
トバクター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクタ
ー属、ミクロコッカス属及びロドコッカス属に属し、Ｄ
Ｌ−ラクトアミドを不斉加水分解する能力を有する微生
物の培養液、菌体、菌体処理物、あるいは固定化物をＤ
Ｌ−ラクトアミドに作用させ、生成するＤ−乳酸を取得
することを特徴とするＤ−乳酸の製造法。 - 【請求項３】 アルカリゲネス属、シュードモナス属、
アグロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アシネ
トバクター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクタ
ー属、ミクロコッカス属及びロドコッカス属に属し、Ｄ
Ｌ−ラクトアミドを不斉加水分解する能力を有する微生
物の培養液、菌体、菌体処理物、あるいは固定化物をＤ
Ｌ−ラクトアミドに作用させ、残存するＬ−ラクトアミ
ドを取得することを特徴とするＬ−ラクトアミドの製造
法。 - 【請求項４】 上記微生物が、アルカリゲネス sp. MR-
2201株 (FERM P-13958)、アルカリゲネス・ファエカリ
ス (Alcaligenes faecalis) IFO 13111、シュードモナ
ス sp. MR-2301株 (FERM P-13959)、シュードモナス・
プチダ(Pseudomonas putida) IFO 12996、シュードモナ
ス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens) IFO 39
03、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacte
rium tumefaciens) IAM 1037、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) ATCC 472
0、アグロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacter
iumradiobacter) IFO 12607、アグロバクテリウム・ラ
ディオバクター(Agrobacterium radiobacter) IAM 152
6、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacte
rium ammoniagenes) IFO 12072、ブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes) IAM
1645、アシネトバクター sp. MR-2302株(FERMP-1426
8)、コリネバクテリウム・ニトリロフィルス(Corynebac
teirum nitrilophilus) ATCC21419、エンテロバクター
・クロアカエ(Enterobacter cloacae) IFO3320、ミクロ
コッカス・バリアンス(Micrococcus varians) IAM 109
9、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus) IF
O 12708、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi) IF
O 3730、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi) IFM
152、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus eryt
hropolis) IFM 155、ロドコッカス・エリスロポリス(Rh
odococcus erythropolis) IFO 12320、ロドコッカス・
エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis) IFO 1253
8、及びロドコッカス・ロドニィ(Rhodococcus rhodoni
i) IFM 148であることを特徴する請求項１〜３いずれか
に記載のＤ−乳酸及び／又はＬ−ラクトアミドの製造
法。 - 【請求項５】 上記微生物が、アルカリゲネス sp. MR-
2201株 (FERM P-13958)、シュードモナス sp. MR-2301
株 (FERM P-13959)、及びアシネトバクター sp. MR-230
2株(FERM P-14268)であることを特徴する請求項１〜３
いずれかに記載のＤ−乳酸及び／又はＬ−ラクトアミド
の製造法。 - 【請求項６】 上記の固定化物が、ＤＬ−ラクトアミド
を不斉加水分解してＤ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを生
成する能力を有する微生物の菌体又は菌体処理物に、ア
ルデヒド基を有する多官能性架橋剤及びアクリルアミド
系の単量体を含有する包括材を添加し、重合させた後、
得られた重合物を任意の形状に成形したものであること
を特徴とする請求項１〜３いずれかに記載のＤ−乳酸及
び／又はＬ−ラクトアミドの製造法。 - 【請求項７】 ＤＬ−ラクトアミドに、ＤＬ−ラクトア
ミドを不斉加水分解する能力を有する微生物の培養液、
菌体、菌体処理物、あるいは固定化物を作用させてＤ−
乳酸及びＬ−ラクトアミドを生成させる際に、反応系内
のＤＬ−ラクトアミド濃度を40重量％以下となるように
維持させることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記
載のＤ−乳酸及び／又はＬ−ラクトアミドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28550394A JP3664506B2 (ja) | 1993-11-18 | 1994-11-18 | Ｄ−乳酸及びｌ−ラクトアミドの製造法 |
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28962293 | 1993-11-18 | ||
| JP3608494 | 1994-03-07 | ||
| JP3608594 | 1994-03-07 | ||
| JP6-36085 | 1994-04-15 | ||
| JP7760394 | 1994-04-15 | ||
| JP6-36084 | 1994-04-15 | ||
| JP5-289622 | 1994-04-15 | ||
| JP6-77603 | 1994-04-15 | ||
| JP28550394A JP3664506B2 (ja) | 1993-11-18 | 1994-11-18 | Ｄ−乳酸及びｌ−ラクトアミドの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07327693A true JPH07327693A (ja) | 1995-12-19 |
| JP3664506B2 JP3664506B2 (ja) | 2005-06-29 |
Family
ID=27521758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28550394A Expired - Fee Related JP3664506B2 (ja) | 1993-11-18 | 1994-11-18 | Ｄ−乳酸及びｌ−ラクトアミドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3664506B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003088392A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-03-25 | Toray Ind Inc | Ｄ−乳酸の製造方法 |
| JP2009142256A (ja) * | 2007-03-19 | 2009-07-02 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ｄ−乳酸の製造方法 |
-
1994
- 1994-11-18 JP JP28550394A patent/JP3664506B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003088392A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-03-25 | Toray Ind Inc | Ｄ−乳酸の製造方法 |
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| JP2009142256A (ja) * | 2007-03-19 | 2009-07-02 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ｄ−乳酸の製造方法 |
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|---|---|
| JP3664506B2 (ja) | 2005-06-29 |
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