JPH0528106B2

JPH0528106B2 -

Info

Publication number: JPH0528106B2
Application number: JP2697886A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Sakimae; Ryozo Numazawa; Hisao Oonishi
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1986-02-12
Filing date: 1986-02-12
Publication date: 1993-04-23
Also published as: JPS62186791A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は優れた反復使用性能を有する固定化酵
素の製法に関する。この酵素は、一般式（式中R₁はアルキル基、アラルキル基又はアリ
ール基、R₂及びR₃はアルキル基、ｎは１又は２
を示す）で表わされるエステルを生物化学的に不
斉加水分解して、対応する一般式（式中R₁、及びR₂及びｎは前記の意味を有する）
で表わされる光学活性カルボン酸及びその対掌体
エステルを生成する能力を有する。前記の光学活性カルボン酸及びその対掌体エス
テルは、種々の生理活性物質を合成するための原
料として注目されている。本発明者らは、これら
光学活性体を生物化学的に有利に製造する方法に
ついて先に特許出願している（特開昭58−
208192、同60−12993号、同60−30692号、同60−
94091号及び同60−141297号各公報参照）。更に、
この反応における酵素や菌体の利用効率を上げる
ため、これらを繰り返して反応に用いることも提
案している（特開昭60−256391号公報参照）。と
ころがこの繰り返し使用においては、過や遠心
分離で反応液から酵素や菌体が回収されるが、酵
素や菌体のサイズがあまりにも小さく、また反応
液との比重差が小さいため、回収が容易でなく多
大な労力を要するという問題点があつた。本発明者らは、この問題を解決するため、まず
アクリルアミド系の重合体ゲルで酵素含有菌体を
包括して固定化することを試みた。このアクリル
アミド系の重合体ゲルを用いる固定化法は従来か
らよく研究されており（例えば発酵と工業
Vol35、No.３ P281〜293（1977）参照）、酵素と
アクリルアミドの混合液を調製して、これを重合
させ、生成したゲル内に酵素を包括する方法であ
る。しかし、この方法で製造した固定化酵素は、
繰り返し使用の度に固定化酵素の活性低下が著し
く、かつ懸濁中にゲルが破損することが問題であ
る。そこで本発明者らはこれら問題点の発生原因に
ついて究明したところ、活性低下に関しては菌体
から遊離した酵素がゲルから反応液側に漏出する
ために生ずることが判つた。ゲルから酵素の漏失
を防止するためには、酵素分子を多官能性架橋剤
で処理してより高分子化し、ゲルの網目構造から
の溶出を防止する方法が知られている（例えば特
公昭58−36959号公報参照）。ところで架橋剤で酵
素を化学修飾する場合は、酵素の活性を損なわな
いような架橋剤を選択する必要があり、現在のと
ころいかなる酵素に対しても安定に架橋処理が可
能なものは知られていない。本発明における酵素
に対しても同様で、どの種類の架橋剤が安定であ
るかはまだ知られていない。更にその使用方法に
ついても一概に規定することが難しく、その酵素
に適した使用条件を見い出す必要がある。この様な背景のもとに、本発明者らは、種々の
架橋剤について探索したところ、アルデヒド基を
有する架橋剤が本発明の酵素の活性を損なわず安
定であることを見い出し、更にその使用方法につ
いて鋭意研究したところ、酵素含有菌体、多官能
性架橋剤及びアクリルアミド系単量体とをある割
合で均一に混合し、次いで重合させることによ
り、懸濁状態で繰り返し反応に使用しても酵素の
漏失がなく、しかも破損の少ない固定化酵素が得
られることを見出した。本発明は、一般式（式中R₁はアルキル基、アラルキル基又はアリ
ール基、R₂及びR₃はアルキル基、ｎは１又は２
を示す）で表わされるエステルを不斉加水分解し
て対応する光学活性カルボン酸及びその対掌体エ
ステルを生成する酵素含有菌体の１重量部に対し
て、アルデヒド基を有する多官能性架橋剤を0.01
〜0.25重量部及びアクリルアミド系単量体を0.5
〜10重量部混合したのち重合させ、次いで任意の
形状に成形することを特徴とする固定化酵素の製
法である。本発明に用いられる酵素含有菌体としては、式
の化合物のエステル結合を不斉加水分解する酵
素を含有する微生物が用いられる。微生物として
は、例えばトルロプシス属、バシルス属、アスペ
ルギルス属、キヤンデイダ属、ボツリヌス属、オ
フイロラス属、ケトミウム属、クラドスポリウム
属、シユードモナス属、エシエリキア属、スタフ
イロコツカス属、アルカリゲネス属、ストレプト
マイセス属、マイコバクテリウム属などのに属す
る微生物があげられる（特開昭60−12993号、同
60−30692号、同60−94091号及び同60−141297号
各公報参照）。この酵素含有菌体は、菌体のまま
でも、また凍結融解、破砕などの処理を施したも
のでも使用できる。これら酵素が不斉加水分解するエステル（）
は、β位又はγ位がチオアシル基で置換されたα
−アルキルカルボン酸のアルキルエステルであ
る。式で表わされるエステルのチオアシル基を
構成するR₁のためのアルキル基としては例えば
メチル基、エチル基など、アラルキル基としては
例えばベンジル基、アリール基としては例えばフ
エニル基などがあげられる。式のエステルとし
ては、Ｓ−アセチル−β−メルカプト−α−メチ
ルプロピオン酸メチル、Ｓ−アセチル−γ−メル
カプト−α−メチル−ｎ−酪酸メチル、Ｓ−ベン
ゾイル−β−メルカプト−α−メチルプロピオン
酸メチル、Ｓ−フエニルアセチル−β−メルカプ
ト−α−メチルプロピオン酸メチルのなどがあげ
られる。これらのエステルは酵素により不斉加水
分解されてβ位又はγ位がチオアシル基で置換さ
れた光学活性α−アルキルカルボン酸及びその対
掌体のアルキルエステルに変換される。本発明に用いられるアルデヒド基を有する多官
能性架橋剤とは、１分子中に２個以上のアルデヒ
ド基を有する化合物を意味し、このような化合物
としては、グルタルアルデヒド、グリオキサール
などが好ましい。またアクリルアミド系単量体と
しては、アクリルアミド、メタクリルアミド、
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミドなどが用
いられる。アクリルアミド系単量体と、共重合可
能なエチレン性不飽和単量体例えばジメチルアミ
ノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチル
メタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタク
リレート、ジエチルアミノプロピルメタクリルア
ミド及びこれらの第４級化物などを併用すること
もできる。固定化酵素を製造するに際しては、アクリルア
ミド系単量体、必要に応じ共重合可能なエチレン
性不飽和単量体及びアルデヒド基を有する多官能
性架橋剤を含む水性媒体中に酵素を含有する菌体
を加え、均一に混合したのち重合開始剤を用い、
PH５〜10、好ましくは６〜８、温度−10〜＋30℃
で重合ゲル化させる。重合開始剤としては、過硫酸カリ、過硫酸アン
モニウムなどのレドツクス系の開始剤が用いられ
る。重合を促進するためにジメチルアミノプロピ
オニトリル、トリエタノールアミンなどの重合促
進剤を添加してもよい。重合反応系中の菌体の量
は使用する菌体の種類、使用状態などにより異な
るが、通常0.1〜50重量％好ましくは１〜20重量
％である。この菌体１重量部に対して、アルデヒド基を有
する架橋剤0.01〜0.25重量部及びアクリルアミド
系単量体0.5〜10重量部の割合で用いられる。多
官能性架橋剤の使用量がこれより少ないと、酵素
の固定化が不完全となり、酵素の漏失が起こる。
一方これより多量に添加するとアクリルアミド系
単量体の重合が阻害され、機械的強度の大なる重
合体ゲルが得られにくい。またアクリルアミド系
単量体の使用量も生成した重合体ゲルの強度、活
性の発現に大きく影響を与え、使用量がこれより
少ないと酵素の固定化が不完全となり、一方これ
より多量に使用すると、酵素の活性発現が妨げら
れる。なおアクリルアミド系単量体とエチレン性
不飽和単量体を用いる場合は、前者１重量部に対
して後者を0.01〜0.5重量部用いることが好まし
い。次いで菌体、多官能性架橋剤及び単量体を機械
的手段により均一に混合したのち重合させる。こ
の重合操作においては、通常、混合物に対して
0.05〜0.5重量％の重合触媒を添加する。重合反
応は酵素を除去した雰囲気例えば窒素ガス雰囲気
中で行うことが好ましい。重合終了後、重合物を例えば粒状に成形すると
固定化酵素が得られる。この粒状物の形状は救
状、円柱状、角柱状等のいずれでもよい。また反
応液からの回収の容易性、酵素の活性発現の度合
等から、粒径は0.1〜2.0mmが好ましい。成形の手
段としては例えば細断機が用いられる。こうして
得られた固定化酵素では、酵素はアルデヒド基を
有する多官能性架橋剤で架橋され、またアクリル
アミド系重合体ゲル中に包括されていると考えら
れる。固定化酵素を用いて化合物（）の加水分解反
応を行う際には、反応媒体中に固定化酵素を化合
物（）と共に懸濁する。反応媒体としては、例
えばイオン交換水や緩衝液が用いられる。反応媒
体中に固定化酵素は0.1〜10重量％、エステル
（）は0.01〜50重量％の濃度で懸濁することが
好ましい。反応終了後、固定化酵素を過、遠心
分離等により回収し、再び新たな反応媒体に加え
て反応させる。この繰り返し使用において長期間
有効に活性を発現させるためには、反応時のPHを
５〜８に調整し、かつ反応温度を35℃以下に維持
することが好ましい。特にPHに関しては生成した
カルボン酸によりPHが低下してくるので、中和剤
例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどを
添加することが好ましい。反応液からの生成物の
分離精製は通常の方法、例えば抽出、再結晶、カ
ラムクロマトグラフイ等により行うことができ
る。本発明方法によれば、長期間にわたり繰り返し
使用できる固定化酵素を容易に得ることができ
る。また本発明により得られた固定化酵素を用い
て、式のエステルの不斉加水分解を行う場合
は、反応液から固定化酵素を簡単に回収すること
ができる。実施例１ DL−Ｓ−アセチル−β−メルカプト−α−メ
チルプロピオン酸メチルを不斉加水分解する能力
を有するシユードモナス・フルオレツセンスMR
−2021（微工研菌寄7816号）の凍結融解菌体（含
水率87.9重量％）30ｇにアクリルアミド8.0ｇ、
メチレンビスアクリルアミド0.4ｇを溶解した生
理的食塩水10mlを加え、ミキサーで充分に混合し
た。次いで25重量％とグルタルアルデヒド水溶液
1.0ml、５重量％ジメチルアミノプロピオニトリ
ル水溶液5.0ml及び2.5重量％K₂S₂O₈水溶液5.0ml
を加えてN₂雰囲気下、充分混合したのち、５℃
で約２時間重合反応を行つた。反応終、了後重合
物を10メツシユの金網上で押しつぶし、この網目
を通した破砕物をＭ／20リン酸緩衝液（PH7.0）
で洗浄して固定化酵素を得た。なお比較のため前
記の操作中、グルタルアルデヒドを添加しない固
定化酵素も調製した。この固定化酵素（湿潤状態10ｇ）をイオン交換
水180mlに懸濁したのち、DL−Ｓ−アセチル−β
−メルカプト−α−メチルプロピオン酸メチル10
ｇを加え、30℃で24時間反応を行つた。反応中は
1.0重量％のNaOHでPHを7.0に調整した。反応終
了後、固定化酵素を60メツシユの金網で回収した
のち再度前記と同一条件で反応を繰り返し、Ｄ−
（−）−Ｓ−アセチル−β−メルカプト−α−メチ
ルプロピオン酸の生成量の推移を調べた。なお反
応生成物のＤ−（−）−Ｓ−アセチル−β−メルカ
プト−α−メチルプロピオン酸は高速液体クロマ
トグラフイで定量した。その結果を第１表に示
す。表中の数字は使用１回目のＤ−（−）−Ｓ−ア
セチル−β−メルカプト−α−メチルプロピオン
酸の生成量を100にしたときの活性推移を示す。
これよりグルタルアルデヒドで架橋した場合、非
常に活性持続性が良いことが知られる。

【表】実施例２実施例１と同じ凍結融解菌体（含水率80.0重量
％）450ｇをＭ／20リン酸緩衝液（PH7.0）150ｇ
に懸濁し、これに27.5重量％の単量体混合液〔ア
クリルアミド／Ｎ，N′−メチレンビスアクリル
アミド／ジメチルアミノエチルメタリレートが
10／１／１（重量比）である単量体混合物を27.5
重量％含有するＭ／20リン酸緩衝液（PH7.0）〕
312ｇ及び重合促進剤として5.0重量％のジメチル
アミノプロピオニトリル88ｇを加えて、ミキサー
で混合し、菌体／単量体混合液1000ｇを調製し
た。この混合液100ｇに対し25重量％のグルタル
アルデヒド水溶液を0.1〜16ｇ及び5.0重量％の過
硫酸カリ水溶液11ｇを加え、窒素雰囲気中、５℃
で混合した。混合後、約20秒でゲル化した。重合
反応は氷水で冷却して重合物の中心部の温度を30
℃以下に維持して行つた。反応終了後、重合物を
一晩５℃で放置したのち、10メツシユの金網から
重合物を押し出して破砕した。破砕物をＭ／20リ
ン酸緩衝液（PH7.0）500mlで１時間洗浄したの
ち、60メツシユの金網で固液分離して粒状固定化
酵素を調製した。仕込みグルタルアルデヒドの量を変化させたと
きの固定化酵素の性能を調べるため、活性試験及
び酵素の漏失試験を行つた。この固定化酵素（湿
潤状態で10ｇ）をイオン交換水180mlに懸濁した
のち、DL−Ｓ−アセチル−β−メルカプト−α
−メチルプロピオン酸メチル10ｇを加え、30℃、
PH7.0で１時間の反応を行い、Ｄ−（−）−Ｓ−ア
セチル−β−メルカプト−α−メチルプロピオン
酸の生成量から活性を求めた。酵素の漏失試験は次のように行つた。湿潤状態
の固定化酵素10ｇをＭ／２リン酸緩衝液（PH7.0）
100mlに加え、25℃で24時間洗浄した。この洗浄
を毎日繰り返し、15日目及び30日目の残存活性を
調べた。なお、活性の１単位(U)とは、１時間当り
１mgのＤ−（−）−Ｓ−アセチル−β−メルカプト
−α−メチルプロピオン酸を生成する酵素活性と
定義した。その結果を第２表に示す。この成績か
ら、グルタルアルデヒドを、菌体１重量部に対し
て0.01〜0.25重量部用いると良好な固定化酵素が
得られることが知られる。

【表】＊：×は使用不能、△は使用可能、○
は良好に使用できる。
実施例３菌体／グルタルアルデヒドの仕込み割合を
1.0／0.11に固定し、単量体の仕込み割合を変え
て固定化を行つた。固定化操作及び固定化酵素の
性能評価は実施例２と同じである。その結果を第
３表に示す。この成績から菌体１重量部に対して
単量体を0.5〜10重量部用いると、良好な固定化
酵素が得られることが知られる。

【表】＊：×は使用不能、△は使用可能、○
は良好に使用できる。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中R₁はアルキル基、アラルキル基又はアリ
ール基、R₂及びR₃はアルキル基、ｎは１又は２
を示す）で表わされるエステルを不斉加水分解し
て対応する光学活性カルボン酸及びその対掌体エ
ステルを生成する酵素含有菌体の１重量部に対し
て、アルデヒド基を有する多官能性架橋剤を0.01
〜0.25重量部及びアクリルアミド系単量体を0.5
〜10重量部混合したのち重合させ、次いで任意の
形状に成形することを特徴とする固定化酵素の製
法。２菌体がシユードモナス属の微生物から調製さ
れたものであることを特徴とする、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。３多官能性架橋剤がグルタルアルデヒドである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
方法。