JPH02124097A - アミノ酸のラセミ化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アミノ酸をラセミ化する酵素（以下、アミノ
酸ラセマーゼと言う）を含有する微生物菌体又はその固
定化物を用いてアミノ酸をラセミ化する方法に関する。

更に詳しくは、本発明は、アミノ酸ラセマーゼを含有す
る菌体の細胞膜透過性を改善した該菌体又はその固定化
物を用いてアミノ酸を効率良くラセミ化する方法に関す
る。

（従来の技術と課題） 従来、アミノ酸ラセマーゼを含有する微生物の培養集菌
体では膜透過性が悪いことによりラセミ化活性が見掛は
上低いという欠点を何していた。

その課題に対処するために通常菌体を物理的に破砕し、
細胞膜等を取り除く方法が行なわれているが、このよう
な方法では、ラセマーゼに損傷を与えることがあったり
、破砕操作に特殊な装置を必要とする等の欠点あり工業
的な方法としては極めて不都合であった。

（発明の構成） 本発明者には、アミノ酸ラセマーゼを含有する微生物の
培養集菌体の細胞膜透過性を改善する方法を鋭意検討し
、アミノ酸を効率良くラセミ化する方法を完成した。

かくして、本発明は、アミノ酸ラセマーゼを含有する微
生物菌体又は通常よく使用される固定化担体（例えば、
アクリルアミド、アルギン酸、に−カラギナン等）に固
定化した固体化物をグリコシダーゼ系細胞壁溶解酵素と
接触処理させた後に、該処理物の存在下にアミノ酸を反
応させてアミノ酸をラセミ化する方法を提供するもので
ある。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、アミノ酸ラセマーゼを含有する
微生物菌体の細胞膜透過性をは温和な条件で向上させる
ことができ、ラセマーゼ活性を損うことなく、充分な活
性を引き出すことができ、その結果、高収率でアミノ酸
をラセミ化す乙ことかできるという優れたアミノ酸のラ
セミ化方法が提供される。

（発明の詳細な説明） 本発明は、アミノ酸ラセマーゼを含有する微生物又はそ
の固定化物を用いてアミノ酸をラセミ化するに際し、ア
ミノ酸ラセマーゼを含有する微生物又はその固定化物を
予め細胞壁溶解酵素と接触処理した後、その処理物を酵
素触媒として使用することを特徴とするものである。

本発明に使用しうる微生物は、アミノ酸ラセマーゼを産
生する能力を有する微生物であって、グリコシダーゼ系
細胞壁溶解酵素に感受性であれば特に制限されるもので
はなく各種の微生物を使用することができるか、具体的
には例えば、シュードモナス０プチダ（Ｐ　ｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　　ｐｕｔｉｄａ）　　Ｉ　Ｆ０１２９９６
、シュードモナス・タエトロレンス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　　ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）　　Ｉ　Ｆ○３４
６０、エスエリヒア・コリ　（Ｅ　５ｃｈｅｒｊｃｈｉ
ａ　　ｃｌｏｉ）　Ａ　ＴＣＣ９６３７、プロテウス・
ブルガリス（Ｐ　ｒａｔｅｕｓ　　ｖｕｌｇａｒｉｓ）
　Ａ　Ｔ　ＣＣ４６６９等が挙げられる。

上記微生物を培養する際に用いうる培地としては、炭素
源として、グルコース、グリセロール、フラクトース、
シュクロース、糖蜜等の種々の炭水化物が使用でき、ま
た、窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナ
トリウム、硝酸カリ、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、ア
ンモニウム等が好適に用いられ、無機物としては、リン
酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等
が用いられる。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ
酸等の栄養源を添加することもできる。

培養温度は通常２０°Ｃ〜５０°Ｃ１好ましくは３０〜
４０°Ｃであり、培養中の培地のｐＨは約７．２に調節
するのが適当である。

ｐＨの調節のために使用しうるアルカリ性物質としては
、アンモニア水並びに水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム及び水酸化カルシウムの水溶液が好適に用いられる。

培養は通気撹拌条件下に好気的に行うことができる。

このようにして培養増殖した微生物菌体は必要に応じて
、それ自体既知の方法、例えばＭｅｔｈｏｄｓｉｎ　　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　　ｌ　３６　　Ｅ
ｄｉｔｅｄ　　ｂｙＫｌａｕｓ　　Ｍｏ５ｂａｃｈ、　
ｌ　９８７年Ａ　ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐ　ｒｅｓｓ　　
Ｉ　ｎｃ、に記載の方法に従って担体に固定化すること
ができる。

本発明は、このようにして調製される微生物菌体又はそ
の固定化物を、その使用に先立ち、細胞壁溶解酵素で接
触処理する点に特徴がある。

本発明に従い用いることのできる細胞壁溶解酵素は、細
胞壁の主たる構成物である多糖のグリコンド結合を加水
分解する酵素であり、殊にグリコシダーゼを用いるのが
好ましく、中でもリゾチム及び／又はＮ−アセチルムラ
ミダーゼの使用が好ましい。

上記培養微生物菌体又はその固定化物と細胞壁溶解酵素
との接触は、例えば、該酵素を含有する水又は適当な緩
衝液等に上記培養微生物集菌体又はその固定化物を懸濁
させたものを用いることができ、また、培養の末期に培
地（こ該酵素を添加するようにしてもよい。

該酵素の添加濃度は、特に制限されるものではないが、
一般に０．０００１〜０．０１重量％の範囲内が好適に
用いられる。この接触処理時のｐＨは通常５〜９、好ま
しくは６〜８の範囲内とすることができ、また、アミノ
酸ラセマーゼ含有菌体の濃度は特に限定されるものでは
ないが、好ましくは０．１〜５０重量％の範囲内の濃度
で用いることができる。接触鬼理時の温度は一般に０〜
５０°Ｃ１好ましくは４〜３０℃であり、接触時間は接
触温度等の条件によっても異なるが、例えば１０９〜３
時間、好ましくは２０分〜２時間が適当である。

上記のようにして調製される菌体又はその固定化物は、
アミノ酸のラセミ化反応に酵素触媒として使用される。

このアミノ酸のラセミ化反応は、通常の酵素反応と同様
にして行なうことができ、例えば、０゜１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０〜９．０）あるいは水ＣｐＨ７，０〜９
、Ｏ）等の溶媒中で、一般に約２０−５０°Ｃ１好マシ
くハ約３０〜４０′ｃの温度で通常約２〜約７２時間行
なわれる。

該反応に使用しうるアミノ酸の濃度は、特に制限される
ものではないが、一般には０．０５〜２０重量％の濃度
範囲で使用するのが適当である。

また、該微生物菌体又はその固定化物の使用量も特に制
限されるものではないが、一般に０．１〜２０％（ｗｔ
／ｖｏｆ２）の濃度で使用することができる。

以上に述べた酵素法によるラセミ化反応によってラセミ
化しうるアミノ酸としては、例えば、リジン、アルギニ
ン、メチオニン、−グルタミン、ノルロイシン、ノルバ
リン、セリン、ホモセリン、アラニンなどが挙げられる
が特に好ましくは、リジン、アルギニン、メチオニン、
セリンである。

反応後の反応液中のアミノ酸のラセミ化の程度は、旋光
度の変化から容易に求めることができる。

以下、実施例を掲げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例Ｉ 下記第１表に示す培地１００ｍＱを５００ｍ（２容三角
フラスコに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した
ものに、シュードモナス・プチダ（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　　ｐｕｔｉｄａ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏｌ　２９９６
を植菌し、３７°Ｃで１日振盪培養後、該培養物の２０
ｍρを同様にして調製した培地１０００ｍｆｆに接種し
、３７°Ｃにて回転数６００　ｒｐｍ、通気ｉ１ｖｖｍ
、　ｐＨ７，２（２８％アンモニア水で調整）にて１５
時間培養した。

第１表 グリセロール ＫＨ２ＰＯ。

２ＨＰＯ４ （Ｎ　Ｈ４）２　Ｓ　Ｏ４ Ｍｇ５ｏ、・７Ｈ，０ ＦｅＳ　Ｏ，・７　Ｈ，０ 酵母エキス ペプトン 蒸留水 （ｐＨ７，２） 培養終了後、該培養液１００ｍＱづつから遠心分離（８
０００ｒｐｍ、　　１５分間、４°Ｃ）にて集菌後、該
菌体を下記第３表に示す各酵素を含有する０゜５ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸酢酸水溶液１０２（水を溶媒とす
る、ｐＨ８，０）に懸濁し、４°Ｃにて０゜５時間静置
保存した。該保存液から遠心分離（８０ｇ １．６ｇ ５．５ｇ ３．０ｇ Ｏ，１ｇ ０ｍｇ １．０ｇ １．０ｇ ０００ｍＱ Ｑ　Ｑ　Ｑｒｐｍ、　　１５分間、４°Ｃ）にて集菌後
、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）の２０ｍ
ｃにて１度洗浄し、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分
間、４℃）した該集菌体を下記第２表に示す反応液５０
ｎ＋ρに懸濁させて、３７°Ｃ１５時間反応させた。反
応終了後遠心分離（８０００ｒｐｍ、　　１５分間、４
℃）にて除菌後、上澄液中のし一セリン量を旋光度変化
から求めた。

なお、旋光度針は日本分光製ＤＩＰ−３６０を使用した
。その結果を第３表に示す。

第　　２　　表 Ｄ−セリン　　　　　　　　　　１００ｍＭピリドキサ
ール−５′−リン酸　　　０−００−０４ｍＭ１Ｏ０リ
ス塩酸緩衝液　　　５０ｍＱ（ｐＨ７，８） ＠３表 細胞壁　　　　濃度　　　Ｌ−セリン 溶解酵素　　　（重量％）　　生成量（ｍＭ）リゾチー
ム　　　　０．００１　　　　　４２無添加＊１２ （＊培養集菌体を水に浸漬し、４°Ｃで０．５ｈｒ静置
保存） 実施例２ 実施例１で調製した培養液１００ｍｆｌづつから遠心分
離（８０００ｒｐｍ、　　１５分間、４°Ｃ）にて集菌
後、純水に懸濁しｊ；１０ｍｇとし、これに１．５ｇの
アクリルアミド、Ｏ，１ｇのＮ、Ｎ’−メチレン−ビス
−アクリルアミド、４％β−（ジメチルアミノ）−プロ
ピオニトリル０．１５ｍｆｆおよび２％過硫酸カリウム
１ｍ０．を加えて室温にて静置後、５ｍｍ角に切断し、
純水にて洗浄して固定化菌体１５ｇを得た。

このようにして得られた固定化菌体を実施例１と同様の
操作により４°Ｃにて１時間静置保存した。

該保存液から濾過により集菌後、実施例１と同様の反応
を行い、反応終了液中のＬ−セリン量を定量した。その
結果を第４表に示す。

第　　４　　表 リゾチーム　　　　０．００１　　　　　２６Ｎ−アセ
チルム ラミダーゼ ０．００１ 無添加水 （本固定化菌体を水に浸漬し、 ４°Ｃでｌｈｒ静置保 存）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸をラセミ化する酵素を含有する微生物菌
   体又はその固定化物を用いてアミノ酸をラセミ化するに
   あたり、該微生物菌体又はその固定化物を予め細胞壁溶
   解酵素と接触処理することを特徴とするアミノ酸のラセ
   ミ化方法。
2. （２）細胞壁溶解酵素がグリコシダーゼである特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. （３）グリコシダーゼがリゾチーム又はＮ−アセチルム
   ラミダーゼである特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）アミノ酸をラセミ化する酵素を含有する微生物が
   グリコシダーゼに感受性である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。