JPH11341979A - ニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法 - Google Patents
ニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法Info
- Publication number
- JPH11341979A JPH11341979A JP15175898A JP15175898A JPH11341979A JP H11341979 A JPH11341979 A JP H11341979A JP 15175898 A JP15175898 A JP 15175898A JP 15175898 A JP15175898 A JP 15175898A JP H11341979 A JPH11341979 A JP H11341979A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nitrilase
- producing
- microorganism
- culture
- growth phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養に
際し、特定の培養条件を採用することにより、ニトリラ
ーゼ活性の高い微生物菌体の製造法を提供すること。 【解決手段】 ニトリラーゼ産生能を有する微生物、例
えばアースロバクター（Arthrobacter）属に属するアー
スロバクター（Arthrobacter） sp. NSSC104株を培地に
培養し、その対数増殖期が終了した後、炭素源、好まし
くは糖類を添加、好ましくは対数増殖期までに資化され
た窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算量とし
て５〜２０倍の量添加してさらに熟成培養し、ニトリラ
ーゼ高生産性微生物菌体を得る。
際し、特定の培養条件を採用することにより、ニトリラ
ーゼ活性の高い微生物菌体の製造法を提供すること。 【解決手段】 ニトリラーゼ産生能を有する微生物、例
えばアースロバクター（Arthrobacter）属に属するアー
スロバクター（Arthrobacter） sp. NSSC104株を培地に
培養し、その対数増殖期が終了した後、炭素源、好まし
くは糖類を添加、好ましくは対数増殖期までに資化され
た窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算量とし
て５〜２０倍の量添加してさらに熟成培養し、ニトリラ
ーゼ高生産性微生物菌体を得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼ酵素
活性の高い微生物菌体を高収量で生産するニトリラーゼ
高生産性微生物菌体の製造法に関する。酵素ニトリラー
ゼを生成蓄積する能力を有する微生物や酵素ニトリラー
ゼは、種々のニトリルを加水分解して対応する有機酸を
製造する触媒として有用である。
活性の高い微生物菌体を高収量で生産するニトリラーゼ
高生産性微生物菌体の製造法に関する。酵素ニトリラー
ゼを生成蓄積する能力を有する微生物や酵素ニトリラー
ゼは、種々のニトリルを加水分解して対応する有機酸を
製造する触媒として有用である。
【０００２】
【従来の技術】従来、ニトリラーゼ産生能を有する微生
物としては、例えば、カゼオバクター（Caseobacter）
属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アルカリゲネ
ス（Alcaligenes）属、コリネバクテリウム（Corynebac
terium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属、ノカルジア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodoc
occus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、ゴ
ルドナ（Gordona）属、バチルス（Bacillius）属、バク
テリジウム（Bacteridium）属、ミクロコッカス（Micro
coccus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属等
に属する微生物が知られている［特公昭６３−２５９６
号公報、特開平３−２５１１９２号公報、特開平４−４
０８９８号公報、特開平８−１７３１５２号公報、特開
平８−１７３１７５号公報、国際公開ＷＯ９６−０９４
０３号公報、国際公開９７−３２０３０号公報参照］。
物としては、例えば、カゼオバクター（Caseobacter）
属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アルカリゲネ
ス（Alcaligenes）属、コリネバクテリウム（Corynebac
terium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属、ノカルジア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodoc
occus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、ゴ
ルドナ（Gordona）属、バチルス（Bacillius）属、バク
テリジウム（Bacteridium）属、ミクロコッカス（Micro
coccus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属等
に属する微生物が知られている［特公昭６３−２５９６
号公報、特開平３−２５１１９２号公報、特開平４−４
０８９８号公報、特開平８−１７３１５２号公報、特開
平８−１７３１７５号公報、国際公開ＷＯ９６−０９４
０３号公報、国際公開９７−３２０３０号公報参照］。
【０００３】しかし、ニトリラーゼ産生能を有する微生
物におけるニトリラーゼの活性は一般に低く、そのニト
リラーゼ活性を高めるため、上記特公昭６３−２５９６
号公報、特開平３−２５１１９２号公報、特開平８−１
７３１５２号公報等に記載されているように、イソブチ
ロニトリル、エチレンシアンヒドリンなどのニトリル化
合物やラクタム化合物をニトリラーゼ誘導物質として添
加して微生物の培養を行う方法が提案されている。これ
らニトリラーゼ誘導物質の添加によりニトリラーゼの活
性発現にかなりの改善が見られるものの、実用的見地か
らは未だ不十分で、更に高いニトリラーゼ活性の発現を
実現するニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法の開
発が望まれていたが、微生物のニトリラーゼ産生能を高
める手段として、特定の培養条件すなわち微生物の増殖
停止後に、炭素源のみを更に添加することが有効である
ことは、従来知られていなかった。
物におけるニトリラーゼの活性は一般に低く、そのニト
リラーゼ活性を高めるため、上記特公昭６３−２５９６
号公報、特開平３−２５１１９２号公報、特開平８−１
７３１５２号公報等に記載されているように、イソブチ
ロニトリル、エチレンシアンヒドリンなどのニトリル化
合物やラクタム化合物をニトリラーゼ誘導物質として添
加して微生物の培養を行う方法が提案されている。これ
らニトリラーゼ誘導物質の添加によりニトリラーゼの活
性発現にかなりの改善が見られるものの、実用的見地か
らは未だ不十分で、更に高いニトリラーゼ活性の発現を
実現するニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法の開
発が望まれていたが、微生物のニトリラーゼ産生能を高
める手段として、特定の培養条件すなわち微生物の増殖
停止後に、炭素源のみを更に添加することが有効である
ことは、従来知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】すなわち、本発明の課
題は、ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養に際
し、特定の培養条件を採用することにより、ニトリラー
ゼ活性の高い微生物菌体を得ることができるニトリラー
ゼ高生産性微生物菌体の製造法を提供することにある。
題は、ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養に際
し、特定の培養条件を採用することにより、ニトリラー
ゼ活性の高い微生物菌体を得ることができるニトリラー
ゼ高生産性微生物菌体の製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ニトリラ
ーゼ産生能を有する微生物の培養条件、特に培地中の炭
素源と窒素源のバランスを種々検討した結果、微生物の
増殖停止後、すなわち、対数増殖期終了後に、炭素源の
みを添加することにより、微生物菌体当たりのニトリラ
ーゼ酵素の発現量が著しく向上することを見い出し、本
発明を完成するに至った。
ーゼ産生能を有する微生物の培養条件、特に培地中の炭
素源と窒素源のバランスを種々検討した結果、微生物の
増殖停止後、すなわち、対数増殖期終了後に、炭素源の
みを添加することにより、微生物菌体当たりのニトリラ
ーゼ酵素の発現量が著しく向上することを見い出し、本
発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、ニトリラーゼ産生能
を有する微生物、例えばアースロバクター（Arthrobact
er）属に属するアースロバクター（Arthrobacter） sp.
NSSC104株を培地に培養し、その対数増殖期が終了した
後、炭素源、好ましくは糖類を添加してさらに熟成培養
することを特徴とするニトリラーゼ高生産性微生物菌体
の製造法に関する。
を有する微生物、例えばアースロバクター（Arthrobact
er）属に属するアースロバクター（Arthrobacter） sp.
NSSC104株を培地に培養し、その対数増殖期が終了した
後、炭素源、好ましくは糖類を添加してさらに熟成培養
することを特徴とするニトリラーゼ高生産性微生物菌体
の製造法に関する。
【０００７】また本発明は、ニトリラーゼ産生能を有す
る微生物、例えばアースロバクター（Arthrobacter）属
に属するアースロバクター（Arthrobacter） sp. NSSC1
04株を培地に培養し、その対数増殖期が終了した後、炭
素源、好ましくは糖類を、対数増殖期までに資化された
窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算量として
５〜２０倍の量添加してさらに熟成培養することを特徴
とするニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法に関す
る。
る微生物、例えばアースロバクター（Arthrobacter）属
に属するアースロバクター（Arthrobacter） sp. NSSC1
04株を培地に培養し、その対数増殖期が終了した後、炭
素源、好ましくは糖類を、対数増殖期までに資化された
窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算量として
５〜２０倍の量添加してさらに熟成培養することを特徴
とするニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法に関す
る。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明において、ニトリラーゼ産
生能を有する微生物とは、種々のニトリルを加水分解し
て対応する有機酸を生成させることができる微生物を意
味し、ニトリラーゼ産生能を有する微生物としては、前
記したカゼオバクター属、シュードモナス属、アルカリ
ゲネス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、ノカルジア属、ロドコッカス属、アースロバクター
属、ゴルドナ属、バチルス属、バクテリジウム属、ミク
ロコッカス属、アシネトバクター属等に属する公知のニ
トリラーゼ産生微生物を例示することができるが、これ
らに限ることなく、例えば遺伝子操作により得られるニ
トリラーゼ産生能を有する微生物であっても用いること
ができる。
生能を有する微生物とは、種々のニトリルを加水分解し
て対応する有機酸を生成させることができる微生物を意
味し、ニトリラーゼ産生能を有する微生物としては、前
記したカゼオバクター属、シュードモナス属、アルカリ
ゲネス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、ノカルジア属、ロドコッカス属、アースロバクター
属、ゴルドナ属、バチルス属、バクテリジウム属、ミク
ロコッカス属、アシネトバクター属等に属する公知のニ
トリラーゼ産生微生物を例示することができるが、これ
らに限ることなく、例えば遺伝子操作により得られるニ
トリラーゼ産生能を有する微生物であっても用いること
ができる。
【０００９】そして、ニトリラーゼ産生能を有する微生
物として、具体的には、アースロバクター属の微生物、
例えば、アースロバクター（Arthrobacter） sp. NSSC1
04［ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２９］、アースロバクター
（Arthrobacter） sp. HR4［ＦＥＲＭ Ｐ−１１３０
２］等を挙げることができる。これらのうち、アースロ
バクター sp. NSSC104株は、本出願人によって見出され
たものであり、その菌学的性質は、国際公開ＷＯ９７−
３２０３０号公報に記載されている。
物として、具体的には、アースロバクター属の微生物、
例えば、アースロバクター（Arthrobacter） sp. NSSC1
04［ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２９］、アースロバクター
（Arthrobacter） sp. HR4［ＦＥＲＭ Ｐ−１１３０
２］等を挙げることができる。これらのうち、アースロ
バクター sp. NSSC104株は、本出願人によって見出され
たものであり、その菌学的性質は、国際公開ＷＯ９７−
３２０３０号公報に記載されている。
【００１０】ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養
に使用される培地としては、該微生物が生育しうるもの
であれば天然培地、合成培地のいずれであってもよく、
該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等の他
に、ニトリラーゼ酵素誘導物質を含有する培地が好まし
い。そして、ニトリラーゼ酵素誘導物質としては、イソ
ブチロニトリル、エチレンシアンヒドリン等のニトリル
化合物、ε−カプロラクタム等の環状アミド化合物など
を例示することができる。
に使用される培地としては、該微生物が生育しうるもの
であれば天然培地、合成培地のいずれであってもよく、
該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等の他
に、ニトリラーゼ酵素誘導物質を含有する培地が好まし
い。そして、ニトリラーゼ酵素誘導物質としては、イソ
ブチロニトリル、エチレンシアンヒドリン等のニトリル
化合物、ε−カプロラクタム等の環状アミド化合物など
を例示することができる。
【００１１】また、炭素源としては、グルコース、フラ
クト−ス、スクロース、マルトース又はこれらを含有す
る糖蜜等の糖類や、デンプン又はデンプン加水分解物等
の炭水化物や、酢酸、乳酸等の有機酸や、エタノール、
グリセリン、プロパノール等のアルコール類が、単独又
は混合して用いられる。これらの炭素源は、熟成培養に
おける炭素源としても用いられるが、熟成培養における
炭素源としては、これらの中でも工業的に均質な物が安
価に入手することができる点で糖類が好ましい。
クト−ス、スクロース、マルトース又はこれらを含有す
る糖蜜等の糖類や、デンプン又はデンプン加水分解物等
の炭水化物や、酢酸、乳酸等の有機酸や、エタノール、
グリセリン、プロパノール等のアルコール類が、単独又
は混合して用いられる。これらの炭素源は、熟成培養に
おける炭素源としても用いられるが、熟成培養における
炭素源としては、これらの中でも工業的に均質な物が安
価に入手することができる点で糖類が好ましい。
【００１２】窒素源としては、アミン類、アミノ酸類、
硝酸塩類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニ
ウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、トリ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカ
ー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解
物、各種発酵菌体およびその消化物等を例示することが
できる。また、無機塩類としては、りん酸第一カリウ
ム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。これら培
地成分の添加は、一括で行っても、分割あるいは連続で
行っても良い。
硝酸塩類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニ
ウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、トリ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカ
ー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解
物、各種発酵菌体およびその消化物等を例示することが
できる。また、無機塩類としては、りん酸第一カリウ
ム、りん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。これら培
地成分の添加は、一括で行っても、分割あるいは連続で
行っても良い。
【００１３】ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養
は、一般に、通気攪拌による好気条件下、ｐＨ６〜１
０、温度２５〜３７℃の適当な範囲に制御して微生物の
増殖が停止、すなわち対数増殖期が終了するまで行われ
る。対数増殖期の終了は、例えば培地中の溶存酸素濃度
の回復を測定することにより判断することができる。微
生物の増殖停止後、すなわち対数増殖期終了後、炭素
源、好ましくは糖類のみを含有する培地が添加され、熟
成培養が行われる。熟成培養中、微生物は実質的に増殖
することはないが、この熟成培養により、微生物菌体を
ニトリラーゼ高生産性微生物菌体とすることができる。
熟成培養は、基本的に微生物の増殖工程に採用した培養
条件と同じ培養条件で行うことができ、また微生物菌体
中のニトリラーゼ活性が最大になるまでの期間、通常１
〜５日、好ましくは３日程度行われる。
は、一般に、通気攪拌による好気条件下、ｐＨ６〜１
０、温度２５〜３７℃の適当な範囲に制御して微生物の
増殖が停止、すなわち対数増殖期が終了するまで行われ
る。対数増殖期の終了は、例えば培地中の溶存酸素濃度
の回復を測定することにより判断することができる。微
生物の増殖停止後、すなわち対数増殖期終了後、炭素
源、好ましくは糖類のみを含有する培地が添加され、熟
成培養が行われる。熟成培養中、微生物は実質的に増殖
することはないが、この熟成培養により、微生物菌体を
ニトリラーゼ高生産性微生物菌体とすることができる。
熟成培養は、基本的に微生物の増殖工程に採用した培養
条件と同じ培養条件で行うことができ、また微生物菌体
中のニトリラーゼ活性が最大になるまでの期間、通常１
〜５日、好ましくは３日程度行われる。
【００１４】微生物の増殖停止後、すなわち対数増殖期
終了後に添加される炭素源の量は、対数増殖期までに資
化された窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算
量として５〜２０倍量の範囲から選択される。炭素源の
添加量はこの範囲が特に好ましく、この２０倍を超えて
も、あるいは５倍未満であっても、５〜２０倍量の添加
範囲の場合に比べて高いニトリラーゼ酵素の発現が得ら
れない。例えば、炭素源としてグルコースを添加する場
合、グルコース中の全炭素量は４０重量％なので、資化
された窒素源の全窒素換算重量に対して１２．５〜５０
倍重量のグルコースを加えることとなる。
終了後に添加される炭素源の量は、対数増殖期までに資
化された窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算
量として５〜２０倍量の範囲から選択される。炭素源の
添加量はこの範囲が特に好ましく、この２０倍を超えて
も、あるいは５倍未満であっても、５〜２０倍量の添加
範囲の場合に比べて高いニトリラーゼ酵素の発現が得ら
れない。例えば、炭素源としてグルコースを添加する場
合、グルコース中の全炭素量は４０重量％なので、資化
された窒素源の全窒素換算重量に対して１２．５〜５０
倍重量のグルコースを加えることとなる。
【００１５】炭素源の添加方法としては、一括で加える
方法や、間欠的ないし連続的に加える方法を採用するこ
とができ、その際炭素源濃度をモニターしながら添加し
てもよい。そして、微生物に資化された炭素源および窒
素源の定量は、培養液を適時サンプリングし、菌体を遠
心分離した上清を、炭素源は酵素法（Methods of Enzym
atic Analysis 2nd ed. Vol.3, p.1176-1179, p.1475-1
479; Verlag Chemie Weinheim, Academic Press, Inc.,
New York and London）により、窒素源はケルダール法
により分析することができる。
方法や、間欠的ないし連続的に加える方法を採用するこ
とができ、その際炭素源濃度をモニターしながら添加し
てもよい。そして、微生物に資化された炭素源および窒
素源の定量は、培養液を適時サンプリングし、菌体を遠
心分離した上清を、炭素源は酵素法（Methods of Enzym
atic Analysis 2nd ed. Vol.3, p.1176-1179, p.1475-1
479; Verlag Chemie Weinheim, Academic Press, Inc.,
New York and London）により、窒素源はケルダール法
により分析することができる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により詳細に説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。
明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１７】実施例におけるニトリラーゼ活性の測定は
次のようにして行った。２−ヒドロキシ−４−メチルチ
オブチロニトリル２５０ｍＭを含む１００ｍＭ Ｋ2Ｈ
ＰＯ4−ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．５）０．３ｍｌに
菌体懸濁液０．２ｍｌを添加して、３５℃、３０分間反
応を行った。反応後直ちに遠心分離で菌体を除き、反応
液中に生成した２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン
酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間
に１μｍｏｌの２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン
酸を生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。ま
た、ニトリラーゼ活性を測定する菌体懸濁液は次のよう
に調製した。１０ｍｌサンプリングした培養液から遠心
分離により集菌した後、１００ｍＭのＫ2ＨＰＯ4−ＫＨ
2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．５）を加え１０ｍｌとし菌体懸
濁液を得た。
次のようにして行った。２−ヒドロキシ−４−メチルチ
オブチロニトリル２５０ｍＭを含む１００ｍＭ Ｋ2Ｈ
ＰＯ4−ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．５）０．３ｍｌに
菌体懸濁液０．２ｍｌを添加して、３５℃、３０分間反
応を行った。反応後直ちに遠心分離で菌体を除き、反応
液中に生成した２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン
酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間
に１μｍｏｌの２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン
酸を生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。ま
た、ニトリラーゼ活性を測定する菌体懸濁液は次のよう
に調製した。１０ｍｌサンプリングした培養液から遠心
分離により集菌した後、１００ｍＭのＫ2ＨＰＯ4−ＫＨ
2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ７．５）を加え１０ｍｌとし菌体懸
濁液を得た。
【００１８】実施例１ 前培養用培地として、０．５重量％酵母エキス、０．５
重量％グルコース、０．５重量％ε−カプロラクタム、
０．１重量％Ｋ2ＨＰＯ4、０．１重量％ＫＨ2ＰＯ4、
０．０２重量％硫酸マグネシウム・７水和物、０．１重
量％塩化ナトリウム、０．００１重量％硫酸第一鉄・７
水和物を含み、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調
整した液体培地２００ｍｌを３リットル容の三角フラス
コに入れ、１２０℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄の
みは別にろ過滅菌して加えた）ものを用い、この前培養
用培地にアースロバクター sp. NSSC104株を接種して、
３３℃で３日間振盪培養して前培養を行った。
重量％グルコース、０．５重量％ε−カプロラクタム、
０．１重量％Ｋ2ＨＰＯ4、０．１重量％ＫＨ2ＰＯ4、
０．０２重量％硫酸マグネシウム・７水和物、０．１重
量％塩化ナトリウム、０．００１重量％硫酸第一鉄・７
水和物を含み、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調
整した液体培地２００ｍｌを３リットル容の三角フラス
コに入れ、１２０℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄の
みは別にろ過滅菌して加えた）ものを用い、この前培養
用培地にアースロバクター sp. NSSC104株を接種して、
３３℃で３日間振盪培養して前培養を行った。
【００１９】次に増殖用培地として、１重量％トリプト
ン、０．４重量％スクロース、０．５重量％ε−カプロ
ラクタム、０．１６重量％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０４重量％
ＫＨ 2ＰＯ4、０．０２重量％硫酸マグネシウム・７水和
物、０．００１重量％硫酸第一鉄・７水和物からなる液
体培地５．５リットルを１０リットル容のジャーファメ
ンターに入れ、１２０℃で２０分間滅菌した（硫酸第一
鉄のみは別にろ過滅菌して加えた）ものを用い、この増
殖用培地に、前培養で得られた培養液を接種して、３３
℃で通気攪拌培養した。培養開始後約１５時間で、溶存
酸素濃度が回復して、対数増殖期が終了した。対数増殖
期終了時までに資化された全窒素量は、サンプリング分
析の結果、０．７７ｍｇ／ｍｌであった。対数増殖期終
了後直ちに予め１１０℃、２０分間滅菌した２０重量％
スクロース溶液４８０ｍｌ（資化された窒素源の全窒素
換算重量に対して、全炭素換算量として１０倍弱）を加
え、３３℃で通気攪拌条件下、培養熟成を３日間続け
た。この培養液から遠心分離により集菌し、湿菌体２４
０ｇを得た。ニトリラーゼの発現活性は、培養液１ｍｌ
当たり１．９１Ｕであった。また、湿菌体１ｇ当たりの
活性は４７．８Ｕであった。
ン、０．４重量％スクロース、０．５重量％ε−カプロ
ラクタム、０．１６重量％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０４重量％
ＫＨ 2ＰＯ4、０．０２重量％硫酸マグネシウム・７水和
物、０．００１重量％硫酸第一鉄・７水和物からなる液
体培地５．５リットルを１０リットル容のジャーファメ
ンターに入れ、１２０℃で２０分間滅菌した（硫酸第一
鉄のみは別にろ過滅菌して加えた）ものを用い、この増
殖用培地に、前培養で得られた培養液を接種して、３３
℃で通気攪拌培養した。培養開始後約１５時間で、溶存
酸素濃度が回復して、対数増殖期が終了した。対数増殖
期終了時までに資化された全窒素量は、サンプリング分
析の結果、０．７７ｍｇ／ｍｌであった。対数増殖期終
了後直ちに予め１１０℃、２０分間滅菌した２０重量％
スクロース溶液４８０ｍｌ（資化された窒素源の全窒素
換算重量に対して、全炭素換算量として１０倍弱）を加
え、３３℃で通気攪拌条件下、培養熟成を３日間続け
た。この培養液から遠心分離により集菌し、湿菌体２４
０ｇを得た。ニトリラーゼの発現活性は、培養液１ｍｌ
当たり１．９１Ｕであった。また、湿菌体１ｇ当たりの
活性は４７．８Ｕであった。
【００２０】比較例１ 実施例１と同組成の増殖用液体培地を同様に滅菌し、１
０リットル容のジャーファメンター中に５．５リットル
用意した。この培地に実施例１と同様の前培養で得た培
養液を接種して、３３℃で通気攪拌培養した。培養開始
後約１５時間で、溶存酸素濃度が回復して、対数増殖期
が終了した。引き続き、３３℃で通気攪拌培養を３日間
続けた。この培養液から遠心分離により集菌し、湿菌体
２４０ｇを得た。ニトリラーゼの発現活性は、培養液１
ｍｌ当たり０．２２Ｕであった。また、湿菌体１ｇ当た
りの活性は５．５Ｕであり、実施例１のものに比べて約
１／９であった。
０リットル容のジャーファメンター中に５．５リットル
用意した。この培地に実施例１と同様の前培養で得た培
養液を接種して、３３℃で通気攪拌培養した。培養開始
後約１５時間で、溶存酸素濃度が回復して、対数増殖期
が終了した。引き続き、３３℃で通気攪拌培養を３日間
続けた。この培養液から遠心分離により集菌し、湿菌体
２４０ｇを得た。ニトリラーゼの発現活性は、培養液１
ｍｌ当たり０．２２Ｕであった。また、湿菌体１ｇ当た
りの活性は５．５Ｕであり、実施例１のものに比べて約
１／９であった。
【００２１】実施例２ コーンスチープリカー２０重量％を含み、１０Ｎ水酸化
ナトリウムでｐＨ７．０に調整した水溶液を調製し、生
じた不溶物を遠心分離により除いた上清液をコーンスチ
ープリカー抽出液とした。２０．５重量％コーンスチー
プリカー抽出液、０．５重量％グルコース、１重量％ε
−カプロラクタムからなる液体培地２．９リットルを１
０リットル容ジャーファメンター中に用意した。滅菌
は、コーンスチープリカー抽出液はろ過滅菌、その他培
地成分は１２０℃、２０分間の加熱滅菌によった。この
増殖用培地に実施例１と同様に前培養で得た培養液を接
種して、３３℃で通気攪拌培養した。培養開始後６時間
から１２時間の間に、上記と同様の滅菌法で調製した９
５．５重量％コーンスチープリカー抽出液、２．２重量
％グルコースからなる液体培地２．５リットルを流加し
た。流加終了後約１時間で、溶存酸素濃度が回復して対
数増殖期が終了した。
ナトリウムでｐＨ７．０に調整した水溶液を調製し、生
じた不溶物を遠心分離により除いた上清液をコーンスチ
ープリカー抽出液とした。２０．５重量％コーンスチー
プリカー抽出液、０．５重量％グルコース、１重量％ε
−カプロラクタムからなる液体培地２．９リットルを１
０リットル容ジャーファメンター中に用意した。滅菌
は、コーンスチープリカー抽出液はろ過滅菌、その他培
地成分は１２０℃、２０分間の加熱滅菌によった。この
増殖用培地に実施例１と同様に前培養で得た培養液を接
種して、３３℃で通気攪拌培養した。培養開始後６時間
から１２時間の間に、上記と同様の滅菌法で調製した９
５．５重量％コーンスチープリカー抽出液、２．２重量
％グルコースからなる液体培地２．５リットルを流加し
た。流加終了後約１時間で、溶存酸素濃度が回復して対
数増殖期が終了した。
【００２２】対数増殖期終了時までに資化された全窒素
量は、サンプリング分析の結果、１．９３ｍｇ／ｍｌで
あった。対数増殖期終了後直ちに、予め１１０℃、２０
分間滅菌した５０重量％グルコース溶液５６０ｍｌ（資
化された窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算
量として１０倍強）を約１０時間かけて流加した。グル
コースの流加終了後、３３℃の通気攪拌条件下、熟成培
養を更に３日間続けた。この培養液から遠心分離により
集菌し、湿菌体６００ｇを得た。ニトリラーゼの発現活
性は、培養液１ｍｌ当たり５．０２Ｕであった。また、
湿菌体１ｇ当たりの活性は５０．６Ｕであった。
量は、サンプリング分析の結果、１．９３ｍｇ／ｍｌで
あった。対数増殖期終了後直ちに、予め１１０℃、２０
分間滅菌した５０重量％グルコース溶液５６０ｍｌ（資
化された窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算
量として１０倍強）を約１０時間かけて流加した。グル
コースの流加終了後、３３℃の通気攪拌条件下、熟成培
養を更に３日間続けた。この培養液から遠心分離により
集菌し、湿菌体６００ｇを得た。ニトリラーゼの発現活
性は、培養液１ｍｌ当たり５．０２Ｕであった。また、
湿菌体１ｇ当たりの活性は５０．６Ｕであった。
【００２３】比較例２ 実施例２と同組成からなる液体培地を同様に滅菌し、１
０リットル容のジャーファメンター中に同量用意した。
この培地に実施例１と同様の前培養で得た培養液を接種
して、３３℃で通気攪拌培養した。実施例２と同様、培
養開始後６時間から１２時間の間に、９５．５重量％コ
ーンスチープリカー抽出液、２．２重量％グルコースか
らなる液体培地２．５リットルを流加した。流加終了後
約１時間で、溶存酸素濃度が回復して対数増殖期が終了
した。対数増殖期終了時までに資化された全窒素量は、
サンプリング分析の結果、１．９３ｍｇ／ｍｌであっ
た。引き続き、３３℃で通気攪拌培養を３日間続けた。
この培養液から遠心分離により集菌し、湿菌体６００ｇ
を得た。ニトリラーゼの発現活性は、培養液１ｍｌ当た
り０．５８Ｕであった。また、湿菌体１ｇ当たりの活性
は５．８Ｕであり、実施例２のものに比べて約１／９で
あった。であった。
０リットル容のジャーファメンター中に同量用意した。
この培地に実施例１と同様の前培養で得た培養液を接種
して、３３℃で通気攪拌培養した。実施例２と同様、培
養開始後６時間から１２時間の間に、９５．５重量％コ
ーンスチープリカー抽出液、２．２重量％グルコースか
らなる液体培地２．５リットルを流加した。流加終了後
約１時間で、溶存酸素濃度が回復して対数増殖期が終了
した。対数増殖期終了時までに資化された全窒素量は、
サンプリング分析の結果、１．９３ｍｇ／ｍｌであっ
た。引き続き、３３℃で通気攪拌培養を３日間続けた。
この培養液から遠心分離により集菌し、湿菌体６００ｇ
を得た。ニトリラーゼの発現活性は、培養液１ｍｌ当た
り０．５８Ｕであった。また、湿菌体１ｇ当たりの活性
は５．８Ｕであり、実施例２のものに比べて約１／９で
あった。であった。
【００２４】
【発明の効果】本発明により得られる菌体は、菌体当た
りのニトリラーゼ活性が高いため、種々のニトリルから
対応する有機酸を製造する際、菌体触媒量が少なくて済
み、製造コスト上有利である。
りのニトリラーゼ活性が高いため、種々のニトリルから
対応する有機酸を製造する際、菌体触媒量が少なくて済
み、製造コスト上有利である。
Claims (5)
- 【請求項１】 ニトリラーゼ産生能を有する微生物を培
地に培養し、その対数増殖期が終了した後、炭素源を添
加してさらに熟成培養することを特徴とするニトリラー
ゼ高生産性微生物菌体の製造法。 - 【請求項２】 炭素源の添加量が、対数増殖期までに資
化された窒素源の全窒素換算重量に対して、全炭素換算
量として５〜２０倍の量であることを特徴とする請求項
１記載のニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法。 - 【請求項３】 炭素源が、糖類であることを特徴とする
請求項１又は２記載のニトリラーゼ高生産性微生物菌体
の製造法。 - 【請求項４】 微生物が、アースロバクター（Arthroba
cter）属に属する微生物であることを特徴とする請求項
１〜３のいずれか記載のニトリラーゼ高生産性微生物菌
体の製造法。 - 【請求項５】 アースロバクター（Arthrobacter）属に
属する微生物が、アースロバクター（Arthrobacter） s
p. NSSC104株であることを特徴とする請求項４記載のニ
トリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15175898A JPH11341979A (ja) | 1998-06-01 | 1998-06-01 | ニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15175898A JPH11341979A (ja) | 1998-06-01 | 1998-06-01 | ニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11341979A true JPH11341979A (ja) | 1999-12-14 |
Family
ID=15525661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15175898A Withdrawn JPH11341979A (ja) | 1998-06-01 | 1998-06-01 | ニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11341979A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003014355A1 (fr) * | 2001-08-03 | 2003-02-20 | Nippon Soda Co., Ltd. | Gene de nitrilase |
| JP2008022706A (ja) * | 2006-07-18 | 2008-02-07 | Gifu Univ | ニトリラーゼおよびニトリラーゼを用いるカルボン酸の製造方法 |
-
1998
- 1998-06-01 JP JP15175898A patent/JPH11341979A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003014355A1 (fr) * | 2001-08-03 | 2003-02-20 | Nippon Soda Co., Ltd. | Gene de nitrilase |
| JP2008022706A (ja) * | 2006-07-18 | 2008-02-07 | Gifu Univ | ニトリラーゼおよびニトリラーゼを用いるカルボン酸の製造方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4637982A (en) | Process for biological preparation of amides | |
| FI87579C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av amider anvaendande mikroorganismer | |
| US5179014A (en) | Process for the preparation of amides using microorganisms | |
| Tsugawa et al. | Production of l-Glutamic Acid from dl-Hydantoin-5-propionic Acid by Microoganisms: Part I. Screening of l-Glutamic Acid-Producing Microorganisms and Some Optimal Conditions for Production of l-Glutamic Acid | |
| JPS6143996B2 (ja) | ||
| US5200331A (en) | Method of producing an amide utilizing a microorganism | |
| JPH0338836B2 (ja) | ||
| JP2950896B2 (ja) | Ｄ―α―フェニルグリシンの製造法 | |
| HU215093B (hu) | Eljárás amidszármazékok előállítására | |
| JP2696424B2 (ja) | Ｒ（‐）―マンデル酸の製造法 | |
| EP0332379B1 (en) | Production process of L-alpha-amino acids | |
| JPH03280889A (ja) | グリシンの生物学的製造法 | |
| JPH04365491A (ja) | ４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法 | |
| JPH11341979A (ja) | ニトリラーゼ高生産性微生物菌体の製造法 | |
| JP2670838B2 (ja) | Ｌ―α―アミノ酸類の製造方法 | |
| JPH0440899A (ja) | α―ヒドロキシ―４―メチルチオブチルアミドの生物学的製造法 | |
| JPS58201992A (ja) | 微生物によるβ−置換プロピオン酸またはそのアミドの製造法 | |
| JPH04218385A (ja) | Ｒ（−）−マンデル酸の製造法 | |
| US5258305A (en) | Manufacture of optically active 2-phenylpropionic acid and 2-phenylpropionamide from the nitrile using Rhodococcus equi | |
| JPH0479894A (ja) | Ｄ―アラニンの製造方法 | |
| JP3090761B2 (ja) | 光学活性乳酸の製造法 | |
| JPS592693A (ja) | アミドの生物学的製造法 | |
| JP3976355B2 (ja) | α−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の製造方法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| JP3011472B2 (ja) | 酵素法によるインジゴの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041217 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Effective date: 20060327 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 |