JP2007074939A - Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子およびｄ−乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
光学純度の高いＤ−乳酸を中和操作が不要な低コスト発酵により効率よく生産可能なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼが存在しなかった。
【解決手段】
Ｄ−乳酸高生産菌であるバシラス・ラエボラクティカスのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いることで、光学純度の高いＤ−乳酸を中和操作が不要な低コスト発酵により効率よく生産可能となる。
【選択図】なし。
光学純度の高いＤ−乳酸を中和操作が不要な低コスト発酵により効率よく生産可能なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼが存在しなかった。
【解決手段】
Ｄ−乳酸高生産菌であるバシラス・ラエボラクティカスのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いることで、光学純度の高いＤ−乳酸を中和操作が不要な低コスト発酵により効率よく生産可能となる。
【選択図】なし。
Description
この発明は、Ｄ−乳酸の効率的生産技術に関する。詳しくは、酵母にＤ−乳酸を産生させるのに適する、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ、該ＤＮＡ構築物を用いた形質転換体、および該形質転換体を利用したＤ−乳酸の製造方法に関する。
生分解性ポリマーであるポリ乳酸は、ＣＯ２問題・エネルギー問題の顕在化とともにサスティナビリティー（持続可能性）、ＬＣＡ（ライフサイクルアセスメント）対応型製品として強い注目を浴びており、その原料である乳酸には効率的で安価な製造法が求められている。
ちなみに現在生産されているポリ乳酸はＬ−乳酸ポリマーであるが、乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸の２種類の光学異性体があり、Ｄ−乳酸についてもポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。但しいずれの用途においても、原料たるＬ−乳酸、Ｄ−乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。
自然界には乳酸菌などの乳酸を効率良く生産する細菌が存在し、それらを用いた乳酸製造法の中には既に実用化されているものもある。例えば、Ｌ−乳酸を効率良く生産させる細菌としてラクトバシラス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉなどがあり、Ｄ−乳酸を効率良く生産させる細菌としてバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）の微生物などが知られている（特許文献１）。いずれの場合も嫌気培養で乳酸の蓄積量は高いレベルに達しているが、光学純度が１００％とはならずに、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸を分離することが非常に困難である。
そのような乳酸の光学純度低下を回避するには、乳酸を本来生産しない微生物によってＤ−乳酸を生産することが効果的である。そのような微生物にＤ−乳酸を生産させるためには、他の微生物からのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子を導入し、発現させる必要がある。また本来Ｄ−乳酸を生産しないわけなので、なにかしら別の化合物を生産する微生物である。その別の化合物の生産を抑制しつつ、Ｄ−乳酸を生産させるためには特定の遺伝子破壊技術等が必要である。ただ現状的には、遺伝子破壊法がどのような微生物にでも容易に適応できる訳ではなく、乳酸菌など元来乳酸を高生産できる微生物での適応は困難である。なぜなら乳酸菌はゲノム情報が必ずしも十分とは言えず、遺伝子組換えの宿主としても汎用されていないからである。
それに対しゲノム情報が豊富で、遺伝子組換え宿主としての実績が十分にある微生物として酵母や大腸菌が挙げられる。
大腸菌を組換え宿主としてＤ−乳酸を生産させた試みがある（特許文献２）。副産物の低減が計られて、高光学純度のＤ−乳酸を生産できるが、乳酸菌の場合と同じく発酵中はアルカリ物質によりｐＨを制御する必要がある。培養液を中和するとＤ−乳酸は乳酸塩として存在することになり、ポリマーの原料とするには精製のために解塩操作をおこなう必要がある。
それに対して、酵母は酸性条件でも発酵することができる微生物であり中和することなくＤ−乳酸を生産することができる。
これまで、酵母によってＬ−乳酸を生産させようとする試みはいくつか存在している。その中でも最もＬ−乳酸生産に成功している方法は、ウシ由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に導入した方法である（非特許文献１）。
また、既知のラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｍｕ）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することで酵母によってＤ−乳酸を生産させようとする試みも存在している（特許文献３）。しかしながら、炭酸カルシウムで中和を行っているにもかかわらず、酵母によるＬ−乳酸ほどＤ−乳酸の高生産は認められていない。また、Ｄ−乳酸の光学純度については言及されていない。
酵母によるＤ−乳酸の生産性がＬ−乳酸の生産性とくらべ劣る原因は、Ｄ−乳酸発酵により適しているＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素が見つかっていないためであると考えられる。
酵母は本来エタノールを生産する微生物であるため、ピルビン酸からエタノールへの代謝能力が優れている。しかし酵母に乳酸を生産させるためには、そのピルビン酸を乳酸に変換する代謝能力が高い必要がある。その代謝能力を司る酵素が乳酸デヒドロゲナーゼ酵素である。つまりＤ−乳酸発酵により適したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素が重要となる。Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素は広く研究対象として取り扱われているためピルビン酸との親和性の高いものが数多く知られており、またその遺伝子も数多く知られている（非特許文献２）。
一方、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素はあまり研究対象として取り扱われていないため、知られている遺伝子の数が少ない。
そこで、Ｄ−乳酸発酵により適したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の遺伝子をクローニングすることができ、その遺伝子を酵母に導入すれば、光学純度の高いＤ−乳酸を中和操作が不要な低コスト発酵により生産可能となるものと期待されるが、これまでそれを実現する技術は存在しなかった。
特開２００３−０８８３９２
特開２００５−１０２６２５
特開２００２−１３６２９３
イシダら、アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー、アメリカ合衆国、（２００４）、７１、１９６４−１９７０〔Nobuhiro, I., Appl Environ Microbiol, United States (2004) 71 1964-1970〕
エレンら、マイクロバイオロジカル レビュー、アメリカ合衆国、（１９８０）、４４、１０６−１３９〔Ellen, I. Garvie, Microbiol. Rev., United States (1980) 44 106-139〕
本発明の目的は、Ｄ−乳酸発酵により適したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の遺伝子をクローニングし、乳酸を生産しない微生物に導入、発現させることで、高光学純度のＤ−乳酸を効率的に生産する方法を提供することにある。
本発明者らは、各種のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子について微生物での発現に対して試みた結果、Ｄ−乳酸の産生量を増大させるのに適したＤＮＡ配列を見出した。そして、かかるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ構築物を利用することにより、上記した課題を解決するに至った。すなわち、本発明は、以下の態様からなる。
（１）下記（Ａ）または（Ｂ）の何れかのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
（２）下記（ａ）から（ｅ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（３）（２）に記載のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントと、このＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントとを備えるＤＮＡ構築物。
（４）プロモーターセグメントが、サッカロマイセス・セレビシエ由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターまたはピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターである、請求項３記載のＤＮＡ構築物。
（５）さらに、プラスミド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンおよび人工染色体からなる群から選択されるいずれかのベクターの構成セグメントを備える、（３）または（４）に記載のＤＮＡ構築物。
（６）（３）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を用いて宿主細胞を形質転換させて得られる形質転換体。
（７）宿主細胞が細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞のいずれかである、（６）記載の形質転換体。
（８）前記宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、（６）記載の形質転換体。
（９）宿主染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に連結された、（２）に記載のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを備える、形質転換サッカロマイセス属酵母。
（１０）請求項（６）〜（９）のいずれかに記載の形質転換体に由来する細胞を培養する工程と、該工程から得られる培養物からＤ−乳酸を分離する工程、とを備える、Ｄ−乳酸の製造方法。
（１１）形質転換体に由来する細胞を培養する工程が中和せずに培養する工程である、（１０）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（１２）培養物からＤ−乳酸を分離する工程が蒸留することで分離する工程を含む、（１０）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（１）下記（Ａ）または（Ｂ）の何れかのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
（２）下記（ａ）から（ｅ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（３）（２）に記載のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントと、このＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントとを備えるＤＮＡ構築物。
（４）プロモーターセグメントが、サッカロマイセス・セレビシエ由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターまたはピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターである、請求項３記載のＤＮＡ構築物。
（５）さらに、プラスミド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンおよび人工染色体からなる群から選択されるいずれかのベクターの構成セグメントを備える、（３）または（４）に記載のＤＮＡ構築物。
（６）（３）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を用いて宿主細胞を形質転換させて得られる形質転換体。
（７）宿主細胞が細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞のいずれかである、（６）記載の形質転換体。
（８）前記宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、（６）記載の形質転換体。
（９）宿主染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に連結された、（２）に記載のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを備える、形質転換サッカロマイセス属酵母。
（１０）請求項（６）〜（９）のいずれかに記載の形質転換体に由来する細胞を培養する工程と、該工程から得られる培養物からＤ−乳酸を分離する工程、とを備える、Ｄ−乳酸の製造方法。
（１１）形質転換体に由来する細胞を培養する工程が中和せずに培養する工程である、（１０）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（１２）培養物からＤ−乳酸を分離する工程が蒸留することで分離する工程を含む、（１０）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
本発明によれば、微生物、特に酵母におけるＤ−乳酸発酵に適したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を備えるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡが提供される。このＤＮＡを利用することにより、Ｄ−乳酸を高生産可能な形質転換体を容易に得ることができ、ひいては、Ｄ−乳酸を効率よく生産することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（ポリペプチド、ＤＮＡ）
本発明におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいう）活性を備えるポリペプチドとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物由来であり、より好ましくは、有胞子乳酸菌由来であり、さらに好ましくは、バシラス・ラエボラクティカス由来である。例えば、バシラス・ラエボラクティカス由来のＤ−ＬＤＨとして配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。さらに、本発明におけるポリペプチドは、これらポリペプチドのホモログも包含している。これらのホモログは、天然由来のＤ−ＬＤＨのアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列でありかつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチド、および、天然由来のＤ−ＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチドを含んでいる。
本発明におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいう）活性を備えるポリペプチドとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物由来であり、より好ましくは、有胞子乳酸菌由来であり、さらに好ましくは、バシラス・ラエボラクティカス由来である。例えば、バシラス・ラエボラクティカス由来のＤ−ＬＤＨとして配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。さらに、本発明におけるポリペプチドは、これらポリペプチドのホモログも包含している。これらのホモログは、天然由来のＤ−ＬＤＨのアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列でありかつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチド、および、天然由来のＤ−ＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＤ−ＬＤＨ活性を有しているポリペプチドを含んでいる。
本発明のＤＮＡは、Ｄ−ＬＤＨ活性を備えるポリペプチドをコードする塩基配列を有する、あるいは当該塩基配列からなるＤＮＡである。
また、本明細書において、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなど、その由来を問うものではない。また、１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよい。また、天然のあるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
本発明のＤＮＡは、配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡのホモログも包含している。ホモログとしては、例えば、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを挙げることができる。すなわち、これらのいずれかのＤＮＡの全体若しくは一部あるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡである。かかるホモログは、同時にＤ−ＬＤＨ活性を備えるポリペプチドをコードしている。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとして、当業者の周知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4）などを用いて、ハイブリダイズするＤＮＡである。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であり、より厳しい条件としては、約４２℃である。さらに厳しい条件としてはホルムアミド存在下で約６５℃とすることができる。
また、バシラス・ラエボラクティカス由来のＤ−ＬＤＨのアミノ酸配列、例えば、配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするとともに、前記バシラス・ラエボラクティカス由来のＤ−ＬＤＨをコードする塩基配列、例えば、配列番号２の全部若しくは一部からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする、ＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。また、配列番号２のコード領域に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｄ−ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするとともに、配列番号２のコード領域において、前記アミノ酸の置換などに対応する塩基の改変がなされた塩基配列を有するＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのポリペプチドの機能が維持できる限り制限されないが、全アミノ酸の７０％以内であることが好ましく、より好ましくは、３０％以内であり、さらに好ましくは２０％以内である。
また、このようなＤＮＡのホモログは、もとのＤＮＡの塩基配列のコード領域に対して、少なくとも８０％、好ましくは、９０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含む、あるいは当該塩基配列からなるＤＮＡであることが好ましい。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。
本発明のＤＮＡは、化学的に合成することもできるし、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用して合成することもできる。
また、アミノ酸配列における改変は、改変しようとするアミノ酸配列に、部位特異的変位導入法（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより行うことができる。また、このような改変は、人工的に変異を導入しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミノ酸の変異によっても生じたものも包含される。
（ＤＮＡ構築物）
本発明のＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して、このＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現させることにより、そのＤ−ＬＤＨ活性により宿主細胞においてＤ−乳酸を産生させることができる。形質転換にあたっては、本発明のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを、宿主細胞内で発現可能とするＤＮＡ構築物を用いる。形質転換のためのＤＮＡ構築物の好ましい態様としては、プラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の種類に応じて選択して採用することができる。したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のＤＮＡの他、これらのいずれかの態様のベクターの構成セグメントを備えることができる。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。
本発明のＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換して、このＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現させることにより、そのＤ−ＬＤＨ活性により宿主細胞においてＤ−乳酸を産生させることができる。形質転換にあたっては、本発明のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを、宿主細胞内で発現可能とするＤＮＡ構築物を用いる。形質転換のためのＤＮＡ構築物の好ましい態様としては、プラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の種類に応じて選択して採用することができる。したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のＤＮＡの他、これらのいずれかの態様のベクターの構成セグメントを備えることができる。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。
なお、プラスミドＤＮＡとしては、例えば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２またはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などを挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２などを挙げることができる。
本発明のＤＮＡ構築物を作製するには、本発明のＤＮＡを含むフラグメントなどを適当な制限酵素で切断し、使用するベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチクローニングサイトに挿入などすることによる。本発明のＤＮＡ構築物の第１の態様は、本発明のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントを備えている。すなわち、プロモーターにより制御可能にそのプロモーターの下流側に本発明のＤＮＡセグメントが連結されている。
本発明のＤＮＡ、すなわち、Ｄ−ＬＤＨ活性を備えるポリペプチドの発現にあっては、酵母における発現が好ましいことから、酵母中で発現するプロモーターを使用することが好ましい。かかるプロモーターとしては、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどを使用することが好ましい。特に、サッカロマイセス属由来のピルビン酸脱炭酸酵素（１）プロモーターまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを利用することがより好ましい。これらのプロモーターは、サッカロマイセス属（セレビシエ）のエタノール発酵経路において高発現されているからである。なお、かかるプロモーター配列は、サッカロマイセス属酵母のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子またはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅法によって単離することができる。
また、本発明のＤＮＡ構築物の他の態様である第２のＤＮＡ構築物は、本発明のＤＮＡの他、宿主染色体の相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備える。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、宿主染色体において本発明のＤＮＡを導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えられている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメントを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメントの間に本発明のＤＮＡを連結することが好ましい。
相同組換えにより宿主染色体に本発明のＤＮＡを導入する場合、宿主染色体上のプロモーターにより制御可能に本発明のＤＮＡを導入することができる。この場合、目的遺伝子の導入によって、同時に、本来当該プロモーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、この内在性遺伝子に替えて外来の本発明のＤＮＡを発現させることができる。特に、当該プロモーターが、宿主細胞において高発現プロモーターである場合に有用である。
かかる発現系を宿主染色体上に創出するには、宿主染色体において高発現遺伝子をターゲットとし、この遺伝子を制御するプロモーターの下流にプロモーターにより制御を受けるように本発明のＤＮＡを導入するようにすることが好ましい。酵母などのエタノール発酵性微生物を宿主とする場合、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、特にピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子をターゲットとし、内在性のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下にＤ−ＬＤＨ活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入することができる。この場合、相同組換え用ＤＮＡセグメントは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のＤ−ＬＤＨの構造遺伝子領域あるいはその近傍の配列（開始コドンの近傍の配列、開始コドンの上流域の配列、構造遺伝子内の配列などを含む）と相同とすることができる。好ましくは、サッカロマイセス属、特にセレビシエを宿主として、この宿主のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子をターゲットとするＤＮＡ構築物とする。かかるＤＮＡ構築物によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の破壊とこの構造遺伝子部分のＤ−ＬＤＨによる置換を同時に達成することができる。ピルビン酸脱炭酸酵素１は、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの付加逆反応を媒介する酵素であり、この遺伝子を破壊することにより、アセトアルデヒドを経たエタノール産生が抑制されることが期待されるとともに、ピルビン酸を基質とするＤ−ＬＤＨによる乳酸産生が促進されることが期待できる。
なお、第１のＤＮＡ構築物あっても、宿主染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備えることにより、相同組換え用のＤＮＡ構築物とすることができる。第１のＤＮＡ構築物にあっては、ＤＮＡ構築物中のプロモーターセグメントを、宿主染色体との相同組換え用のＤＮＡセグメントに兼用することもできる。例えば、宿主サッカロマイセス・セレビシエに対して、サッカロマイセス・セレビシエ宿主染色体にあるプロモーター、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターをプロモーターセグメントとして有するＤＮＡ構築物は、当該遺伝子をターゲット部位とするターゲティングベクターを構成する。この場合、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の構造遺伝子領域に対する相同配列を備えることが好ましい。
なお、ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができる。
（ＤＮＡ構築物による形質転換）
一旦、ＤＮＡ構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。ＤＮＡ構築物の導入後、その受容細胞は、選択培地で培養される。
一旦、ＤＮＡ構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。ＤＮＡ構築物の導入後、その受容細胞は、選択培地で培養される。
宿主細胞は、エッシェリシア・コリ、バシラス・サチルスなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｈｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞などとすることができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行う微生物あるいは耐酸性微生物であり、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株である。
ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体においては、ＤＮＡ構築物の構成成分が染色体上あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在することになる。なお、ＤＮＡ構築物が染色体外に維持されている場合、あるいは、ランダムインテグレーションにより染色体に組み込まれている場合には、Ｄ−ＬＤＨの基質であるピルビン酸を基質とする他の酵素、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（サッカロマイセス属酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）は、ターゲティングベクターによりノックアウトされていることが好ましい。上述のＤＮＡ構築物であって、相同組換えを達成できるＤＮＡ構築物が導入されると、宿主染色体上の所望のプロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に連結された本発明のＤＮＡであるＤＮＡセグメントが存在することになる。サッカロマイセス属酵母の形質転換体にあっては、宿主染色体上において、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に本発明のＤＮＡを備えることが好ましい。また、通常、相同組換え体における本発明のＤＮＡの下流側には、選択マーカー遺伝子や、破壊された構造遺伝子の一部（ＤＮＡ構築物上の相同配列に対応する部位）が存在する。
なお、所望のプロモーター下に本発明のＤＮＡが導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
（Ｄ−乳酸の製造）
ＤＮＡ構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、培養物中に外来遺伝子の発現産物であるＤ−乳酸が生成する。培養物からＤ−乳酸を分離する工程を実施することにより、Ｄ−乳酸を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。本発明の形質転換体の培養にあたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
ＤＮＡ構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、培養物中に外来遺伝子の発現産物であるＤ−乳酸が生成する。培養物からＤ−乳酸を分離する工程を実施することにより、Ｄ−乳酸を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。本発明の形質転換体の培養にあたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する倍地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０倍地、ＤＭＥＭ倍地またはこれらの培地にウシ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
培養は、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下、３０℃で６〜４８時間行う。Ｄ−乳酸が培地中に蓄積するにしたがって培養液のｐＨが低下する。しかし、ｐＨを中和し、制御しないほうが好ましい。中和することでＤ−乳酸が培養液中でＤ−乳酸塩として存在することとなり、精製工程においてより低コストな蒸留方法が利用できなくなるためである。本発明の形質転換体に由来する細胞を培養することを含む本発明の製造方法によれば、中和することなく、酸性条件においても高効率でＤ−乳酸を生産することが出来る。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
上記のようにして得られたＤ−乳酸培養液からＤ−乳酸を分離するには、従来より知られている方法によって、分離することができる。例えば、得られたＤ−乳酸培養液からフィルターにて菌体を分離した後、ｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などがある。好ましくは、得られたＤ−乳酸培養液からフィルターにて菌体を分離した後、水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかける。ここで、蒸留する際には蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留するのが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい。なお、蒸留操作後、留出液について必要に応じてイオン交換樹脂、活性炭、クロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
（実施例１）バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡの調製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３をＧＹＰ培地（特開２００３−０８８３９２号公報）１００ｍｌに接種し、温度３０℃で２４時間培養し、培養物を得た。この培養物を３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem．Biophys．Acta.，72，619（1963））により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4及び１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））におのおの混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカスＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３をＧＹＰ培地（特開２００３−０８８３９２号公報）１００ｍｌに接種し、温度３０℃で２４時間培養し、培養物を得た。この培養物を３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem．Biophys．Acta.，72，619（1963））により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4及び１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））におのおの混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカスＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。
（実施例２）プラスミドベクターＤＮＡを利用したバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で自律複製可能なプラスミドベクタ−ＤＮＡ（ｐＵＣ１９）２０μｇ及び制限酵素ＢａｍＨＩ２００ユニットを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で自律複製可能なプラスミドベクタ−ＤＮＡ（ｐＵＣ１９）２０μｇ及び制限酵素ＢａｍＨＩ２００ユニットを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。
この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するためバクテリアルアルカリホスファターゼ処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
このＢａｍＨＩで消化されたｐＵＣ１９を１μｇ、実施例１で得られたＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片を１μｇ、及び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ ＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を形質転換し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地上にまき、約２０，０００個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。約２０，０００個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。
（実施例３）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主の作製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株のＤ−ＬＤＨ遺伝子のスクリーニングを機能相補によって行った。その原理の詳細は（DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272）に記載されている。
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株のＤ−ＬＤＨ遺伝子のスクリーニングを機能相補によって行った。その原理の詳細は（DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272）に記載されている。
つまりエッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性を欠失した株を作製する必要がある。
キリルらの方法（Kirill, A., PNAS, United States (2000) 97 6640-6645）によってエッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）およびピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子（ｐｆｌＢおよびｐｆｌＤ）を破壊欠失した株を作製した。この作製した株をエシェリヒア・コリ ＴＭ３３株（Ｅ．ｃｏｌｉ ΔｌｄｈＡ ΔｐｆｌＢ：：Ｋｍ ｒ ΔｐｆｌＤ：：Ｃｍ ｒ ）と命名し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主とした。
（実施例４）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング
エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩および１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、温度３７℃で２４時間培養し、培養物を得た。この培養物を３，０００r.p.m.で１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．８ｇを得た。この湿潤菌体を１０％グリセロール溶液１０ｍｌで３度洗浄した後、１０％グリセロール溶液０．１ｍｌにけん濁しコンピテントセルとした。このコンピテントセルに実施例２で得たバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株の遺伝子ライブラリーを１μｌ加え、電気穿孔法の常法に従い導入した株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＭ９ＧＰ寒天培地（Ｍ９培地＋０．４％グルコース＋０．２％ペプトン）上にまき、嫌気条件下で生育可能であった株を数株得た。
エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩および１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、温度３７℃で２４時間培養し、培養物を得た。この培養物を３，０００r.p.m.で１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．８ｇを得た。この湿潤菌体を１０％グリセロール溶液１０ｍｌで３度洗浄した後、１０％グリセロール溶液０．１ｍｌにけん濁しコンピテントセルとした。このコンピテントセルに実施例２で得たバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株の遺伝子ライブラリーを１μｌ加え、電気穿孔法の常法に従い導入した株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＭ９ＧＰ寒天培地（Ｍ９培地＋０．４％グルコース＋０．２％ペプトン）上にまき、嫌気条件下で生育可能であった株を数株得た。
（実施例５）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するエシェリヒア・コリ ＴＭ３３／ｐＢＬ２から常法に従いプラスミドを調製し、得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。得られたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は２，９９５塩基対あった。この配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株式会社製）を用いてオープン・リーディング・フレーム検索を行い、本発明のＤＮＡ配列（配列番号２）およびコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）に仮決定した。
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するエシェリヒア・コリ ＴＭ３３／ｐＢＬ２から常法に従いプラスミドを調製し、得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。得られたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は２，９９５塩基対あった。この配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株式会社製）を用いてオープン・リーディング・フレーム検索を行い、本発明のＤＮＡ配列（配列番号２）およびコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）に仮決定した。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベースはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列番号２に示される遺伝子及びそれにコードされるポリペプチド（配列番号１）は新規であることが確認された。
既知のタンパク質の中でもっとも高い相同性を示したのは、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの４３％であった。
（実施例６）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの作製）
本発明のバシラス・ラエボラクティカスおよび比較対象としてラクトバシラス・プランタラム、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）からＤ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした。各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。クローニング方法を以下に示す。
本発明のバシラス・ラエボラクティカスおよび比較対象としてラクトバシラス・プランタラム、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）からＤ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした。各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。クローニング方法を以下に示す。
バシラス・ラエボラクティカス、ラクトバシラス・プランタラムおよびペディオコッカス・アシディラクティシを培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。得られたゲノムＤＮＡを続くＰＣＲの鋳型とした。
上記で得られたＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲによりＤ−ＬＤＨ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応には、Ｔａｑの５０倍の正確性を持つとされるKOD-Plus-polymerase（東洋紡）を用いた。反応バッファー、dNTPmixなどは付属のものを使用した。各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子増幅用プライマー（バシラス・ラエボラクティカス：配列番号３、４ ラクトバシラス・プランタラム：配列番号５，６ ペディオコッカス・アシディラクティシ：配列番号７，８）は、５末端側にはＸｈｏＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。エシェリヒア・コリ DH５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｄ−ＬＤＨ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドが得られた。この各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図１）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に導入した。以後、このようにして作製した各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターをｐＴＭ６３（バシラス・ラエボラクティカス由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子（配列番号２））、ｐＴＭ６４（ラクトバシラス・プランタラム由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子、比較例１）、ｐＴＭ６５（ペディオコッカス・アシディラクティシ由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子、比較例２）とそれぞれ示す。
なお、バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターである上記ｐＴＭ６３は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０５４２として寄託されている。（寄託日：平成１７年５月１８日）。
（実施例７）Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターの酵母への導入
実施例６のようにして得られたｐＴＭ６３〜６５を酵母サッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER Yeast Transformation System（CLONTECH）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＭ６３〜６５の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＭ６３〜６５の導入された形質転換体の選択が可能である。
実施例６のようにして得られたｐＴＭ６３〜６５を酵母サッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER Yeast Transformation System（CLONTECH）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＭ６３〜６５の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＭ６３〜６５の導入された形質転換体の選択が可能である。
このようにして得られた形質転換体へのＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（TAKARA社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰｒｅＭｉｘ Ｔａｑ（TAKARA社製）を用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーを使用した。その結果、全ての形質転換体において、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていることを確認した。
（実施例８）無中和培養におけるＤ−乳酸生産性の比較
実施例７のようにして得られたｐＴＭ６３〜ｐＴＭ６５が導入されたサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株（以下、それぞれＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３〜６５株と示す）を用いてＤ−乳酸生産テストを行い、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を比較した。
実施例７のようにして得られたｐＴＭ６３〜ｐＴＭ６５が導入されたサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株（以下、それぞれＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３〜６５株と示す）を用いてＤ−乳酸生産テストを行い、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を比較した。
寒天培地上からＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３〜６５を少量とり、３mLのウラシル非添加の合成培地（２％グルコース、０．６７％ Yeast Nitrogen Base without amino acid(DIFCO)、１．９２ｇ／L dropout mixture without uracil(SIGMA)）に植菌し、３０℃で一晩培養した。この前培養液を新しいウラシル非添加の合成培地（５%グルコース、０．６７％ Yeast Nitrogen Base without amino acid(DIFCO)、１．９２ｇ／Ｌ dropout mixture without uracil(SIGMA)）１０mLに２％植菌し、３０℃で培養を実施した。培養開始から６５時間後の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定した。
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
また、Ｄ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃
また、Ｄ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃
また、Ｄ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
光学純度（%）＝100×（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
その結果を表１に示す。
Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていないＮＢＲＣ１０５０５株では、乳酸を全く生産していないのに対し、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターを導入したＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３〜６５株では、Ｄ−乳酸の生産が確認できた。株による乳酸生産量の差は、導入した各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の違いに起因していると考えられる。
すなわち、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株のＤ−乳酸生産量が最も多いことから、バシラス・ラエボラクティカス由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子がＤ−乳酸発酵により適していることがわかった。
Claims (12)
- 下記（Ａ）または（Ｂ）の何れかのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。 - 下記（ａ）から（ｅ）の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列もしくはその相補配列またはそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。 - 請求項２に記載のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントと、このＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントとを備えるＤＮＡ構築物。
- プロモーターセグメントが、サッカロマイセス・セレビシエ由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターまたはピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターである、請求項３記載のＤＮＡ構築物。
- さらに、プラスミド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンおよび人工染色体からなる群から選択されるいずれかのベクターの構成セグメントを備える、請求項３または４に記載のＤＮＡ構築物。
- 請求項３から５のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を用いて宿主細胞を形質転換させて得られる形質転換体。
- 宿主細胞が細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞のいずれかである、請求項６記載の形質転換体。
- 宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項６記載の形質転換体。
- 宿主染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に連結された、請求項２に記載のＤＮＡからなるＤＮＡセグメントを備える、形質転換サッカロマイセス属酵母。
- 請求項６〜９のいずれかに記載の形質転換体に由来する細胞を培養する工程と、該工程から得られる培養物からＤ−乳酸を分離する工程、とを備える、Ｄ−乳酸の製造方法。
- 形質転換体に由来する細胞を培養する工程が中和せずに培養する工程である、請求項１０に記載のＤ−乳酸の製造方法。
- 培養物からＤ−乳酸を分離する工程が蒸留することで分離する工程を含む、請求項１０に記載のＤ−乳酸の製造方法。
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