KR102200050B1 - 페닐피루브산에 대한 기질선호도가 증진된 d형-젖산 탈수소효소 - Google Patents

페닐피루브산에 대한 기질선호도가 증진된 d형-젖산 탈수소효소 Download PDF

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Abstract

본 발명의 효소는 페디오코쿠스 애시딜락티시(Pediococcus acidilactici) 유래 D형-젖산 탈수소효소의 51번 아미노산 타이로신을 여러 잔기로 치환한 변이효소 및 그 유전자에 관한 것으로, D형-3-페닐젖산에 대한 활성이 야생형에 비해 촉매효율(catalytic efficiency, k cat /K M ) 기준으로 최고 약 138배 증가하였다.
기존 야생형 D형-젖산 탈수소효소와는 달리 피루브산보다 페닐피루브산에 대해 높은 선호도를 보이며, in vitro 조건에서 야생형은 최대 56%의 전환율을 보인 반면, 본 발명을 통해 개발된 페디오코쿠스 애시딜락티시 유래 D형-젖산 탈수소효소 변이주는 페닐피루브산으로부터 D형-3-페닐젖산을 98% 이상 전환율로 생산할 수 있음을 확인하였다.

Description

페닐피루브산에 대한 기질선호도가 증진된 D형-젖산 탈수소효소{D-lactate dehydrogenases with improved substrate preference for phenylpyruvic acid}
본 발명은 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid, PPA)에 대한 기질선호도가 증진된 D형-젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 D형-젖산 탈수소효소 유전자에 변이를 일으킴으로써 높은 수율로 페닐피루브산을 D형-3-페닐젖산(D-3-phenyllactic acid, D-PLA)으로 전환시킬 수 있는 효소에 관한 것이다.
히드록시산(Hydroxy acid)은 다양한 산업 분야에서 고부가가치 화합물, 화장품, 연료첨가제, 의약품의 원료로 사용된다. 이 중 D형-3-페닐젖산(D-3-phenyllactic acid, D-PLA)은 항생물질로서 효과가 있어 식품 및 사료 첨가용 보존제로 사용되며, 심혈관 질환 치료제인 Danshensu, 구충제인 PF1022A, 혈당강하제인 엔글리타존(Englitazone)의 중간체 역할을 한다. 또한 히드록시산계 생분해성 바이오플라스틱의 단량체 원료로서 화학산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
D형-3-페닐젖산은 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid, PPA)으로부터 D형-젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase)를 통한 환원반응으로 생합성될 수 있으나, D형-젖산 탈수소효소의 원 기질은 피루브산(pyruvate)으로 페닐피루브산에 대해서는 상대적으로 낮은 촉매활성 및 기질선호도를 나타낸다. 또한 전세포 생전환(whole cell bioconversion)을 통해 D형-3-페닐젖산을 생산하고자 할 때 세포내 피루브산의 농도가 더 높기 때문에 경쟁적 저해가 발생해 생산성을 감소시킬 수 있다.
따라서, 페닐피루브산에 높은 기질선호도 및 향상된 활성을 보이는 D형-젖산탈수소효소의 개발은 D형-3-페닐젖산을 생산하는 공정의 생산성을 높이는 데에 중요한 의미를 지닌다.
이에 본 발명자들은 D형-3-페닐젖산(D-3-phenyllactic acid, D-PLA)에 대해 향상된 기질선호도 및 활성을 나타내는 D형-젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase)를 유전자 변이를 통해 개발하고 이를 이용하여 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid, PPA)으로부터 D형-3-페닐젖산을 생산하는 생합성 효율을 높일 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 51번째 아미노산이 류신(Leucine), 알라닌(Alanine), 세린(Serine), 메티오닌(Methionine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 이소류신(Isoleucine), 발린(Valine), 글리신(Glycine) 및 트립토판(Tryptophan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 아미노산 서열을 포함하는 D형-젖산 탈수소효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계를 포함하는 D형-젖산 탈수소효소의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음의 단계를 포함하는 D형-3-페닐젖산의 생산방법을 제공하는 것이다:
서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계; 및
상기 미생물이 생산한 효소를 페닐피루브산에 접촉시켜 D형-3-페닐젖산으로 전환시키는 전환 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 51번째 아미노산이 류신, 알라닌, 세린, 메티오닌, 페닐알라닌, 이소류신, 발린, 글리신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 아미노산 서열을 포함하는 D형-젖산 탈수소효소의 페닐피루브산으로부터 D형-3-페닐젖산으로의 전환 용도에 관한 것이다.
본 발명은 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid, PPA)에 대한 기질선호도가 증진된 D형-젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase)에 관한 것으로, 본 발명에 따른 아미노산 서열이 변이된 D형-젖산 탈수소효소는 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid, PPA)에 대한 증진된 기질선호도를 나타낸다. 효소는 그 활성부위의 구조에 따라 결합하는 기질의 선택성 및 반응 활성에 있어 영향을 받는다.
본 발명자들은 D형-젖산 탈수소효소의 활성부위 구조를 분석하고 페닐피루브산의 페닐기에 상호작용 가능한 위치의 잔기를 변이시킴으로서, 페닐피루브산에 대한 기질선호도가 높은 페디오코쿠스 애시딜락티시(Pediococcus acidilactici) 유래 D형-젖산 탈수소효소 변이주를 개발하고, 페닐피루브산의 환원반응에 대한 활성을 측정하여 활성이 증진된 변이체를 획득하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 51번째 아미노산이 류신(Leucine), 알라닌(Alanine), 세린(Serine), 메티오닌(Methionine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 이소류신(Isoleucine), 발린(Valine), 글리신(Glycine) 및 트립토판(Tryptophan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 아미노산 서열을 포함하는 D형-젖산 탈수소효소이다.
상기 서열목록 1의 아미노산 서열은 페디오코쿠스 애시딜락티시(Pediococcus acidilactici)에서 유래한 것일 수 있다.
상기 51번째 아미노산은 류신, 알라닌, 세린, 메티오닌 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 류신, 메티오닌 및 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 예를 들어, 페닐알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 51번째 아미노산이 치환된 D형-젖산 탈수소효소는, 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 D형-젖산 탈수소효소에 대비하여 페닐피루브산 또는 2-케톤산(2-oxo acid)에 대한 기질선호도가 증진된 것일 수 있다.
상기 2-케톤산은 α-케토부티릭산(2-oxobutyrate) 또는 α-케토이소발레르산(3-methyl-2-oxobutyrate)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC(서열번호 3 내), GCA(서열번호 5 내), GTA(서열번호 7 내), CTA(서열번호 9 내), ATC(서열번호 11 내), ATG(서열번호 13 내), TTC(서열번호 15 내), TCC(서열번호 17 내) 및 TGG(서열번호 19 내)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 유전자이다.
상기 151 내지 153번째 핵산 서열은 GGC, GCA, GTA, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, GGC, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 예를 들어, ATC로 치환된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터이다.
상기 151 내지 153번째 핵산 서열은 GGC, GCA, GTA, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, GGC, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 예를 들어, ATC로 치환된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물이다.
상기 151 내지 153번째 핵산 서열은 GGC, GCA, GTA, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, GGC, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 예를 들어, ATC로 치환된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 효모, 젖산균 등 위 유전자들을 발현시킬 수 있는 미생물군들을 포함하고, 예를 들어, 대장균인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계를 포함하는 D형-젖산 탈수소효소의 생산방법이다.
상기 151 내지 153번째 핵산 서열은 GGC, GCA, GTA, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, GGC, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 예를 들어, ATC로 치환된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 D형-3-페닐젖산(D-3-phenyllactic acid, D-PLA)의 생산방법이다:
서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC, GCA, GTA, CTA, ATC, ATG, TTC, TCC 및 TGG로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계; 및
상기 미생물이 생산한 효소를 페닐피루브산에 접촉시켜 D형-3-페닐젖산으로 전환시키는 전환 단계.
상기 151 내지 153번째 핵산 서열은 GGC, GCA, GTA, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, GGC, CTA 및 ATC로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 예를 들어, ATC로 치환된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 효소는 페디오코쿠스 애시딜락티시(Pediococcus acidilactici) 유래 D형-젖산 탈수소효소의 51번 아미노산 타이로신을 여러 잔기로 치환한 변이효소 및 그 유전자에 관한 것으로, D형-3-페닐젖산에 대한 활성이 야생형에 비해 촉매효율(catalytic efficiency, k cat /K M ) 기준으로 최고 약 138배 증가하였다.
기존 야생형 D형-젖산 탈수소효소와는 달리 피루브산보다 페닐피루브산에 대해 높은 선호도를 보이며, in vitro 조건에서 야생형은 최대 56%의 전환율을 보인 반면, 본 발명을 통해 개발된 페디오코쿠스 애시딜락티시 유래 D형-젖산 탈수소효소 변이주는 페닐피루브산으로부터 D형-3-페닐젖산을 98% 이상의 전환율로 생산할 수 있음을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 피루브산(pyruvate), 페닐피루브산(phenylpyruvate), α-케토부티릭산(2-oxobutyrate), α-케토이소발레르산(3-methyl-2-oxobutyrate)에 대한 paLDH 야생형(wild type; WT) 및 Y51 변이주들의 특이적 활성(specific activity)을 보여주는 그래프이다.
도 2는 페닐피루브산에서 D형-페닐젖산(phenyllactic acid)으로의 효소적 전환을 확인한 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography; HPLC) 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: paLDH 유전자의 돌연변이
pET22b(+)-paLDH(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 주형(template)으로 하여 변형된 QuickChangeTM 위치 지향적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법이 사용되었다(Nucleic Acids Research. Vol. 32, No. 14, e115).
페디오코쿠스 애시딜락티시(Pediococcus acidilactici) D형-젖산 탈수소효소(paLDH) 유전자는 C-말단 His-tag을 포함하여 코돈 최적화 후 GenScript(New Jersey, USA)에서 상업적으로 합성하였다. 제한효소(NdeI, XhoI)는 Enzynomics(대전, 대한민국)에서 구입하였다. 이외의 특히 언급되지 않은 모든 시약은 Sigma-Aldrich(St Louis, USA)에서 구매하였다.
paLDH 아미노산, 이를 코딩하는 핵산 서열 및 사용된 프라이머는 하기 표 1에 표시되어 있으며, Cosmogenetech(서울, 대한민국)에서 합성되었다. 돌연변이 유전자의 확인 또한 같은 회사에서 염기서열 결정법을 통해 진행하였다.
서열목록 명칭 서열
1 paLDH 아미노산 MKIIAYGIRDDEKPYLDEWVTKNHIEVKAVPDLLDSSNIDLAKDYDGVVAYQQKPYTADLFDKMHEFGIHAFSLRNVGVDNVPADALKKNDIKISNVPAYSPRAIAELSVTQLLALLRKIPEFEYKMAHGDYRWEPDIGLELNQMTVGVIGTGRIGRAAIDIFKGFGAKVIAYDVFRNPALEKEGMYVDTLEELYQQANVITLHVPALKDNYHMLDEKAFGQMQDGTFILNFARGTLIDTPALLKALDSGKVAGAALDTYENEVGIFDVDHGDQPIDDPVFNDLMSRRNVMITPHAAFYTRPAVKNMVQIALDNNRDLIEKNSSKNEVKFD
2 paLDH를 코딩하는 핵산 서열 ATGAAAATTATCGCCTATGGCATTCGCGATGACGAAAAACCGTACCTGGATGAATGGGTCACCAAAAACCATATTGAAGTGAAAGCAGTTCCGGATCTGCTGGACAGCTCTAATATCGATCTGGCAAAAGATTATGACGGTGTGGTTGCTTATCAGCAAAAACCGTACACCGCGGACCTGTTTGACAAAATGCATGAATTTGGCATCCACGCGTTCAGCCTGCGTAACGTCGGTGTGGATAATGTTCCGGCAGACGCTCTGAAGAAAAACGATATCAAAATCTCAAATGTGCCGGCCTATTCGCCGCGTGCGATTGCCGAACTGTCTGTTACCCAGCTGCTGGCCCTGCTGCGCAAAATCCCGGAATTTGAATATAAAATGGCACACGGCGATTACCGTTGGGAACCGGACATTGGTCTGGAACTGAACCAAATGACCGTTGGCGTCATTGGCACGGGTCGTATCGGTCGCGCGGCCATTGATATCTTTAAAGGCTTCGGTGCAAAAGTTATTGCTTATGACGTCTTTCGCAATCCGGCACTGGAAAAAGAAGGCATGTATGTGGATACCCTGGAAGAACTGTACCAGCAAGCTAACGTGATCACGCTGCATGTTCCGGCGCTGAAAGATAATTACCACATGCTGGACGAAAAAGCTTTCGGCCAGATGCAAGATGGTACCTTTATTCTGAACTTCGCGCGTGGTACCCTGATCGATACGCCGGCACTGCTGAAAGCACTGGACTCCGGCAAAGTTGCGGGTGCAGCTCTGGATACGTATGAAAATGAAGTCGGCATTTTTGATGTGGACCATGGTGATCAGCCGATCGATGACCCGGTTTTCAACGACCTGATGAGCCGTCGCAATGTCATGATTACCCCGCACGCAGCATTTTACACGCGTCCGGCCGTCAAAAACATGGTGCAGATTGCACTGGATAACAATCGTGACCTGATCGAGAAAAACAGCAGCAAAAATGAAGTGAAATTCGATCACCACCATCACCATCACTAA
3 Y51G For GTTGCTggcCAGCAAAAACCGTACACC
4 Y51G Rev TTGCTGgccAGCAACCACACCGTCATA
5 Y51A For GTTGCTgcaCAGCAAAAACCGTACACC
6 Y51A Rev TTGCTGtgcAGCAACCACACCGTCATA
7 Y51V For GTTGCTgtaCAGCAAAAACCGTACACC
8 Y51V Rev TTGCTGtacAGCAACCACACCGTCATA
9 Y51L For GTTGCTctaCAGCAAAAACCGTACACC
10 Y51L Rev TTGCTGtagAGCAACCACACCGTCATA
11 Y51I For GTTGCTatcCAGCAAAAACCGTACACC
12 Y51I Rev TTGCTGgatAGCAACCACACCGTCATA
13 Y51M For GTTGCTatgCAGCAAAAACCGTACACC
14 Y51M Rev TTGCTGcatAGCAACCACACCGTCATA
15 Y51F For GTTGCTttcCAGCAAAAACCGTACACC
16 Y51F Rev TTGCTGgaaAGCAACCACACCGTCATA
17 Y51S For GTTGCTtccCAGCAAAAACCGTACACC
18 Y51S Rev TTGCTGggaAGCAACCACACCGTCATA
19 Y51W For GTTGCTtggCAGCAAAAACCGTACACC
20 Y51W Rev TTGCTGccaAGCAACCACACCGTCATA
* 변이 대상 잔기는 밑줄로 표시되었으며 치환된 잔기는 표 1의 돌연변이를 따름.
* 변이 대상 염기서열은 밑줄로 표시되었으며 표 1의 프라이머를 이용하여 변이주를 제작하였음.
* 변이되는 위치의 코돈은 소문자로 표시되었음. For와 Rev는 각각 정방향(Forward)과 역방향(Reverse) 프라이머를 의미함.
실시예 2: 효소의 발현 및 정제
각각의 야생형 및 변이주 유전자는 단백질 발현을 위해 수용 E. coli BL21 (DE3)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 화학적 방법으로 형질전환(chemical transformation) 후 100 ug/ml 암피실린을 포함하는 LB(lysogeny broth)-아가 플레이트(agar plate)에서 선택(selection)하였다.
선택된 형질전환 BL21 세포는 100 ug/ml 암피실린을 포함하는 3 ml의 액상 LB 배지에 접종 후 16시간 동안 37℃, 200 rpm에서 배양하고 50 ml의 LB-암피실린 배지로 2차 접종하여 OD600이 0.6 수준이 되도록 키운 후 0.8 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 20℃에서 24시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 24시간 후 세포를 수확하여 원심분리(3400 rpm, 4℃)를 통해 세포 집괴(cell pellet)를 얻었다.
세포 집괴에 BugBuster®(Merck Millipore, Billerica, USA) 용액을 5 ml 첨가하여 20분 동안 처리함으로써 세포를 파열하였으며, 이로부터 나온 용해물을 Ni-NTA 아가로오스 수지 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에 로딩하였다. 세척 완충 용액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 40 mM 이미다졸, pH 8.0) 120 ml를 흘려주고, 최종적으로 용출 완충 용액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0) 1 ml를 이용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질의 순도는 12% SDS-PAGE로 확인하였으며 농도는 Bradford 분석법을 이용하여 측정하였다.
실시예 3: 효소의 활성 스크리닝
야생형 및 변이주의 in vitro 활성을 분석하기 위해 30℃에서 340 nm UV 분광광도계(Molecular Devices, USA)를 사용하여 조효소인 NADH의 산화속도를 측정함으로써 피루브산, 페닐피루브산, α-케토부티릭산(2-oxobutyrate), α-케토이소발레르산(3-methyl-2-oxobutyrate)의 기질의 환원을 모니터링하였다.
구체적으로, 0.1 내지 2 ug의 효소, 0.2 mM의 NADH을 첨가한 50 mM의 소듐 아세테이트(pH 5.5)에서 1.25 mM의 피루브산 또는 페닐피루브산을 기질로 하여 특이적 활성(specific activity)을 측정하였다. 페닐피루브산 염(소듐 페닐피루베이트)은 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)에서 구매하였다.
표 2 및 도 1에서 확인할 수 있듯이, 야생형 및 변이주 D형-젖산 탈수소효소의 활성을 스크리닝하기 위해 특이적 활성을 측정한 결과, 피루브산에 대해서는 야생형이 144.5 U mg-1으로 가장 높은 활성을 보인 것에 비해 페닐피루브산, α-케토부티릭산, α-케토이소발레르산에 대해서는 paLDH Y51F 변이주가 523.0, 51.1, 41.5 U mg-1 로 가장 높은 특이적 활성을 보였다.
특이적 활성
(U mg-1)		 피루브산 페닐피루브산 α-케토부티릭산 α-케토이소발레르산
WT 144.5 19.7 6.8 1.6
Y51L 10.6 280.0 32.1 14.0
Y51A 1.8 260.5 2.3 0.0
Y51S 2.4 262.4 3.6 0.0
Y51M 14.9 425.5 36.7 16.4
Y51F 117.1 523.5 51.1 41.5
Y51I 0.7 33.5 2.7 0.0
Y51V 0.1 124.5 1.0 0.0
Y51G 0.3 55.6 0.6 0.0
Y51W 2.1 45.5 0.1 0.0
특히 모든 변이주들이 야생형과 비교해 피루브산보다 페닐피루브산에 대해 더 높은 기질선호도를 보임으로서 피루브산이 경쟁적 억제를 할 수 있는 전세포 반응에서 페닐피루브산을 더 효율적으로 D형-페닐젖산으로 전환할 것으로 기대되었다.
이어서, 효소의 동력학적 분석을 위해 각 기질에 대한 K M 및 k cat 값을 측정하였다. 상기 활성 스크리닝 단계에서 상대적으로 높은 활성을 보인 Y51L, Y51A, Y51S, Y51M, Y51F 변이주들의 K M 과 k cat 의 값을 야생형과 비교하여 구한 결과, 하기 표 3과 같이 paLDH Y51L, Y51M, Y51F 변이주에서 가장 높이 향상된 촉매효율을 보여주었다.
기질 페닐피루브산 α-케토부티릭산 α-케토이소발레르산
파라미터 K m
(mM)		 k cat
(s-1)		 k cat/K m
(s-1 mM-1)		 K m
(mM)		 k cat
(s-1)		 k cat/K m
(s-1 mM-1)		 K m
(mM)		 k cat
(s-1)		 k cat/K m
(s-1 mM-1)
야생형 2.6±0.0 41.3±1.3 15.9±0.5 11±0 50.7±0.4 4.40±0.10 38±12 33.9±8.8 0.892±0.063
Y51L 0.17±0.01 376±26 2200±20 12±2 199±20 16.8±0.7 12±0 90.2±4.4 7.41±0.01
Y51M 0.22±0.00 462±4 2130±20 7.5±1.7 152±10 20.7±3.4 8.6±0.5 76.2±0.2 8.85±0.51
Y51F 0.22±0.07 391±39 1880±90 2.7±0.3 99.4±8.4 37.2±0.8 7.7±0.0 179±6 23.2±0.9
Y51A 0.16±0.02 269±14 1720±90 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
Y51S 0.40±0.11 239±36 612±80 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
*N.D: 값이 너무 낮아 측정이 불가함.
실시예 4: 페닐피루브산에서 D형-페닐젖산으로의 효소적 전환
페닐피루브산으로부터의 페닐젖산 전환은 18.6 nM D형-젖산 탈수소효소, 20 mM 페닐피루브산, 1.5 mM NADH, 30 mM 소듐 포메이트, 1 unit Candida boidinii 포메이트 탈수소효소를 첨가한 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 6.5)에서 12시간 동안 진행되었다. 정해진 시간 간격으로 수득 후 99℃에서 효소를 비활성화하고 원심분리 후 0.2 uM PVDF 필터(GE Healthcare, Pittsburgh, USA)로 필터링하고 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography; HPLC)로 분석하였다.
HPLC 분석은 Bio-Rad Aminex® HPX-87H Ion exclusion column(300 mm x 7.8 mm)가 장착된 YL9100 HPLC 시스템(YL instruments, 안양, 대한민국)에서 진행되었으며 5 mM 황산이 0.6 ml min-1의 속도로 이동상으로 사용되었다. 페닐피루브산과 페닐젖산은 37℃, 210 nm UV detector에서 각각 19.42분과 41.28분에 감지되었다.
또한 Daicel Chiralcel OJ-H column(250 mm x 0.46 mm, 5 um) 및 헥산, 이소프로판올, trifluoroacetic acid가 90:10:0.1(v:v) 비율인 이동상을 이용하여 261 nm UV detector에서 페닐젖산의 광학순수성을 측정하였다. 이 경우 D형-페닐젖산은 29분, L형-페닐젖산은 34분, 페닐피루브산은 38분에서 각각 감지되었다.
표 4 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, HPLC 분석 결과 광학적으로 순수한 D형-페닐젖산이 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 2시간 후 98% 이상의 D형-페닐젖산이 Y51L, Y51M, Y51F 변이주들에 의해 전환되었으나 야생형의 경우 전환율이 최대 56%에 그쳤다. 생산성은 Y51F가 1.61 g-1 L-1 h-1로 가장 높았다. 이를 통해, paLDH Y51F 변이주가 D형-페닐젖산 전환에 대한 촉매 활성을 구비하였음을 확인할 수 있었다.
Time(h) PLA production (mM)
Wild-type Y51L Y51M Y51F Y51A
0.5 4.5 5.6 6.0 8.3 2.2
1 7.2 10.4 11.2 14.4 4.2
2 10.0 18.3 18.4 19.8 10.1
4 11.0 19.7 20.0 20.0 16.9
8 11.2 19.6 20.0 19.8 19.9
<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> D-lactate dehydrogenases with improved substrate preference for phenylpyruvic acid <130> PN190383 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 331 <212> PRT <213> Pediococcus acidilactici <400> 1 Met Lys Ile Ile Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Asp Glu Trp Val Thr Lys Asn His Ile Glu Val Lys Ala Val Pro Asp 20 25 30 Leu Leu Asp Ser Ser Asn Ile Asp Leu Ala Lys Asp Tyr Asp Gly Val 35 40 45 Val Ala Tyr Gln Gln Lys Pro Tyr Thr Ala Asp Leu Phe Asp Lys Met 50 55 60 His Glu Phe Gly Ile His Ala Phe Ser Leu Arg Asn Val Gly Val Asp 65 70 75 80 Asn Val Pro Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asn Asp Ile Lys Ile Ser Asn 85 90 95 Val Pro Ala Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr Gln 100 105 110 Leu Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ile Pro Glu Phe Glu Tyr Lys Met Ala 115 120 125 His Gly Asp Tyr Arg Trp Glu Pro Asp Ile Gly Leu Glu Leu Asn Gln 130 135 140 Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala Ile 145 150 155 160 Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Val Phe 165 170 175 Arg Asn Pro Ala Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu Glu 180 185 190 Glu Leu Tyr Gln Gln Ala Asn Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala Leu 195 200 205 Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asp Glu Lys Ala Phe Gly Gln Met Gln 210 215 220 Asp Gly Thr Phe Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp Thr 225 230 235 240 Pro Ala Leu Leu Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala Ala 245 250 255 Leu Asp Thr Tyr Glu Asn Glu Val Gly Ile Phe Asp Val Asp His Gly 260 265 270 Asp Gln Pro Ile Asp Asp Pro Val Phe Asn Asp Leu Met Ser Arg Arg 275 280 285 Asn Val Met Ile Thr Pro His Ala Ala Phe Tyr Thr Arg Pro Ala Val 290 295 300 Lys Asn Met Val Gln Ile Ala Leu Asp Asn Asn Arg Asp Leu Ile Glu 305 310 315 320 Lys Asn Ser Ser Lys Asn Glu Val Lys Phe Asp 325 330 <210> 2 <211> 1014 <212> DNA <213> Pediococcus acidilactici <400> 2 atgaaaatta tcgcctatgg cattcgcgat gacgaaaaac cgtacctgga tgaatgggtc 60 accaaaaacc atattgaagt gaaagcagtt ccggatctgc tggacagctc taatatcgat 120 ctggcaaaag attatgacgg tgtggttgct tatcagcaaa aaccgtacac cgcggacctg 180 tttgacaaaa tgcatgaatt tggcatccac gcgttcagcc tgcgtaacgt cggtgtggat 240 aatgttccgg cagacgctct gaagaaaaac gatatcaaaa tctcaaatgt gccggcctat 300 tcgccgcgtg cgattgccga actgtctgtt acccagctgc tggccctgct gcgcaaaatc 360 ccggaatttg aatataaaat ggcacacggc gattaccgtt gggaaccgga cattggtctg 420 gaactgaacc aaatgaccgt tggcgtcatt ggcacgggtc gtatcggtcg cgcggccatt 480 gatatcttta aaggcttcgg tgcaaaagtt attgcttatg acgtctttcg caatccggca 540 ctggaaaaag aaggcatgta tgtggatacc ctggaagaac tgtaccagca agctaacgtg 600 atcacgctgc atgttccggc gctgaaagat aattaccaca tgctggacga aaaagctttc 660 ggccagatgc aagatggtac ctttattctg aacttcgcgc gtggtaccct gatcgatacg 720 ccggcactgc tgaaagcact ggactccggc aaagttgcgg gtgcagctct ggatacgtat 780 gaaaatgaag tcggcatttt tgatgtggac catggtgatc agccgatcga tgacccggtt 840 ttcaacgacc tgatgagccg tcgcaatgtc atgattaccc cgcacgcagc attttacacg 900 cgtccggccg tcaaaaacat ggtgcagatt gcactggata acaatcgtga cctgatcgag 960 aaaaacagca gcaaaaatga agtgaaattc gatcaccacc atcaccatca ctaa 1014 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51G Forward primer <400> 3 gttgctggcc agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51G Reverse primer <400> 4 ttgctggcca gcaaccacac cgtcata 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51A Forward primer <400> 5 gttgctgcac agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51A Reverse primer <400> 6 ttgctgtgca gcaaccacac cgtcata 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51V Forward primer <400> 7 gttgctgtac agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51V Reverse primer <400> 8 ttgctgtaca gcaaccacac cgtcata 27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51L Forward primer <400> 9 gttgctctac agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51L Reverse primer <400> 10 ttgctgtaga gcaaccacac cgtcata 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51I Forward primer <400> 11 gttgctatcc agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51I Reverse primer <400> 12 ttgctggata gcaaccacac cgtcata 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51M Forward primer <400> 13 gttgctatgc agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51M Reverse primer <400> 14 ttgctgcata gcaaccacac cgtcata 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51F Forward primer <400> 15 gttgctttcc agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51F Reverse primer <400> 16 ttgctggaaa gcaaccacac cgtcata 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51S Forward primer <400> 17 gttgcttccc agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51S Reverse primer <400> 18 ttgctgggaa gcaaccacac cgtcata 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51W Forward primer <400> 19 gttgcttggc agcaaaaacc gtacacc 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y51W Reverse primer <400> 20 ttgctgccaa gcaaccacac cgtcata 27

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 51번째 아미노산이 류신(Leucine), 알라닌(Alanine), 세린(Serine), 메티오닌(Methionine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 이소류신(Isoleucine), 발린(Valine), 글리신(Glycine) 및 트립토판(Tryptophan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 아미노산 서열을 포함하는 D형-젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase).
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 페디오코쿠스 애시딜락티시(Pediococcus acidilactici)에서 유래한 것인, D형-젖산 탈수소효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 51번째 아미노산이 치환된 D형-젖산 탈수소효소는, 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 D형-젖산 탈수소효소에 대비하여 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid, PPA) 또는 2-케톤산(2-oxo acid)에 대한 기질선호도가 증진된 것인, D형-젖산 탈수소효소.
  4. 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC(서열번호 3 내), GCA(서열번호 5 내), GTA(서열번호 7 내), CTA(서열번호 9 내), ATC(서열번호 11 내), ATG(서열번호 13 내), TTC(서열번호 15 내), TCC(서열번호 17 내) 및 TGG(서열번호 19 내)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 유전자.
  5. 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC(서열번호 3 내), GCA(서열번호 5 내), GTA(서열번호 7 내), CTA(서열번호 9 내), ATC(서열번호 11 내), ATG(서열번호 13 내), TTC(서열번호 15 내), TCC(서열번호 17 내) 및 TGG(서열번호 19 내)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  6. 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC(서열번호 3 내), GCA(서열번호 5 내), GTA(서열번호 7 내), CTA(서열번호 9 내), ATC(서열번호 11 내), ATG(서열번호 13 내), TTC(서열번호 15 내), TCC(서열번호 17 내) 및 TGG(서열번호 19 내)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것인, 미생물.
  8. 서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC(서열번호 3 내), GCA(서열번호 5 내), GTA(서열번호 7 내), CTA(서열번호 9 내), ATC(서열번호 11 내), ATG(서열번호 13 내), TTC(서열번호 15 내), TCC(서열번호 17 내) 및 TGG(서열번호 19 내)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계를 포함하는 D형-젖산 탈수소효소(D-lactate dehydrogenase)의 생산방법.
  9. 다음의 단계를 포함하는 D형-3-페닐젖산(D-3-phenyllactic acid, D-PLA)의 생산방법:
    서열번호 2의 핵산 서열 중 151 내지 153번째 핵산 서열이 GGC(서열번호 3 내), GCA(서열번호 5 내), GTA(서열번호 7 내), CTA(서열번호 9 내), ATC(서열번호 11 내), ATG(서열번호 13 내), TTC(서열번호 15 내), TCC(서열번호 17 내) 및 TGG(서열번호 19 내)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된, 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 배양 단계; 및
    상기 미생물이 생산한 효소를 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid, PPA)에 접촉시켜 D형-3-페닐젖산으로 전환시키는 전환 단계.
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