KR20160104574A - 알켄 제조 - Google Patents

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멜라니 홀
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토마스 뷜터
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Abstract

본 발명은 1종 이상의 단쇄 지방산으로부터 1종 이상의 말단 알켄을 생성시킬 수 있으며, 하기를 포함하도록 유전적으로 변형되어 있고, 여기서 상기 단쇄 지방산은 C4-C10 지방산인 미생물 세포를 제공한다:
- 야생형 세포에 비해 CYP152 퍼옥시게나제 계열에서 선택되는 효소 (E1)의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제1 유전자 돌연변이, 및
- 야생형 세포에 비해 1종 이상의 NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (E2) 및 상응하는 매개체 단백질의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제2 유전자 돌연변이.

Description

알켄 제조{ALKENE PRODUCTION}
본 발명은 1종 이상의 지방산으로부터 1종 이상의 알켄을 생성시킬 수 있는 세포 및/또는 생물공학적 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 알켄은 단쇄 지방산으로부터 생성되는 1종 이상의 말단 알켄이다.
바이오매스를 석유의 지속가능한 대체물로 사용될 수 있는 가치있는 화합물로 전환시키기 위하여, 다양한 방법들이 연구되어 왔다. 화학물질 빌딩 블록 및 수송 연료의 주 공급원인 석유는 계속하여 고갈되고 있으며, 가격이 끊임없이 오르내리고 있다. 이에 따라, 대안적인 에너지 공급원을 찾을 필요성이 존재한다. 한 가지 그와 같은 에너지 공급원이 알켄이다.
예를 들어, 단쇄 및 중간쇄 α-올레핀은 생물연료로서 뿐만 아니라, 중합체 빌딩 블록으로도 사용된다. 특히, 알켄은 윤활제, 중합체 및 세제를 제조하는 데에 광범위하게 사용될 수 있다.
지방산은 알켄의 제조를 위한 바람직한 개시 물질인데, 그것이 낮은 산화 상태로 탄소를 함유하고 있기 때문이다. 또한, 지방산은 보통 지방과 같은 천연 자원으로부터 낮은 가격으로 대량 수득될 수 있다.
지방산으로부터의 알켄의 제조에 사용되는 현행 방법은 특성상 포화 비분지형 지방산 (≥ C11)으로부터 α-올레핀이 형성되는 화학이다. 이러한 방법은 보통 고가이고/거나 독성인 금속-기재 촉매 및 높은 온도 (> 130 ℃)를 필요로 한다.
2011년에, 루드(Rude) 등이 P450 모노옥시게나제 OleT를 사용한 비분지형 포화 장쇄 C18- 및 C16-지방산 (스테아르산 및 팔미트산)의 α-올레핀으로의 최초의 직접적인 효소적 탈카르복실화에 대해 보고하였었다. 상기 촉매는 천연 산화환원 상대물에 대한 필요성을 회피하는 산화제로서 H2O2를 사용하는 그의 퍼옥시드 분로(shunt)를 통하여 작용되었다. 이후, 문헌 [Belcher, J., et al., 2014]는 OleT의 결정 구조에 대해 개시하였는데, 기질의 영역이 C12-지방산 (라우르산)까지 확장되었다. 그러나, 산화제로서의 H2O2의 사용은 몇 가지 안전성 우려를 가지고 있어서, 그것이 발견될 수 있는 기계를 파괴할 뿐만 아니라, 불안정하기까지 하다. 반응 혼합물에 계속해서 H2O2를 첨가해야 하는 필요성은 또한 반응의 비용을 증가시키며, 불편하다. 이에 따라, 가용한 생물공학적 방법들은 비효율적이며 낮은 비용으로 높은 수율을 산출하기가 불가능하다. 따라서, 재생성 자원으로부터의 개선된 생물공학적 알켄 제조 방법에 대한 필요성이 관련 기술분야에 존재한다.
본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 단쇄 지방산으로부터 알켄을 제조하는 생물공학적 수단을 제공하는 것에 의해 상기 언급된 문제점들을 해결한다. 구체적으로, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 적어도 C4-C10의 사슬 길이를 가지는 단쇄 비분지형 포화 지방산의 산화성 탈카르복실화에 의하며, 세포가 H2O2를 필요로 하지 않는, 말단 알켄의 생물촉매촉진 합성을 위한 신규한 효소 연속단계(enzyme cascade)를 제공한다. 상기 신규 효소 연속단계는 H2O2-비의존성이며 1종 이상의 P450 모노옥시게나제에 의해 촉매촉진될 수 있는 탈카르복실화 반응을 포함한다. 구체적으로, 상기 세포는 탈카르복실화 반응을 사용하여 단쇄 지방산으로부터 1종 이상의 알켄을 생성시키도록 생물촉매촉진 시스템을 최적화할 수 있는 효소, 예를 들면 OleT를 발현하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 측면에서는, 1종 이상의 단쇄 지방산으로부터 1종 이상의 말단 알켄을 생성시킬 수 있는 미생물 세포가 제공되는데, 여기서 상기 세포는 하기를 포함하도록 유전적으로 변형되어 있으며, 상기 단쇄 지방산은 C4-C10 지방산이다:
- 야생형 세포에 비해 CYP152 퍼옥시게나제 계열(peroxygenase family)에서 선택되는 효소 (E1)의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제1 유전자 돌연변이, 및
- 야생형 세포에 비해 1종 이상의 NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (E2) 및 상응하는 매개체 단백질의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제2 유전자 돌연변이.
알켄을 생성시키는 데에 보통 사용되는 일반적인 화학-촉매촉진 경로와 달리, 본 발명의 임의 측면에 따른 방법은 전체 세포 또는 단리된 효소를 사용할 수 있다. 이는 상기 방법이 온건한 반응 조건하에서 수행되는 것을 가능케 함으로써, 최소한의 폐기물 방출로 지속가능한 과정을 가능케 한다. 이는 예상치 못한 결과인데, 선행 기술 (문헌 [Fujishiro T., 2007] 및 [Matsunaga I., 2002])은 페레독신 및 페레독신 리덕타제와 같은 P450 리덕타제 시스템이 P450BSβ 및 P450SPα의 활성을 지지하지 않는다고 보고하고 있기 때문이다.
또한, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 기질로 사용되는 단쇄 지방산으로부터의 대규모 알켄 제조를 가능케 한다. 이는 상응하는 알켄을 생성시키는 데에 10 mM의 기질 농도가 사용된 예에서 찾아볼 수 있다. 현재 가용한 알켄 제조 방법들이 스테아르산과 같은 기질 최대 1 mM의 각 알켄으로의 전환을 나타내고 있기 때문에, 이는 예상치 못한 결과였다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 1종 이상의 단쇄 지방산으로부터 1종 이상의 말단 알켄을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 임의 측면에 따른 상기 방법은 추가적인 장점들을 가지는데, 예컨대 그것은 산화제로서 O2를 사용함으로써, 산화제로서 H2O를 사용하는 관련 기술분야 공지의 방법에 비해 과정이 더 효율적이 되도록 하며; 상기 방법은 재생성 자원으로부터의 전자 전달을 가능케 하고; 본 발명의 임의 측면에 따른 상기 방법은 또한 상당히 높은 알켄 생성으로 이어진다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포의, 1종 이상의 말단 알켄을 제조하기 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 지방산 티오에스테르 대신 유리 지방산을 직접 기질로 사용할 수 있는데, 지방산이 더 풍부할 수 있기 때문에, 이는 대사 공학상 유리할 수 있다. 또한, 미생물 세포 공장으로 흔하게 사용되고 있는 세포, 예를 들면 이. 콜리(E. coli)에서 그의 풍부도 및 조성이 용이하게 조작될 수 있다. 따라서, P450 지방산 탈카르복실화 기구를 가지는 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 생물학적 말단 알켄-제조 시스템으로 조작될 커다란 잠재력을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 탈카르복실화 반응을 위한 최적화된 생물촉매촉진 시스템 (> 100 mgL- 1)을 제공하며, 기질 영역을 단쇄 지방산으로 확장한다.
말단 알켄은 탄소 사슬의 말단에 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 불포화 탄화수소를 지칭하는 말단 올레핀으로도 알려져 있을 수 있다. 이와 같은 C-C 이중 결합은 탄화수소 사슬의 시작부 (α) 또는 종료부 (γ)에 존재할 수 있다. 하나의 이중 결합만을 가지며 다른 관능기는 가지지 않는 가장 간단한 비고리형 알켄은 CnH2n의 일반 화학식을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 말단 알켄은 다른 관능기를 포함할 수도 있다. 본 발명의 임의 측면에 따른 말단 알켄은 기질 단쇄 지방산의 탄소 원자 수와 동일한 수의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질이 부티르산인 경우, 형성되는 말단 알켄은 프로펜일 수 있다. 마찬가지로, 기질이 발레르산/펜탄산인 경우, 형성되는 말단 알켄은 부텐일 수 있으며; 기질이 카프로산/헥산산인 경우, 형성되는 말단 알켄은 펜텐일 수 있고; 기질이 에난트산/헵탄산인 경우, 형성되는 말단 알켄은 헥센일 수 있으며; 기질이 카프릴산/옥탄산인 경우, 형성되는 말단 알켄은 헵텐일 수 있고; 기질이 펠라르곤산/노난산인 경우, 형성되는 말단 알켄은 옥텐일 수 있으며; 기질이 카프르산/데칸산인 경우, 형성되는 말단 알켄은 노넨일 수 있는 등이다. 일 예에서, 각 지방산으로부터 제조되는 프로펜 및/또는 1-부텐과 같은 알켄은 실시예에 나타낸 신규한 수단을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "단쇄 지방산"이라는 용어는 10개 탄소 미만의 지방족 미부(tail)를 가지는 지방산의 하위군을 지칭한다. 상기 지방산은 포화, 불포화, 분지형 또는 비분지형인 지방산일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 단쇄 지방산은 프로피온산, 부티르산/부탄산, 발레르산/펜탄산, 카프로산/헥산산, 에난트산, 헵탄산, 카프릴산/옥탄산, 펠라르곤산/노난산, 카프르산/데칸산 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 단쇄 지방산은 C2-C22 지방산일 수 있다. 더욱 더 구체적으로, 상기 지방산은 C4-C10 지방산일 수 있다. 일 예에서, 지방산은 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산 (2-메틸프로판산), 부티르산, 이소발레르산 (3-메틸부탄산), 발레르산 (펜탄산) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 광범위한 미생물 세포를 지칭할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포는 슈도모나스( Pseudomonas ), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 바실루스 (Bacillus) 및 에셰리키아(Escherichia)로 이루어진 군에서 선택되는 원핵 또는 저급 진핵 세포일 수 있다. 일 예에서, 세포는 에 셰리키아 콜리(Escherichia coli)일 수 있다. 또 다른 예에서, 세포는 저급 진핵세포, 예컨대 사카로마이세스 ( Saccharomyces ), 칸디다( Candida ), 피치아 ( Pichia ), 쉬조사카로마이세스 ( Schizosaccharomyces ) 및 야로위아 ( Yarrowia ), 특히 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 군에 속하는 진균일 수 있다. 세포는 단리된 세포, 다른 말로 하면 단일 균주의 순수 배양물일 수 있거나, 또는 2종 이상 균주의 혼합물을 포함할 수 있다. 생물공학적으로 적절한 세포들이 예를 들면 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection) (ATCC) 또는 독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ)으로부터 시중에서 입수가능하다. 세포를 유지하고 변형시키기 위한 입자들은 선행 기술, 예를 들면 문헌 [Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989)]에서 가용하다.
세포 또는 미생물과 연계되어 본원에서 사용될 때의 "야생형"이라는 구는 야생에서 자연적으로 나타날 때의 형태인 게놈 구성을 가지는 세포를 나타낼 수 있다. 상기 용어는 전체 세포 및 개별 유전자 모두에 적용가능할 수 있다. 따라서, 재조합 방법을 사용하여 인간에 의해 적어도 부분적으로 유전자 서열이 변경된 세포 또는 유전자는 "야생형"이라는 용어에 포함되지 않는다.
본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 효소들 중 어느 것은 단리된 효소일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 효소는 활성인 상태로, 그리고 그의 활성에 필수적인 모든 보조인자, 기질, 보조제 및/또는 활성화 폴리펩티드 또는 인자의 존재하에 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 자연에서 그것이 출현하는 세포에 비해 해당 효소가 농축된다는 것을 의미한다. 효소는 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 및/또는 활성 검정에 의해 농축될 수 있다. 예를 들면, 해당 효소는 쿠마시 블루 염료를 사용한 염색 후 폴리아크릴아미드 겔의 시각적 검사에 의해 판단하였을 때, 조제물에 존재하는 전체 폴리펩티드의 5, 10, 20, 50, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 퍼센트 초과를 구성할 수 있다.
본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 세포 및/또는 효소는 재조합체일 수 있다. 본원에서 사용될 때의 "재조합체"라는 용어는 분자를 지칭하는데, 자연적으로는 그와 같이 출현하지 않으며 대신 유전 공학의 결과인 분자, 특히 폴리펩티드 또는 핵산에 의해 코딩되거나, 또는 재조합 분자를 포함하는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 촉매촉진 활성 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 기능적으로 연결되어 있는 프로모터를 포함하며, 촉매촉진 활성 폴리펩티드가 원래의 변경되지 않은 핵산 분자를 포함하는 상응 야생형 세포에서의 폴리펩티드 농도에 비해 과발현되도록 상기 프로모터가 조작되어 있는 경우, 핵산 분자는 재조합체이다.
핵산 분자, 폴리펩티드, 더 구체적으로는 본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 효소가 재조합체인지 아닌지 여부가 반드시 그의 발현 농도에 대한 의미를 가지는 것은 아니다. 그러나, 일 예에서, 본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 1종 이상의 재조합 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 효소는 과발현될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "과발현되다"라는 용어는 코딩되거나 발현되는 각 폴리펩티드가 예를 들면 각 야생형 세포에서 발현을 증가시키기 위하여 수행된 유전적 변형의 부재하에 동일한 조건하에 정상적으로 세포에서 발견되게 되는 것에 비해 더 높은 농도 또는 더 높은 활성으로 발현된다는 것을 의미한다. 통상의 기술자라면, 과발현을 초래하는 수많은 방법들에 친숙하다. 예를 들면, 과발현될 것이거나 과발현될 폴리펩티드 또는 효소를 코딩하고 있는 핵산 분자는 lac 프로모터와 같은 강한 유도성 프로모터의 조절하에 위치될 수 있다. 현행 기술에, 이와 같은 목적으로 사용될 수 있는 표준 플라스미드들, 예를 들면 pET-3a (노바겐(Novagen) 사로부터 시중에서 구입가능)로 예시되는 벡터의 pET 시스템이 기술되어 있다. 핵산 또는 폴리펩티드가 과발현하는지 여부는 핵산 분자의 경우에는 정량 PCR 반응에 의해, 폴리펩티드의 경우에는 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동, 웨스턴 블러팅 또는 비교 활성 검정에 의해 측정될 수 있다. 유전적 변형은 선택 및/또는 확인된 배양 조건하에서의 효소 활성 및/또는 선택성의 변화를 초래하는 전사, 번역 및/또는 번역-후 변형으로 지시될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 예에서, 더 효율적으로 기능하기 위하여, 미생물은 하나 이상의 유전자 결실을 포함할 수 있다. 유전자 결실은 돌연변이성 유전자 결실 접근법에 의해, 및/또는 해당 효소 1종 이상의 발현이 감소되거나 없는 돌연변이 균주로 시작하여, 및/또는 통상의 기술자에게 알려져 있는 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 임의 측면에 따라 사용되는 CYP152 퍼옥시게나제 계열에서 선택되는 효소 (E1)는 시토크롬 P450 효소 (CYP) 상과 (문헌 [Malca et al., 2011])의 일부일 수 있다. 통상적으로, P450 효소는 1종 이상의 산화환원 상대물 단백질을 사용하여 NAD(P)H로부터 이산소 활성화를 위한 헴 철 반응성 중심으로 2개의 전자를 전달한 다음, O2 중 하나의 원자를 그의 기질로 삽입한다. CYP152 퍼옥시게나제 계열 내의 효소들은 유일한 전자 및 산소 공여체로서 H2O2 만을 사용하는 것으로 확인되어 있다. 그러나, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포에서는, NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (E2) 및 상응하는 매개체 단백질이 전자 및 산소 공여체의 공급원으로 사용될 수 있다. 저-비용 말단 알켄의 대규모 제조에서, 다량의 퍼옥시드 사용은 비용을 제한하며, 높은 H2O2 농도는 생물촉매를 빠르게 불활성화할 수 있기 때문에, 이는 유리하다. 따라서, 전자 공급원으로서의 NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (E2) 및 상응하는 매개체 단백질의 사용은 말단 알켄의 더 비용-효과적인 미생물 제조를 제공한다. 여기에 대해서는 문헌 [Liu et al., 2014]으로써 추가적으로 설명될 수 있다.
구체적으로, 효소 E1은 CYPSPα (E1a), CYPBSB (E1b) (EC 1.11.2.4) 및 OleT (E1c)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 더 구체적으로, 효소 E1은 OleT (E1c) 또는 그의 변이체일 수 있다. 일 예에서, 효소 E1은 ADW41779.1의 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, 효소 E1은 서열 1과 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 100 %의 서열 동일성을 가질 수 있다.
통상의 기술자라면, 1종 이상의 지방산으로부터 1종 이상의 말단 알켄을 형성시키는 다른 과정을 수행하는 데에 사용될 수 있는 가능한 OleT의 서열을 확인할 수 있을 것이다. 일 예에서, 통상의 기술자라면, 적합한 세포에 OleT (E1c)를 도입하는 구조 및 수단을 측정하고 세포에서의 효소의 발현을 측정하는 데에 문헌 [Liu et al, 2014], [Rude M.A, 2011], [Schallmey, A., 2011], [Fukada H., 1994], [Belcher J., 2014] 등의 개시내용을 사용할 수 있다. OleT는 (다른 H2O2-의존성 효소 반응과 비교하였을 때) 인공 전자 전달 시스템을 더 높은 수율로 이끌 수 있다.
본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 1종 이상의 효소 NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (E2) 및 상응하는 매개체 단백질의 야생형 세포 대비 발현을 증가시키는 제2의 유전적 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 효소는 매개체 단백질을 산화시켜 2개의 전자를 수용하는 옥시도리덕타제 계열에 속한다. 구체적으로, NAD(P)+ 옥시도리덕타제는 철-황 단백질을 전자 공여체로, 그리고 NAD+ 또는 NADP+를 전자 수용체로 사용한다. 한네만(Hannemann) 등은 본 발명의 임의 측면에 따른 효소 E2로 사용될 수 있는 다양한 종류의 산화환원-매개체들의 목록을 개시하고 있다. 일 예에서는, 인공/"화학적" 산화환원 매개체가 리덕타제 또는 전기적 공급원 중 어느 하나로부터 헴 철 클러스터로 전자를 전달할 수 있다.
더 구체적으로, NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (EC 1.18.1.5) 및 상응하는 단백질은 하기로 이루어진 군에서 선택될 수 있다:
(a) 페레독신 리덕타제 (E2a) 및 페레독신; 또는
(b) 푸티다레독신 리덕타제 (E2b) 및 푸티다레독신 (문헌 [Schallmey, A., 2011]).
구체적으로, E2는 CamA일 수 있으며, 매개체 단백질은 CamB일 수 있다. E2는 서열 2와 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 100 %의 서열 동일성을 가질 수 있고/거나, 매개체 단백질은 서열 3과 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 100 %의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일 예로써, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포에서, E2는 페레독신 리덕타제 (E2a)일 수 있는데, 이 경우 페레독신도 존재할 수 있으며, E2a는 E1과 기능적으로 상호작용가능할 수 있다. 구체적으로, E1 및 E2의 공급원은 동일하거나 상이할 수 있다. 일 예에서, E1 및 E2 양자는 동일한 공급원, 예를 들면 알카니보락스 보르쿠멘시스 (Alcanivorax borkumensis ) SK2 (수탁 번호 YP_691921)로부터 유래할 수 있다. 이와 같은 예에서, E2a 및 페레독신은 각각 YP_691923 및 YP_691920의 수탁 번호를 가질 수 있다.
또 다른 예로써, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포에서, E2는 푸티다레독신 리덕타제 (E2b)일 수 있는데, 이 경우 푸티다레독신도 존재할 수 있으며, E2b는 E1과 기능적으로 상호작용가능할 수 있다. 일 예에서, E2b는 슈도모나스 푸티 다(Pseudomonas putida )의 P450cam 효소 시스템에 속할 수 있다. 푸티다레독신 리덕타제의 경우, 통상적으로 사용되는 효소의 양은 약 100 내지 10,000 ca, 1000 내지 5000 ca, 2000 내지 4000 ca 또는 구체적으로는 3000 ca일 수 있다. ca는 페리시아니드에 의한 NADH의 산화를 매개하는 데에 있어서의 푸티다레독신 리덕타제 활성의 단위로써, 분 당 리덕타제 mg 당 산화되는 NADH 1 μmole로 정의된다.
E2는 정제되거나 단리된 재조합 단백질 또는 자연 발생 단백질이다. E2는 그것이 전자 전달을 수행하는 속도를 최적화하는 것과 같은 그의 성능 또는 그의 기질 특이성이 향상되도록 돌연변이되어 있을 수 있다. 사용되는 리덕타제의 양은 측정되는 것의 정확한 특성 및 구체적인 검정 세부사항에 따라 달라지게 되나, 통상적으로는 0 내지 1000 μM, 0.001 내지 100 μM, 0.01 내지 50 μM, 0.1 내지 25 μM, 구체적으로는 1 내지 10 μM의 농도로 리덕타제가 존재하게 된다.
본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 추가적으로 야생형 세포에 비해 보조인자 재생을 할 수 있는 1종 이상 효소 (E3)의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제3 유전자 돌연변이를 포함한다. 구체적으로 E3는 NAD(P)H 재생을 할 수 있을 수 있다. E3는 NAD(P)H 재생을 할 수 있을 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 구체적으로, E3는 NAD(P)를 전자 수용체로 사용하는 (EC 1.1.1.X) 데히드로게나제/옥시도리덕타제일 수 있다. 더 구체적으로, E3는 2014년 2월 24일자 브렌다(Brenda) 데이터베이스에서 KEGG 번호 EC 1.1.1.X를 가지는 임의의 효소일 수 있다. 예를 들면, E3는 알콜 데히드로게나제, 글리세롤 포스페이트 데히드로게나제, 히스티딘올 데히드로게나제, 쉬키메이트 데히드로게나제, 락테이트 데히드로게나제, 3-히드록시아릴-CoA 데히드로게나제, 말레이트 데히드로게나제, 이소시트레이트 데히드로게나제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 포르메이트 데히드로게나제, 말 간 알콜 데히드로게나제, 글루코스 데히드로게나제, 아미노산 데히드로게나제, 소르비톨 데히드로게나제, 20-β-히드록시스테로이드 데히드로게나제 및 포름알데히드 데히드로게나제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 더욱 더 구체적으로, 효소 (E3)는 글루코스 데히드로게나제 (E3a) (EC　1.1.99.10), 포스파이트 데히드로게나제 (E3b) (EC 1.20.1.1) 및 포르메이트 데히드로게나제 (E3c) (EC　1.2.1.43)로 이루어진 군에서 선택될 수 있는데, 글루코스, 포스파이트 및 포르메이트가 각각 환원제로 사용된다. 효소 (E3)의 존재는 보조인자 재생을 가능케 하며, 그것은 지방산으로부터 알칸을 생성시키는 과정이 자가-지속성이 되도록 하는 것을 가능케 한다. 따라서, 알켄을 생성시키는 시스템으로 외부 에너지가 도입될 필요가 없게 된다. 따라서, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 어떠한 외부 에너지 공급원에 대한 필요성도 없이 적어도 효소 E1, E2 및/또는 E3의 존재하에 지방산으로부터 1종 이상의 알켄을 생성시킬 수 있다.
일 예에서, 상기 글루코스 데히드로게나제 (E3a)는 NADP+-특이적 글루코스 데히드로게나제일 수 있다. 글루코스 데히드로게나제 (E3a)의 공급원으로 사용되는 생물체에 제한은 두지 않아서, 미생물 또는 더 고등인 생물체일 수 있는데, 세균, 진균 및 효모와 같은 미생물이 적합하다. 예를 들면, 바실루스 속의 미생물, 구체적으로는 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium)이 공급원일 수 있다. 또 다른 예에서, 공급원은 크립토코쿠스( Cryptococcus ) 속, 글루코노박터 ( Gluconobacter ) 속 또는 사카로마이세스 ( Saccharomyces ) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 크립토코쿠스 속에 속하는 미생물이 선택될 수 있는데, 더 구체적으로 미생물은 크립토코쿠스 알비두스 ( Cryptococcus albidus ), 크립토코쿠스 휴 미콜루스 ( Cryptococcus humicolus ), 크립토코쿠스 테레우스 ( Cryptococus terreus ) 및 크립토코쿠스 유니구툴라투스 ( Cryptococcus uniguttulatus )로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, 효소 E3는 포스파이트 데히드로게나제 (E3b) 또는 포르메이트 데히드로게나제 (E3c)일 수 있다. 포스파이트 데히드로게나제 (E3b) 또는 포르메이트 데히드로게나제 (E3c)의 공급원으로 사용되는 생물체에 제한은 두지 않을 수 있어서, 미생물 또는 더 고등인 생물체일 수 있는데, 세균, 진균 및 효모와 같은 미생물이 적합하다.
일 예에서, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 효소 E1c, E2a 및 E3a의 증가된 발현을 나타낸다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 E1c, E2a 및 E3b; E1c, E2a 및 E3c; E1c, E2b 및 E3a; E1c, E2b 및 E3b; 또는 E1c, E2b 및 E3c의 증가된 발현을 나타낸다.
본 발명의 교시는 예를 들면 명칭 또는 수탁 번호에 의해 본 출원에서 명시적으로 또는 암묵적으로 언급되는 정확한 아미노산 또는 핵산 서열을 가지는 생물학적 거대분자를 사용하여서는 물론, 그와 같은 서열의 변이체를 사용하여서도 수행될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "변이체"라는 용어는 참조 아미노산 또는 핵산 서열과 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 % 이상 동일하며, 바람직하게는 기능, 예를 들면 단백질의 촉매촉진 활성, 또는 분자의 접힘 또는 구조에 필수적인 것들이 아닌 다른 아미노산이 결실, 치환 또는 삽입에 의해 대체되어 있거나, 또는 참조 서열 또는 그로부터 유래하는 분자의 생물학적 활성이 보존되는 효과에 대하여 보존적인 방식으로 필수 아미노산이 대체되어 있는, 각각 아미노산 또는 핵산 서열을 포괄한다. 현행 기술은 2개의 주어진 핵산 또는 아미노산 서열을 정렬하여 동일성 정도를 계산하는 데에 사용될 수 있는 알고리즘을 포함하고 있는 바, 문헌 [Arthur Lesk (2008)], [Thompson et al., 1994] 및 [Katoh et al., 2005]을 참조하라. "변이체"라는 용어는 "동종체"라는 용어와 동의어로 호환가능하게 사용된다. 이와 같은 변이체는 아미노산 또는 핵산 서열에 결실, 삽입 또는 치환을 도입하는 것은 물론, 해당 거대분자 또는 그의 변이체를 포함하는 융합에 의해서도 제조될 수 있다. 일 예에서, 아미노산 서열과 관련한 "변이체"라는 용어는 상기한 서열 동일성 이외에도, 각 참조 또는 야생형 서열과 관련한 1종 이상의 보존성 아미노산 변화를 포함하는 아미노산 서열을 포괄하거나, 또는 1종 이상의 보존성 아미노산 변화를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포괄한다. 일 예에서, 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 "변이체"라는 용어는 상기한 서열 동일성 정도 이외에도, 각각 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 임의의 활성인 부분 및/또는 단편, 또는 아미노산 서열의 활성 부분 및/또는 단편을 코딩하는 임의의 핵산 서열을 포괄한다. 본원에서 사용될 때, "활성 부분"이라는 용어는 각각 전체 길이 아미노산 서열 미만이거나 전체 길이 아미노산 서열 미만을 코딩하는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 지칭하는데, 여기서 상기 아미노산 서열 또는 코딩되어 있는 아미노산 서열은 각각 그의 필수적인 생물학적 활성 중 일부 이상을 보유한다. 예를 들어, 프로테아제의 활성 부분 및/또는 단편은 폴리펩티드 중 펩티드 결합을 가수분해가능할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "그의 필수적인 생물학적 활성 중 일부 이상을 보유하다"라는 구는 문제의 아미노산 서열이 바탕 활성을 초과하며 그것과는 구별되는 생물학적 활성을 가지며, 상기 활성을 특징짓는 동역학적 파라미터, 더 구체적으로는 kcat 및 KM이 바람직하게는 특정 기질과 관련하여 참조 분자가 나타내는 값의 3, 2 또는 1 자릿수 크기 이내라는 것을 의미한다. 마찬가지로, 핵산의 "변이체"라는 용어는 그의 상보성 가닥이 바람직하게는 엄밀한 조건하에서 참조 또는 야생형 핵산에 혼성화되는 핵산을 포괄한다. 통상의 기술자라면, 본 발명의 임의 측면에 따라 지방산으로부터 알켄을 제조할 수 있게 되는 상기 효소 E1, E2 및/또는 E3를 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
H2O2 존재 및 H2O2 부재 (즉 그 대신의 효소 E2 및 매개체 단백질의 존재)하에 본 발명의 임의 측면에 따른 세포에서 이루어지는 반응의 차이에 대한 도시를 반응식 1에 나타낸다. 구체적으로, 반응식 1(A)에는, 말단-올레핀으로의 포화 지방산의 탈카르복실화를 위한 효소적 산화환원-연속단계를 나타낸다. 전자는 히드라이드 공여체 (예컨대 글루코스, 포르메이트 또는 포스파이트)로부터 주변 O2 소비하에 지방산의 산화성 탈카르복실화를 촉매촉진하는 CamAB 내지 OleT를 통하여 C3-C21 범위의 사슬 길이를 가지는 말단 올레핀으로 전달되는 것으로 나타나 있다. 검출되는 부산물들은 괄호 안에 나타낸다. 반응식 1(B)에는, H2O2 존재하에서의 동일한 반응을 나타낸다.
<반응식 1>
Figure pat00001
반응식 1: OleT를 사용한 비분지형 포화 지방산의 산화성 탈카르복실화
혼성화 반응의 엄밀도는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정가능한데, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 경험적 계산이다. 일반적으로, 더 긴 프로브는 적정한 어닐링에 더 높은 온도를 필요로 하는 반면, 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 그의 용융 온도 미만인 환경 중에 존재할 때 상보성 가닥에 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능 서열 사이의 원하는 상동성 정도가 더 높을수록, 사용될 수 있는 상대적 온도는 더 높다. 그에 따라 결과로서, 더 높은 상대적 온도는 반응 조건이 더 엄밀하게 되도록 하는 경향이 있게 되는 반면, 더 낮은 온도는 덜 그러하다. 혼성화 반응의 엄밀도에 대한 추가적인 세부사항 및 설명에 대해서는, 문헌 [F.M. Ausubel (1995)]을 참조하라. 통상의 기술자라면, 혼성화에 의해 DNA 서열을 확인하는 방법에 대해서는 문헌 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization", Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993] 및 [Liebl et al., 1991]에 제공되어 있는 지침을 따를 수 있다. 일 예에서는, 엄밀한 조건이 임의의 혼성화에 적용되는데, 다시 말하자면 프로브가 표적 서열과 70 % 이상 동일한 경우에만 혼성화가 이루어진다. 표적 서열 대비 더 낮은 동일성 정도를 가지는 프로브가 혼성화될 수 있기는 하지만, 그와 같은 혼성체는 불안정해서, 예를 들면 온도가 더 바람직한 순서로 대략 50 ℃-68 ℃, 대략 52 ℃-68 ℃, 대략 54 ℃-68 ℃, 대략 56 ℃-68 ℃, 대략 58 ℃-68 ℃, 대략 60 ℃-68 ℃, 대략 62 ℃-68 ℃, 대략 64 ℃-68 ℃, 대략 66 ℃-68 ℃인 동안 염의 농도를 2×SSC, 또는 임의적으로 차후에 0.5×SSC로 낮추는 것에 의한 엄밀 조건하에서의 세척 단계에서 제거되게 된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 온도는 대략 64 ℃-68 ℃ 또는 대략 66 ℃-68 ℃이다. 염의 농도는 0.2×SSC 또는 심지어는 0.1×SSC로 조정하는 것이 가능하다. 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % 이상의 참조 또는 야생형 서열과 관련한 동일성 정도를 가지는 폴리뉴클레오티드 단편이 단리될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 핵산 서열의 "동종체"라는 용어는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)에 따라 참조 핵산 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다.
통상의 기술자라면, 효소 E1, E2 및 E3 각각의 활성을 용이하게 측정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포에서 E1의 발현이 증가되는지를 측정하기 위하여, 통상의 기술자는 문헌 [Liu et al, 2014], [Rude M.A, 2011], [Schallmey, A., 2011] 등에 개시되어 있는 검정을 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포에서 E2의 발현이 증가되는지를 측정하기 위하여, 통상의 기술자는 문헌 [Scheps, D, 2011], [Roome et al.], [Schallmey et al.] 등에 개시되어 있는 검정을 사용할 수 있다. 세포에서의 E3의 발현은 그것이 증가되는지 또는 감소되는지에 관계없이, 340 nm에서의 흡광도 변화로서 포르메이트 데히드로게나제 활성 측정 (NAD(P)+ 감소를 통함)이 측정되는 적어도 문헌 [Cartel et al.]에 개시되어 있는 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 통상의 기술자라면, 본 발명의 세포에서 사용되는 효소의 발현을 측정하는 데에 사용될 수 있는 다른 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 용이하게 확인할 수 있을 것이다.
본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 감소된 베타-산화에 의한 지방산 분해 능력을 가질 수 있다. 구체적으로, 야생형 세포에 비해 감소된 지방산 분해 능력은 아실-CoA 데히드로게나제 (FadE) (E6) (EC:1.3.99.-), 에노일-CoA 히드라타제 (FadB) (E7) (EC 4.2.1.17), (R)-3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 (FadB) (E8) (EC 1.1.1.35) 및 3-케토아실-CoA 티올라제 (FadA) (E9) (EC:2.3.1.16)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상 효소의 야생형 세포에 비해 감소된 발현의 결과일 수 있다.
본원에서 사용될 때, "감소된 지방산 분해 능력을 가지는"이라는 용어는 각 세포가 지방산, 구체적으로는 환경으로부터 흡수된 것들을 정상적인 지방산 분해 능력을 가지는 유사한 세포 또는 야생형 세포가 동일한 조건하에서 하게 되는 것에 비해 더 낮은 속도로 분해한다는 것을 의미한다. 일 예에서, 그와 같은 세포의 지방산 분해는 β-산화 경로에 연관되어 있는 효소를 코딩하는 1종 이상 유전자의 결실, 억제 또는 불활성화로 인하여 더 낮다. 일 예에서는, β-산화 경로에 연관되어 있는 1종 이상의 효소가 각 야생형 미생물 중 유사한 조건하에서의 동일 효소의 활성 대비 더 바람직한 순서로 5, 10, 20, 40, 50, 75, 90 또는 99 %의 활성을 상실하고 있다. 통상의 기술자라면, 예를 들면 문헌 [Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 방사능에의 세포의 노출 후 이어지는 생성 돌연변이의 축적 또는 스크리닝, 점 돌연변이의 위치-지정 도입, 또는 활성 효소를 코딩하는 염색체상 통합 유전자의 녹아웃에 의해 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키거나 세포에서 그와 같은 효소의 활성을 감소시키는 데에 사용될 수 있는 다양한 기술들에 친숙할 수 있다. 또한, β-산화 경로에 연관되어 있는 효소의 발현이 억제되는 효과를 위하여 전사 억제인자인 FadR이 과발현될 수도 있다 (문헌 [Fujita, Y., et al, 2007]). 본원에서 사용될 때, "유전자의 결실"이라는 구는 상기 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 상기 유전자에 의해 코딩되는 활성 폴리펩티드의 발현이 감소되도록 변형된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 유전자는 폴리펩티드의 촉매촉진 활성 중심을 코딩하는 서열을 포함하는 서열 중 일부를 인-프레임으로 제거하는 것에 의해 결실될 수 있다. 다르게는, 리보솜이 더 이상 상응하는 RNA를 번역하지 않도록 리보솜 결합 부위가 변경될 수 있다. 효소학 교재, 예를 들면 문헌 [Cornish-Bowden, 1995]에 기술되어 있는 바와 같이 표준 검정을 사용하여 살아있는 세포에 의해 발현되는 효소의 활성을 측정하는 것은 통상의 기술자에게는 일상적인 기술에 속하게 된다.
지방산의 분해는 일련의 효소적 촉매촉진 반응들에 의해 수행된다. 먼저, 지방산이 흡수된 후, 이. 콜리의 경우 각각 FadL 및 FadD/FadK로 지칭되는 지방산-CoA 리가제 활성을 가지는 1종 이상의 외부 막 단백질 및 1종의 내부 막-결합 단백질과 연관되어 있는 수송/아실-활성화 기작을 통해 세포 막을 횡단하여 전위된다. 세포 내부에서, 분해될 지방산은 β-산화 경로의 다른 반응들을 촉매촉진하는 효소들에 적용된다. 첫 번째 세포내 단계는 아실-CoA 데히드로게나제를 통한 아실-CoA의 에노일-CoA로의 전환을 포함하는데, 후자는 이. 콜리의 경우 FadE로 지칭된다. 아실-CoA 데히드로게나제의 활성은 현행 기술에 기술되어 있는 바와 같이 예를 들면 100 mM MOPS, pH 7.4, 0.2 mM 에노일-CoA, 0.4 mM NAD+ 중 340 nm에서의 분광광도측정법에 의해 NADH 농도를 모니터링하는 것에 의해 검정될 수 있다. 생성되는 에노일-CoA는 이. 콜리에서 FadB 및 FadJ로 지칭되는 에노일-CoA 히드라타제/(R)-3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제에 의해 촉매촉진되는 수화 및 산화를 통하여 3-히드록시아실-CoA를 경유 3-케토아실-CoA로 전환된다. 에노일-CoA 히드라타제/3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 활성, 더 구체적으로는 생성물인 NADH의 형성은 현행 기술에 기술되어 있는 바와 같이, 예를 들면 FadE에 대하여 개괄되어 있는 바와 같이 분광광도측정법에 의해 검정될 수 있다. 마지막으로, 이.콜리에서 FadA 및 FadI인 3-케토아실-CoA 티올라제가 3-케토아실-CoA의 절단을 촉매촉진하여 아세틸-CoA를 생성시킴으로써, 투입된 아실-CoA는 2개 탄소 원자만큼 짧아진다. 케토아실-CoA 티올라제의 활성은 현행 기술, 예를 들면 문헌 [Antonenkov, V., et al, 1997]에 기술되어 있는 바와 같이 검정될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "감소된 지방산 분해 능력을 가지는 세포"라는 구는 지방산, 구체적으로는 8개 이상 탄소의 사슬을 가지는 것들에 대한 감소된 흡수 및/또는 분해 능력을 가지는 세포를 지칭한다. 세포의 지방산 분해 능력은 다양한 방식으로 감소될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 임의 측면에 따른 세포는 그의 야생형과 비교하였을 때, β-산화 경로에 연관되어 있는 효소의 감소된 활성을 가진다. 본원에서 사용될 때, "β-산화 경로에 연관되어 있는 효소"라는 용어는 β-산화 경로를 통한 지방산 분해의 일부로서 형성되는 지방산 또는 그의 유도체와 직접적으로 상호작용하는 효소를 지칭한다. β-산화 경로는 아세틸-CoA 및 짧아진 지방산의 CoA 에스테르로의 지방산의 전환을 수행하는 일련의 반응들을 포함한다. β-산화 경로에 연관되어 있는 효소는 지방산 또는 그의 유도체를 기질로 인식하는 것에 의해 그것을 β-산화 경로의 일부로서 형성되는 대사물로 전환시킬 수 있다. 예를 들면, 아실-CoA 데히드로게나제 (EC 1.3.99.-)는 그것이 지방산-CoA와 상호작용하여 지방산-CoA 에스테르를 β-산화의 일부로서 형성되는 대사물인 에노일-CoA로 전환시키므로, β-산화 경로에 연관되어 있는 효소이다. 또 다른 예에서, 본원에서 사용될 때, "β-산화 경로에 연관되어 있는 효소"라는 용어는 아실-CoA 데히드로게나제 (EC 1.3.99.-), 에노일-CoA 히드라타제 (EC 4.2.1.17), 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 (EC 1.1.1.35) 및 3-케토-아실-CoA 티올라제 (EC 2.3.1.16)를 포함하는 군에 속하는 임의의 폴리펩티드를 포괄한다. 아실-CoA 신테타제 (EC 6.2.1.1)는 지방산을 지방산의 CoA 에스테르, 즉 카르복시 기의 관능기 -OH가 -S-CoA로 대체됨으로써 지방산을 β-산화 경로로 도입하는 분자로 전환시키는 것을 촉매촉진할 수 있다. 예를 들어, 이. 콜리에서의 폴리펩티드 FadD 및 FadK (수탁 번호: 각각 BAA15609.1 및 NP_416216.4)는 아실-CoA 데히드로게나제이다. 일 예에서, 본원에서 사용될 때, "아실-CoA 데히드로게나제"라는 용어는 β-산화 경로의 일부로서 아실-CoA의 에노일-CoA로의 전환을 촉매촉진할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 이. 콜리에서의 폴리펩티드 FadE (수탁 번호: BAA77891.2)가 아실-CoA 데히드로게나제일 수 있다. 본원에서 사용될 때, 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제로도 지칭되는 "에노일-CoA 히드라타제"라는 용어는 β-산화 경로의 일부로서 수화 및 산화를 통하여 에노일-CoA의 3-케토아실-CoA로의 전환을 촉매촉진할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, 이. 콜리에서의 폴리펩티드 FadB 및 FadJ (수탁 번호: 각각 BAE77457.1 및 P77399.1)가 에노일-CoA 히드라타제이다. 본원에서 사용될 때, "케토아실-CoA 티올라제"라는 용어는 β-산화 경로의 최종 단계로서 3-케토아실-CoA의 절단을 촉매촉진함으로써 2개 탄소 원자만큼 짧아진 아실-CoA 및 아세틸-CoA를 생성시킬 수 있는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 이. 콜리에서의 폴리펩티드 FadA 및 FadI (수탁 번호: 각각 YP_491599.1 및 P76503.1)가 케토아실-CoA 티올라제이다.
본원에서 사용될 때, "접촉시키는 것"이라는 용어는 수용액 중에서 아미노산, 지방산 및/또는 본 발명의 임의 측면에 따른 세포 사이에 직접적인 접촉을 초래하는 것을 의미한다. 예를 들면, 세포, 아미노산 및 지방산은 무기질 막과 같은 장벽에 의해 분리된 서로 다른 구획 내에 존재하지 않을 수 있다. 아미노산 또는 지방산이 가용성이고 세포에 의해 흡수될 것 있거나 생물학적 막을 횡단하여 확산될 수 있는 경우, 그것은 단순하게 수용액 중에서 본 발명의 임의 측면에 따른 세포에 첨가될 수 있다. 그것이 불충분하게 가용성인 경우, 그것은 수용액에의 첨가 전에 적합한 유기 용매에 용해될 수 있다. 통상의 기술자라면, 적합한 유기 및/또는 극성 용매를 첨가하는 것에 의해 불충분한 용해도를 가지는 아미노산 또는 지방산의 수용액을 제조할 수 있다. 그와 같은 용매는 액체 유기 용매를 포함하는 유기 상의 형태로 제공될 수 있다. 일 예에서, 상기 유기 용매 또는 상은 25 ℃ 및 표준 대기압에서 액체인 경우 액체로 간주될 수 있다. 또 다른 예에서, 지방산은 각 메틸 또는 에틸 에스테르와 같은 지방산 에스테르의 형태로 제공될 수 있다. 또 다른 예에서, 화합물 및 촉매는 시험관 내에서, 즉 다소 농축되거나 심지어는 정제된 상태로 접촉될 수 있거나, 또는 제자리로, 다시 말하자면 그것이 세포 대사의 일부로 구성되어 차후 세포 내부에서 반응하도록 접촉될 수 있다.
"수용액" 또는 "배지"라는 용어는 물, 주로 본 발명의 임의 측면에 따른 세포를 대사적으로 활성이고/거나 생존가능한 상태로 적어도 일시적으로 유지하는 데에 사용될 수 있으며 그것이 필요한 경우 임의의 추가적인 기질들을 포함하는 용매로서의 물을 포함하는 임의의 용액을 포괄한다. 통상의 기술자라면, 보통 본 발명의 세포를 유지하는 데에 사용될 수 있는 배지로 지칭되는 수많은 수용액, 예를 들면 이. 콜리의 경우 LB 배지의 제조에 친숙하다. 원치 않는 부산물에 의한 불필요한 생성물의 오염을 피하기 위해서는, 최소 배지, 즉 복합 배지와는 달리 대사적으로 활성이고/거나 생존가능한 상태로 세포를 유지하는 데에 필수적인 최소한의 염 및 영양소 세트만을 포함하는 합리적 단순 조성의 배지를 수용액으로 사용하는 것이 유리하다. 예를 들면, M9 배지가 최소 배지로 사용될 수 있다.
본 발명의 임의 측면에 따라, 지방산은 본 발명의 임의 측면에 따른 세포를 포함하는 수용액에 첨가된다. 이와 같은 단계는 지방산을 용액과 일시적으로 접촉시키는 것뿐만 아니라, 산화 반응 및 있을 수 있는 추가적인 하류 반응들이 이루어지는 것을 가능케 하기에 충분하게 오래, 예를 들면 1, 2, 4, 5, 10 또는 20시간 이상 동안 세포의 존재하에 사실상 지방산을 인큐베이팅하는 것도 포함할 수 있다. 선택되는 온도는 본 발명의 세포가 촉매로써 적격으로, 및/또는 대사적으로 활성으로 유지되도록 하는 것, 예를 들면 10 내지 42 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃, 특히 세포가 이. 콜리 세포인 경우에는 32 내지 38 ℃이어야 한다.
일 예에서, 본 발명의 임의 측면에 따른 방법은 단계 (a) 후 또는 단계 (a)와 동시 중 어느 하나에 본 발명의 임의 측면에 따른 세포와 지방산의 혼합물에 "수-혼화성 유기 용매"를 첨가하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 통상의 기술자라면, 본 발명의 임의 측면에 따라 사용될 수 있는 수많은 수-혼화성 유기 용매들을 알고 있다. 일 예에서, 본원에서 사용될 때, "수-혼화성 유기 용매"라는 용어는 2개 이상의 탄소 원자를 포함하며 수성 액체 상의 존재하에 25 ℃에서 수성 상과 분명하게 별도인 또 다른 액체 상을 형성하는 경향을 가지는 화합물을 지칭한다. 상기 별도의 상은 연속 액체 상 또는 에멀션일 수 있다. 일 예에서, 본원에서 사용될 때, "수-혼화성"이라는 용어는 물에 가용성이 아닌 액체 화합물의 경향을 지칭한다. 또 다른 예에서, 본원에서 사용될 때, "수-혼화성"이라는 용어는 그대로의 지명된 화합물이 그의 10진 로그가 0, 0.5, 1 또는 2를 초과하는 pH-값을 가진다는 (문헌 [J Sangster, 1997]) 것을 의미한다. 수-혼화성 유기 용매의 예에는 실온에서 액체인 치환된 선형 알칸, 시클로알칸, 시클로알켄, 아릴, 지방산, 지방산 에스테르, 알콜, 헤테로시클로알칸, 헤테로시클로알켄 및 헤테로아릴을 포함하는 군에 속하는 수-혼화성 용매가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 수-혼화성 유기 용매는 1종을 초과하는 유기 용매를 포함할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용될 때, "수-혼화성 유기 용매"를 사용하여 생성물을 "추출하는 것"이라는 용어는 본 발명의 임의 측면에 따른 세포를 포함하는 수용액을 생성물이 수-혼화성 용매를 포함하는 상으로 진입하는 것을 가능케 하도록 충분하게 오래 수-혼화성 유기 용매와 접촉시킨다는 것을 의미한다. 차후에, 수-혼화성 유기 용매를 포함하는 상은 예를 들면 증류 또는 경사분리에 의해 수용액으로부터 분리될 수 있다.
일 예에서는, 수-혼화성 유기 용매가 지방산 또는 그의 에스테르일 수 있는데, 일 예에서, 상기 지방산은 화학식 CH3-(CH2)x-COORs로 표시되며, 여기서 x는 8, 9, 10, 28이고, 더욱 바람직하게는 12 또는 12 초과이며, 여기서 Rs는 H 또는 알킬이고, 후자는 메틸 또는 에틸일 수 있다. 일 예에서, 수-혼화성 유기 용매는 불포화 지방산, 탄소 사슬의 9 위치에 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 것, 또는 12개 이상의 탄소 원자를 가지는 것일 수 있다. 또 다른 예에서, 수-혼화성 유기 용매는 올레산 또는 헥산산 또는 라우르산 메틸 에스테르일 수 있다. 수-혼화성 유기 용매의 부피는 수용액으로부터 그것을 분리하는 것이 용이하도록 하는 것이다. 일 예에서, 수-혼화성 유기 용매의 부피는 수용액과 수-혼화성 유기 용매 전체 조합 부피의 2 내지 98, 5 내지 95, 10 내지 40, 또는 20 내지 30 %이다.
구체적으로, 본 발명의 임의 측면에 따른 방법의 보조인자는 NAD+/NADH일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 방법은 소비된 보조인자 NAD(P)+를 재생하기 위한 커플링된 보조인자 재생 과정을 추가적으로 포함한다. 상기 커플링된 보조인자 재생 과정 역시 소비된 소비용 글루코스, 포르메이트, 포스파인 등의 재생을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시양태, 측면 및 장점들이 드러날 수 있는 하기의 도면 및 비-제한적인 실시예로써 본 발명을 추가 예시한다.
도 1은 OleT-CamABFDH를 사용한 헵탄산의 전환으로부터 수득되는 크로마토그램이다 (연속단계. a = CO2; b = EtOH; c = 1-헥센; d = MIBK (EtOH로부터 유래). 반응 용기 헤드공간으로부터 GC-MS 크로마토그래프로 화합물을 수동 주사하였다.
도 2는 1-헥센 분석용 표준의 수동 헤드공간 GC-MS 주사 후 크로마토그램이다.
도 3은 1-헥센 (84.1 g/mol)에 해당하는 도 1에서의 피크 c에 대한 GC-MS 스펙트럼의 그래프이다.
도 4는 1-헥센 (84.1 g/mol)의 분석용 표준에 해당하는 도 2에서의 피크 c에 대한 GC-MS 스펙트럼의 그래프이다.
도 5는 OleT-CamAB-FDH 연속단계를 사용한 헵탄산의 전환으로부터의 이온 84의 이온 추출 후 수득되는 크로마토그램이다.
도 6은 추출된 이온 84의 피크 면적을 사용한 1-헥센의 수동 헤드공간 GC-MS 주사에 대한 보정 곡선이다.
도 7은 1-프로펜 및 1-부텐과 같은 휘발성 α-올레핀을 포획하기 위한 신규한 반응 설정의 도면이다. 10 ml의 20 mM Br2/DCM 용액을 함유하는 소형 임핀저를 유일한 기체 유출구로 작용하는 플라스크 상부에 위치시키고, α-올레핀 생성물을 포획하였다. 이와 같은 시스템의 기능성은 1-헵텐의 분석용 표준을 사용하여 성공적으로 확인되었다. 휘발성 α-올레핀의 유도체화 및 포획에 대한 개념은 반응식 2에 나타내었다.
도 8은 OleTCamAB-FDH 연속단계에 의한 발레르산으로부터의 1-부텐의 생성으로부터의 GC-FID 크로마토그램이다. 1 = 임핀저 용액 (DCM/Br2); 2 = OleT-CamAB-FDH 연속단계에 의한 발레르산의 24시간 전환 후 임핀저 용액의 내용물; 3 = 1,2-디브로모부탄의 분석용 표준; 4 = OleT가 없는 발레르산의 24시간 전환 후 임핀저 용액의 내용물; a = 용매 피크 (DCM); b = 1,2-디브로모부탄; c = DCM 용매로부터의 불순물.
도 9는 OleT-CamAB-FDH 연속단계에 의한 발레르산으로부터의 1-프로펜의 생성으로부터의 GC-FID 크로마토그램이다. 1 = 1,2-디브로모프로판의 분석용 표준; 2 = OleT-CamAB-FDH 연속단계에 의한 발레르산의 24시간 전환 후 임핀저 용액의 내용물; 3 = OleT-CamAB-FDH 연속단계에 의한 부티르산의 24시간 전환 후 임핀저 용액의 내용물; 4 = 임핀저 용액 (DCM/Br2); a = 용매 피크 (DCM); b = 1,2-디브로모프로판; c = 1,2-디브로모부탄; d = DCM 용매로부터의 불순물.
[ 실시예 ]
전기에 바람직한 실시양태들을 기술한 바, 통상의 기술자라면 이해하고 있을 바와 같이, 그들은 청구범위의 영역에서 벗어나지 않고도 설계, 구성 또는 작용상의 변이 또는 변형에 적용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 변이들은 청구범위의 영역에 의해 포괄되는 것으로 하고자 한다.
실시예 1
OleT의 클로닝 , 발현 및 정량
모든 화학물질은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 사로부터 구입하였다. 시금치 페레독신, 시금치 페레독신 리덕타제, 소 간 유래의 카탈라제, 리소자임, 소 심장 유래 시토크롬 c 및 글루코스 데히드로게나제 (NADPH-의존성, 시중 공급원을 밝힘)는 시그마 알드리치 사로부터 구입하였다. 포르메이트 데히드로게나제 (NADH-의존성)는 에보카탈(Evocatal) 사로부터 구입하였다. 포스파이트 데히드로게나제 (PDH) (문헌 [Dudek, H.M., 2013])는 표준 프로토콜에 따라 제조하였으며, 플라스미드는 엠. 프라아이제(M. Fraaije) (그로닝겐 소재)로부터 입수하였다.
OleT는 이. 콜리에서의 최적의 발현을 위하여 코돈-최적화된 합성 유전자로서 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사에서 주문하였다. 상기 합성 구성체를 이. 콜리 셔플(SHuffle)® T7 균주 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 사)에의 화학적 형질전환 전에, 제한/결찰 (Ndel 및 Xhol)을 통하여 N-말단 His6-태그의 pET28a 발현 벡터 하류 (pET28a-OleT)에 클로닝하였다. 집락 PCR, 제한 분석 및 서열분석에 의해 성공적인 클로닝을 확인하였다. pET28a-OleT를 함유하는 세포를 50 ㎍mL-1의 카나마이신이 보충된 용원성 브로스(lysogeny broth) (LB) 배지에서 예비-배양물로서 밤새 (140 rpm, 37 ℃) 성장시켰다. 공개되어 있는 프로토콜 (문헌 [Nazor, J, 2009])에 따라 200 mL의 테리픽 브로스(terrific broth) (TB) 배지에 2 mL의 예비-배양물을 전달하는 것에 의해, OleT의 발현을 달성하였다. OleT의 효율적인 발현은 25 ℃ 및 140 rpm 진탕으로 20시간 인큐베이션 후에 달성되었다. 원심분리에 의해 발현 배지로부터 세포를 분리하고, 펠렛을 -20 ℃에서 24시간 동안 저장하였다. 냉동된 세포 펠렛을 정제된 완충제 (KPi; 0.1 M; pH 7.0; 20　% 글리세롤, 0.3 M KCl; 50 mM 이미다졸)에 재현탁시켰다. 라이소자임을 첨가한 (1 mgmL-1) 후, 이어서 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 최종적으로 울트라 초음파처리장치를 사용한 초음파처리 (1분, 30 % 진폭)에 의해 세포를 파열시켰다. 원심분리에 의해 세포 잔사를 펠렛화하고, 0.45 ㎛ 필터를 통하여 무세포 용해물을 가압함으로써, 잔류 입자들을 제거하였다. 여과된 무세포 용해물을 UV-검출기가 구비된 바이오래드(Biorad) FPLC 펌핑 시스템에 연결된 His-Trap 컬럼에 적재하였다. 문헌 [Matsunaga et al., 2001]의 프로토콜에 따르되 최종 용리 단계에 400 mM (200 mM 대신) 이미다졸을 사용하여 OleT를 정제하였다. 보고되어 있는 투석 완충제 (KPi, 0.1 M, pH 7.0, 20 % 글리세롤)를 사용한 정제된 OleT의 투석 동안, 다량의 단백질이 침전되었다 (1 내지 2 μM OleT의 활성 단백질 농도만을 보유). 잔류 이미다졸을 제거하고 침전을 방지하기 위하여, 300 mM의 KCl을 함유하는 포스페이트 완충제 (KPi, 0.1 M, pH 7.0, 20 % 글리세롤)에 대하여 투석을 수행하였다. 단백질 용해물을 투석 배관 셀룰로스 막 (14 kDa 컷 오프, 독일 스타인하임 소재 시그마 알드리치 사) 투석 주머니에 충전하고, 4 ℃에서 연속 교반하면서 300 ml의 투석 완충제에 대하여 3회 투석하였다 (3×12시간). 투석 절차 동안 눈에 띄는 침전은 발생하지 않았으며, 일반적으로 > 10 μM의 활성 P450 농도가 수득되었다. 무세포 용해물 중 활성 P450 단백질 또는 정제된 OleT의 농도는 CO 차이 스펙트럼을 기록하는 것에 의해 측정하였다.
CamAB 시스템의 클로닝 , 발현 및 정량
보고되어 있는 플라스미드 구성체 및 이. 콜리 숙주를 사용하여 공개되어 있는 프로토콜에 따라 (문헌 [Schallmey, A., 2011]) CamA 및 CamB (CamAB)의 발현을 수행하였다.
생성물 추출, 지방산 및 히드록시산의 유도체화
100 μL의 5 N HCl 첨가에 의해 효소 반응 (1 mL 규모)을 켄칭하였다. 내부 표준으로서 0.1 % 1-데칸올을 함유하는 500 μL EtOAc를 사용하여 기질 및 생성물의 추출을 수행하였다. 무수 Na2SO4 상에서 유기 상을 건조하였다. 유기 상을 MeOH (2.5:1.5 v/v)와 혼합한 후 이어서 2 M TMSCHN2 (디에틸 에테르 중 트리메틸실릴 디아조메탄) 5 내지 15 μL를 보충하는 것에 의해, 상응하는 메틸 에스테르로의 카르복실산 (지방산 및 히드록시산)의 유도체화를 달성하였다. 상기 혼합물을 25 ℃ 및 750 rpm으로 30분 동안 인큐베이팅한 후, GC-FID 또는 GC-MS에 주사하였다. 동일한 프로토콜을 사용하되 원치 않는 휘발성 생성물 손실을 방지하기 위하여 모든 단계를 얼음상에서 수행함으로써, 단쇄 FA (C12-C9) 전환으로부터의 생성물 및 기질의 추출 및 유도체화를 수행하였다.
헤드공간 GC -MS 분석용 샘플의 제조
HP5 컬럼 (프로그램(Programm) 사)에서 C22 내지 C10 범위의 사슬 길이를 가지는 FA 기질로부터의 생성물을 분리하고, GC-FID 또는 GC-MS에 의해 검출하였다. DB1702 컬럼 (프로그램 사)에서 노난산의 전환으로부터의 추출 생성물 (생성물로는 1-옥텐)을 분리하고, GC-FID에 의해 검출하였다. 기질 및 말단 올레핀의 실제 표준을 상기한 바와 같이 처리하여, 보정 곡선의 확인 및 작성을 위한 참조로 사용하였다. 바이알 헤드공간으로부터 GC-MS로의 수동 주사에 의해 휘발성 단쇄 말단 올레핀 (1-부텐/1-프로펜 [진행중]에서 1-헵텐까지)의 검출을 수행하였는데, 생성물의 손실을 방지하기 위하여, 반응 혼합물을 함유하는 바이알은 PTFE 격막으로 밀봉하였다. 전환 후, 10 ml 주사기 (타이프(TYPE) 사)와 함께 폐쇄된 바이알을 80 ℃로 10분 동안 가열하였다. 헤드공간으로부터, 2 내지 9 μl 부피를 분할 없이 GC-MS 크로마토그래프에 주사하고, HP5 컬럼 (프로그램 사)에서 분석물을 분리하였다. 4 ℃에서 용매로 5 % DMF를 사용하여 동일한 방식으로 1-펜텐, 1-헥센 및 1-헵텐에 대한 보정 곡선을 작성하였다.
실시예 2
CamAB - OleT 산화환원 연속단계 및 산화제로서의 O 2 를 사용한 FA의 전환
최적화된 정제 프로토콜은 투석 동안의 단백질 침전 (ESI)을 회피하면서도 개선된 활성 형태 OleT의 생성을 가능케 하였다 (400 mL의 배양 브로스로부터 10-20 μM). 세균 CamAB (푸티다레독신; 클래스 I)를 전자 전달 시스템으로 사용하였다 (문헌 [Koga H., 1989] 및 [Roome P.W., 1983]) (반응식 1). 최초의 실험은 OleT가 CamAB로부터 전자를 수용함으로써 유일한 산화제로서 O2를 사용한 스테아르산의 탈카르복실화를 가능케 할 수 있는 반면, 대조 반응은 어떠한 생성물 형성으로도 이어지지 않는다는 것을 확인해 주었다 (표 1). 또한, 더 높은 전환율을 위해서는 더 낮은 CamAB 농도가 적정하다는 것이 발견되었다. 1 mM NADH의 완전 산화 후 제조자의 프로토콜에 따른 고도로 민감한 HRP/ABTS 검정 (시그마 알드리치 사)을 사용하여서도 H2O2 (O2의 환원을 통하여 형성)의 형성이 검출될 수 없었음으로 인하여, CamAB로부터 OleT로의 직접적인 전자 전달을 추가적으로 표시해주고, H2O2에 의한 OleT의 잠재적인 불활성화를 배제하였다.
<표 1>
Figure pat00002
표 1: 스테아르산 및 팔미트산의 탈카르복실화를 위한 산화제로서 O2/CamAB 또는 H2O2 중 어느 하나를 사용한 OleT의 촉매촉진 특성화.
반응 조건: 1 μM OleT, 0.05 Uml-1 CamAB, 1200 Uml-1 카탈라제, 1 mM 기질, 2.5 % EtOH, KPi 완충제 (pH 7.5, 0.1 M). 전환은 플라스틱 큐벳에서 실온으로 교반 없이 수행되었음. 산화제로서 H2O2를 사용한 반응은 OleT, 기질, 완충제 및 수소 퍼옥시드만을 함유하였음. * 강한 침전이 관찰되었음. 1 하기 성분들 중 1종이 반응으로부터 잔류되었음: OleT, H2O2, CamAB, NAD(P)H 또는 기질.
실시예 3
CamAB - OleT 산화환원 연속단계 및 NAD(P)H 재생 시스템을 사용한 FA의 전환
글루코스 데히드로게나제 (GDH)-기재 시스템의 사용은 스테아르산 및 팔미트산 양자의 유사한 전환율로써, 전환율 (1 mM 스테아르산을 사용하여 36 % 전환율) 및 TTN (10 mM 스테아르산을 사용하여 최대 389)의 실질적인 증가를 제공하였다. 24시간의 반응 시간 후, 1-헵타데센 1.16 mM (0.27 gL-1) 및 1-펜타데센 1 mM (0.21 gL-1)의 생성물 농도를 수득하였으나, 더 이상 향상될 수는 없었다. 이에 따라, GDH 및 글루코스에 의한 NAD(P)H 재생으로부터 부산물로 형성되는 글루콘산의 억제 효과를 조사하였는데, 10 mM 농도에서 이미 OleT 생산성을 상당히 감소시킨다는 (28 % 감소) 것이 발견되었다. 포스파이트 데히드로게나제 (PDH; NADPH-의존성)에 기반한 (문헌 [Dudek, H.M., 2013] 및 [Vrtis J.M., 2002]) 및 포르메이트 데히드로게나제 (FDH; NADH-의존성)-기반 (문헌 [Busto E., 2014])의 대안적인 시스템이 더 효율적인 것으로 입증되었는데: 5 mM 스테아르산으로부터 각각 2.6 mM (0.62 gL-1) 및 3.1 mM (0.75 gL-1)의 1-헵타데센이 수득됨으로써 (각각 52 % 및 62 %의 전환율), 상기 언급된 재생 시스템을 사용하는 것에 의한 지금까지 최고의 TTN 값 (각각 1739 및 2096)을 생성하였다. 이전에 공개된 전체 세포 반응 시스템에 비교하자면, 이와 같은 FDH-구동 시스템은 8시간의 반응 시간 후 α-올레핀 42.5 mgL-1h-1로써 (48시간에서의 98 mgL-1 대비) 6배 더 높은 생성물 역가 및 21배 더 높은 부피 생산성을 가능케 한다 (표 2).
<표 2>
Figure pat00003
표 2: 산화제로서 O2를 사용하는 다양한 산화환원 상대물 시스템을 사용한, OleT에 의한 스테아르산의 탈카르복실화.
반응 조건: 0.05 Uml-1 CamAB, 1200 Uml-1 카탈라제, 12 Uml-1 GDH 또는 2 Uml-1 GDH 또는 0.2 Uml-1 PDH, 100 mM D-글루코스 또는 100 mM 암모늄 포르메이트 또는 100 mM 나트륨 포스파이트, 5 mM 스테아르산, 2.5 % EtOH, KPi 완충제 (pH 7.5, 0.1 M) 및 200 μM NAD(P)H. 반응은 실온에서 1 ml 규모로, 그리고 170 rpm 진탕으로 폐쇄된 유리 바이알에서 24시간 동안 수행되었음. a Fdr/Fdx는 이. 콜리에 자연적으로 존재하는 것으로써, NAD(P)H로부터 OleT로의 전자의 전달을 가능케 함. b 반응은 OleT를 발현하는 세포의 냉동-건조된 용해물 53 mg을 함유하였음.
실시예 4
FDH - CamAB - OleT 산화환원-연속단계를 사용한 지방산 (FA)의 탈카르복실화
FA 사슬 길이를 C3으로부터 C22까지 변화시키는 것에 의해, OleT의 기질 범위를 추가적으로 조사하였다. RT에서의 표준 설정 이외에, 고도로 휘발성인 단쇄 α-올레핀의 손실을 방지하기 위하여 4 ℃에서도 반응을 조사하였는데, 놀랍게도 높은 활성 수준으로 이어졌다 (표 3). C11에서 아래로 C4까지의 전체 범위를 포괄함으로써, 처음으로 짧은 FA가 상응하는 올레핀으로 탈카르복실화될 수 있었다. 흥미롭게도, 단쇄 FA (< C10)의 전환은 반응 튜브로부터 방출되는 강한 '가솔린 냄새'에 의해 인식되었다. 단쇄 올레핀의 고도의 휘발성으로 인하여, 4 ℃에서 생성물 후처리를 수행하였다. 수율은 반응 온도 및 기질 사슬 길이에 강하게 의존하였는데, C18 미만 RT에서 주요 반응성 강하와 동시에 (5 mM 스테아르산으로부터의 최대 생성물 농도 2.45 mM), 4 ℃에서는 C12가 최고 기질로 나타났다 (5 mM 라우르산으로부터 2.53 mM의 생성물). 단쇄 FA (C8-C5)를 사용한 반응으로부터의 GC-MS에 의한 헤드-공간 분석은 OleT를 사용한 1-헵텐, 1-헥센 및 1-펜텐 및 1-부텐에의 최초의 생물공학적 접근을 가능케 하는 각 α-올레핀들의 형성을 확인해 주었다.
<표 3>
Figure pat00004
표 3: FDH-CamAB-OleT 산화환원-연속단계를 사용한 FA의 탈카르복실화
반응 조건: 기질 C22-C14의 전환은 3 μM OleT를 사용하여, 기질 C12-C3에 대해서는 6 μM OleT를 사용하여 수행되었음. 모든 반응 혼합물은 0.05 Uml-1 CamAB, 1200 Uml-1 카탈라제, 2 Uml-1 FDH, 100 mM 암모늄 포르메이트, 5 % EtOH, 10 mM 기질, KPi 완충제 (pH 7.5, 0.1 M) 및 200 μM NADH를 함유하였음. 기질 C8, C7 및 C6의 전환은 공동용매로서의 5 % DMSO 존재하에 수행되었음. 단쇄 말단 올레핀의 검출 및 정량은 수동 헤드공간 GC-MS 주사를 사용하여 달성되었음. 모든 전환은 폐쇄된 유리 바이알 내에서 1 ml 규모 및 170 rpm 진탕으로 (RT 샘플/24시간) 또는 교반하면서 (4 ℃ 샘플/72 시간) 수행되었음. * C18/GC-면적만을 사용한 전환율에 대비. n.i. = 조사되지 않음.
실시예 5
OleT에 의해 헵탄산으로부터 생성되는 1- 헥센의 확인 및 정량
OleTCamAB-FDH 반응 연속단계를 사용하여 실시예 4에 기술되어 있는 바와 같이 헵탄산의 전환을 수행하였다. 헵탄산의 탈카르복실화는 도 1에 나타낸 바와 같이 신뢰성 있게 진행되었다. 1-헥센의 분석용 표준을 사용하여 표적 생성물의 형성을 확인하였다. 분석용 표준은 동일한 체류 시간 (2.617분; 도 1 및 2, 피크 c)으로 용리하였는데, OleT에 의해 형성된 반응 생성물 (도 3 및 4)과 동일한 m/z 패턴을 나타내었다. 이에 따라 0.05 내지 2 mM 범위에서 1-헥센에 대한 보정 곡선을 작성하였다. 1-헥센의 CO2 및 EtOH 피크 면적과의 강한 중복으로 인하여 (도 1, 피크 a, b 및 c), 신뢰성 있는 보정 곡선을 생성시키는 GC-MS의 이온 추출 모드를 사용하였다. 1-헥센에 대해서는 도 5에 나타낸 바와 같은 정량용의 특징적인 이온 84를 사용하였다. CO2 또는 EtOH 중 어느 것도 생성물 피크 면적을 방해하지 않았다. 이는 수동 헤드공간 GC-MS 주사를 사용하여 1-헥센의 신뢰성 있는 선형 정량 (도 6)을 가능케 하는 도 1과 5를 비교하면 알 수 있다. GC-MS로의 수동 헤드공간 주사는 C11 내지 C6의 사슬 길이를 가지는 모든 기질에서 성공적으로 수행되었다. 수득된 생성물 농도는 표 3에 요약하였다. 헵탄산 10 mM의 전환은 반응 조건의 추가적인 최적화 없이도 1-헥센 1.3 mM까지의 신뢰성 있는 형성을 가능케 하였다.
실시예 6
1- 부텐 및 1- 프로펜의 포획, 유도체화 및 정량
수동 헤드공간 GC-MS 주사를 사용하여, 1-프로펜 및 1-부텐의 생성이 최초로 확인되었다. 분석용 표준을 사용한 1-프로펜 및 1-부텐의 정량이 실현가능하지 않았기 때문에, 생물촉매촉진 반응으로부터 유래하는 고도로 휘발성인 단쇄 α-올레핀을 위한 신규한 포획/유도체화 시스템을 설계하였다. 이에 따라, 확립되어 있는 반응 설계 (표 3의 반응 조건 참조)의 규모를 10 ml (25 ml 2-목 플라스크 사용)로 상향시키고, 도 7에 나타낸 바와 같은 설정으로 부티르산 (C4) 및 발레르산 (C5)의 탈카르복실화를 수행하였다.
<반응식 2>
Figure pat00005
반응식 2: OleT-CamAB-FDH 연속단계에 의한 부티르산의 탈카르복실화 후 이어지는 최종 반응 생성물로 1,2-디브로모프로판을 생성시키는 임핀저(impinger) 내에서의 Br2를 사용한 휘발성 1-프로펜의 유도체화.
1,2-디브로모부탄 및 1,2-디브로모프로판의 분석용 표준을 사용한 GC-FID 및 GC-MS에 의해 수득된 생성물을 분석하였다. (눈에 보이는) 기체 배기 (OleT 및 FDH에 의한 CO2 생성) 및 DCM의 강한 증발 (24시간 후 ~70 % 부피 손실)로 인하여, 임핀저 내의 잔류 부피를 측정함으로써, 신뢰성 있는 생성물 정량을 가능케 하였다. 1,2-디브로모부탄 및 1,2-디브로모프로판에 대한 보정 곡선을 작성함으로써, 생성된 1-프로펜 및 1-부텐의 정량을 가능케 하였다 (미도시).
또한, 1,2-디브로모부탄을 함유하는 용액을 무수 기류에 의해 700 μl로 농축하고, OleT에 의한 1-부텐 형성의 추가적인 증거로 작용하는 1H-NMR에 의해 분석하였다. 마찬가지로, 1,2-디브로모프로판을 함유하는 용액을 무수 기류에 의해 700 μl로 농축하고, OleT에 의한 프로펜 형성의 추가적인 증거로 작용하는 1H-NMR에 의해 분석하였다. 1,2-디-브로모부탄의 분석용 표준은 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.23 - 4.09 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 10.2, 4.4 Hz, 1H), 3.66 (t, J = 10.1 Hz, 1H), 2.22 (dqd, J = 14.6, 7.3, 3.3 Hz, 1H), 1.97 - 1.74 (m, 1H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3H)이었다.
사용된 1,2-디브로모프로판의 분석용 표준은 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.34 - 4.20 (m, 1H), 3.87 (dt, J = 10.1, 5.0 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 10.1 Hz, 1H), 1.85 (d, J = 6.6 Hz, 3H)이었다.
전체 연속단계가 반응 용기 내에서 재-구성되는 경우에만 1-프로펜 및 1-부텐의 생성을 확인하기 위하여 대조 반응 (OleT가 없는 CamAB-FDH 연속단계)을 수행하였다 (도 8 및 9). 1,2-디브로모부탄 및 1,2-디브로모프로판의 형성 역시 GC-MS에 의해 확인하였다 (미도시). 신규한 포획 전략을 사용함으로써, 1-프로펜 및 1-부텐 양자를 확인 및 정량하는 것이 가능하였다. 발레르산 10 mM의 전환은 1-부텐 834 μM의 형성으로 이어진 반면, 부티르산 10 mM의 전환에서는 504 μM의 1-프로펜이 측정되었다. 모든 반응은 3반복 이상으로 수행하였으며, 상응하는 α-올레핀은 임핀저 용액에서 검출되는 반응 생성물 뿐이었다.
[참고문헌]
Figure pat00006
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Industries AG <120> ALKENE PRODUCTION <130> 201400351 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 422 <212> PRT <213> Micrococcus candicans ATCC 8456 <400> 1 Met Ala Thr Leu Lys Arg Asp Lys Gly Leu Asp Asn Thr Leu Lys Val 1 5 10 15 Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Tyr Thr Thr Asn Gln Arg Asn Arg Leu Asn 20 25 30 Thr Ser Val Phe Gln Thr Lys Ala Leu Gly Gly Lys Pro Phe Val Val 35 40 45 Val Thr Gly Lys Glu Gly Ala Glu Met Phe Tyr Asn Asn Asp Val Val 50 55 60 Gln Arg Glu Gly Met Leu Pro Lys Arg Ile Val Asn Thr Leu Phe Gly 65 70 75 80 Lys Gly Ala Ile His Thr Val Asp Gly Lys Lys His Val Asp Arg Lys 85 90 95 Ala Leu Phe Met Ser Leu Met Thr Glu Gly Asn Leu Asn Tyr Val Arg 100 105 110 Glu Leu Thr Arg Thr Leu Trp His Ala Asn Thr Gln Arg Met Glu Ser 115 120 125 Met Asp Glu Val Asn Ile Tyr Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Thr Lys 130 135 140 Val Gly Thr Arg Trp Ala Gly Val Gln Ala Pro Pro Glu Asp Ile Glu 145 150 155 160 Arg Ile Ala Thr Asp Met Asp Ile Met Ile Asp Ser Phe Arg Ala Leu 165 170 175 Gly Gly Ala Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Ser Lys Glu Ala Arg Arg Arg 180 185 190 Val Glu Asp Trp Leu Glu Glu Gln Ile Ile Glu Thr Arg Lys Gly Asn 195 200 205 Ile His Pro Pro Glu Gly Thr Ala Leu Tyr Glu Phe Ala His Trp Glu 210 215 220 Asp Tyr Leu Gly Asn Pro Met Asp Ser Arg Thr Cys Ala Ile Asp Leu 225 230 235 240 Met Asn Thr Phe Arg Pro Leu Ile Ala Ile Asn Arg Phe Val Ser Phe 245 250 255 Gly Leu His Ala Met Asn Glu Asn Pro Ile Thr Arg Glu Lys Ile Lys 260 265 270 Ser Glu Pro Asp Tyr Ala Tyr Lys Phe Ala Gln Glu Val Arg Arg Tyr 275 280 285 Tyr Pro Phe Val Pro Phe Leu Pro Gly Lys Ala Lys Val Asp Ile Asp 290 295 300 Phe Gln Gly Val Thr Ile Pro Ala Gly Val Gly Leu Ala Leu Asp Val 305 310 315 320 Tyr Gly Thr Thr His Asp Glu Ser Leu Trp Asp Asp Pro Asn Glu Phe 325 330 335 Arg Pro Glu Arg Phe Glu Thr Trp Asp Gly Ser Pro Phe Asp Leu Ile 340 345 350 Pro Gln Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Thr Asn His Arg Cys Ala Gly Glu 355 360 365 Trp Ile Thr Val Ile Ile Met Glu Glu Thr Met Lys Tyr Phe Ala Glu 370 375 380 Lys Ile Thr Tyr Asp Val Pro Glu Gln Asp Leu Glu Val Asp Leu Asn 385 390 395 400 Ser Ile Pro Gly Tyr Val Lys Ser Gly Phe Val Ile Lys Asn Val Arg 405 410 415 Glu Val Val Asp Arg Thr 420 <210> 2 <211> 422 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 2 Met Asn Ala Asn Asp Asn Val Val Ile Val Gly Thr Gly Leu Ala Gly 1 5 10 15 Val Glu Val Ala Phe Gly Leu Arg Ala Ser Gly Trp Glu Gly Asn Ile 20 25 30 Arg Leu Val Gly Asp Ala Thr Val Ile Pro His His Leu Pro Pro Leu 35 40 45 Ser Lys Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Ala Thr Ala Glu Ser Leu Tyr Leu 50 55 60 Arg Thr Pro Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Asn Ile Gln Leu Leu Gly Gly 65 70 75 80 Thr Gln Val Thr Ala Ile Asn Arg Asp Arg Gln Gln Val Ile Leu Ser 85 90 95 Asp Gly Arg Ala Leu Asp Tyr Asp Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Gly 100 105 110 Arg Pro Arg Pro Leu Pro Val Ala Ser Gly Ala Val Gly Lys Ala Asn 115 120 125 Asn Phe Arg Tyr Leu Arg Thr Leu Glu Asp Ala Glu Cys Ile Arg Arg 130 135 140 Gln Leu Ile Ala Asp Asn Arg Leu Val Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile 145 150 155 160 Gly Leu Glu Val Ala Ala Thr Ala Ile Lys Ala Asn Met His Val Thr 165 170 175 Leu Leu Asp Thr Ala Ala Arg Val Leu Glu Arg Val Thr Ala Pro Pro 180 185 190 Val Ser Ala Phe Tyr Glu His Leu His Arg Glu Ala Gly Val Asp Ile 195 200 205 Arg Thr Gly Thr Gln Val Cys Gly Phe Glu Met Ser Thr Asp Gln Gln 210 215 220 Lys Val Thr Ala Val Leu Cys Glu Asp Gly Thr Arg Leu Pro Ala Asp 225 230 235 240 Leu Val Ile Ala Gly Ile Gly Leu Ile Pro Asn Cys Glu Leu Ala Ser 245 250 255 Ala Ala Gly Leu Gln Val Asp Asn Gly Ile Val Ile Asn Glu His Met 260 265 270 Gln Thr Ser Asp Pro Leu Ile Met Ala Val Gly Asp Cys Ala Arg Phe 275 280 285 His Ser Gln Leu Tyr Asp Arg Trp Val Arg Ile Glu Ser Val Pro Asn 290 295 300 Ala Leu Glu Gln Ala Arg Lys Ile Ala Ala Ile Leu Cys Gly Lys Val 305 310 315 320 Pro Arg Asp Glu Ala Ala Pro Trp Phe Trp Ser Asp Gln Tyr Glu Ile 325 330 335 Gly Leu Lys Met Val Gly Leu Ser Glu Gly Tyr Asp Arg Ile Ile Val 340 345 350 Arg Gly Ser Leu Ala Gln Pro Asp Phe Ser Val Phe Tyr Leu Gln Gly 355 360 365 Asp Arg Val Leu Ala Val Asp Thr Val Asn Arg Pro Val Glu Phe Asn 370 375 380 Gln Ser Lys Gln Ile Ile Thr Asp Arg Leu Pro Val Glu Pro Asn Leu 385 390 395 400 Leu Gly Asp Glu Ser Val Pro Leu Lys Glu Ile Ile Ala Ala Ala Lys 405 410 415 Ala Glu Leu Ser Ser Ala 420 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 3 Met Ser Lys Val Val Tyr Val Ser His Asp Gly Thr Arg Arg Glu Leu 1 5 10 15 Asp Val Ala Asp Gly Val Ser Leu Met Gln Ala Ala Val Ser Asn Gly 20 25 30 Ile Tyr Asp Ile Val Gly Asp Cys Gly Gly Ser Ala Ser Cys Ala Thr 35 40 45 Cys His Val Tyr Val Asn Glu Ala Phe Thr Asp Lys Val Pro Ala Ala 50 55 60 Asn Glu Arg Glu Ile Gly Met Leu Glu Cys Val Thr Ala Glu Leu Lys 65 70 75 80 Pro Asn Ser Arg Leu Cys Cys Gln Ile Ile Met Thr Pro Glu Leu Asp 85 90 95 Gly Ile Val Val Asp Val Pro Asp Arg Gln Trp 100 105

Claims (12)

1종 이상의 단쇄 지방산으로부터 1종 이상의 말단 알켄을 생성시킬 수 있으며, 하기를 포함하도록 유전적으로 변형되어 있고, 여기서 상기 단쇄 지방산은 C4-C10 지방산인 미생물 세포:
- 야생형 세포에 비해 CYP152 퍼옥시게나제 계열에서 선택되는 효소 (E1)의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제1 유전자 돌연변이, 및
- 야생형 세포에 비해 1종 이상의 NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (E2) 및 상응하는 매개체 단백질의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제2 유전자 돌연변이.
제1항에 있어서, E1이 CYPSPα (E1a), CYPBSB (E1b) 및 OleT (E1c)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, E1이 OleT (E1c)이며, 서열 1과 60 % 이상의 서열 동일성을 포함하는 것인 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, NAD(P)+ 옥시도리덕타제 (E2) 및 상응하는 매개체 단백질이 하기:
(a) 페레독신 리덕타제 (E2a) 및 페레독신; 또는
(b) 푸티다레독신 리덕타제 (E2b) 및 푸티다레독신
인 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, E2가 서열 2와 60 %의 서열 동일성을 포함하며, 매개체 단백질이 서열 3과 60 %의 서열 동일성을 포함하는 것인 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 세포에 비해 NAD(P)H 재생을 할 수 있는 1종 이상의 효소 (E3)의 발현을 증가시키는 하나 이상의 제3 유전자 돌연변이를 추가적으로 포함하는 세포.
제6항에 있어서, 효소 (E3)가 글루코스 데히드로게나제, 포스파이트 데히드로게나제 및 포르메이트 데히드로게나제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 세포에 비해 감소된 지방산 분해 능력을 추가적으로 포함하는 세포.
제8항에 있어서, 지방산 분해 능력이 지방산 임포터, 지방산-CoA 리가제, 아실-CoA 데히드로게나제, 2,4-디에노일-CoA 리덕타제, 에노일-CoA 히드라타제 및 3-케토아실-CoA 티올라제로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 감소되는 것인 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 원핵 또는 저급 진핵 세포인 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물 세포를 단쇄 지방산을 포함하는 배지와 접촉시키는 것
을 포함하는, 1종 이상의 단쇄 지방산으로부터 1종 이상의 말단 알켄을 제조하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 세포의, 1종 이상 말단 알켄의 제조를 위한 용도.
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