CN105925518A - 烯烃生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及烯烃生产，提供了能够从至少一种短链脂肪酸生产至少一种末端烯烃的微生物细胞，其中所述细胞经过遗传修饰以包含- 至少第一个基因突变，其与野生型细胞相比增加选自CYP152过加氧酶家族的酶(E1)的表达，和- 至少第二个基因突变，其与野生型细胞相比增加至少一种NAD(P)+ 氧化还原酶(E2)和对应的调节蛋白的表达，其中所述短链脂肪酸是C4-C10脂肪酸。

Description

烯烃生产
技术领域
本发明涉及能够从至少一种脂肪酸生产至少一种烯烃的细胞和/或生物技术方法。具体地，所述烯烃是从短链脂肪酸生产的至少一种末端烯烃。
背景技术
已经研究了多种方法来将生物质转化成可以用作石油的可持续替代物的有价值的化学化合物。石油（化学结构单元和运输燃料的主要来源）正在被连续地消耗，并且价格总是波动。因此，需要找到替代能源。一种这样的能源是烯烃。
例如，短链和中链α-烯烃不仅充当生物燃料，而且充当聚合物结构单元。具体地，烯烃可以广泛地用于制备润滑剂、聚合物和去污剂。
脂肪酸是用于生产烯烃的优选起始原料，因为它们含有处于低氧化态的碳。脂肪酸还经常可以从天然资源（诸如脂肪）以低价格大量得到。
在从脂肪酸生产烯烃中所用的现行方法在性质上是化学的，其中α-烯烃从饱和无分支脂肪酸(≥C11)形成。这些方法经常需要昂贵的和/或有毒的基于金属的催化剂和高温(>130℃)。
在2011年，Rude等人报道了采用P450单加氧酶OleT将无分支饱和长链C18-和C16-脂肪酸(硬脂酸和棕榈酸)首先直接酶促脱羧成α-烯烃。该催化剂使用H2O2作为氧化剂经由它的过氧化物旁路起作用，这会回避对天然氧化还原配偶体的需求。Belcher, J., 等人,2014然后公开了OleT的晶体结构，并且将底物范围扩大至C12-脂肪酸(月桂酸)。但是，H2O2作为氧化剂的用途具有几个安全性担忧，不仅破坏它可能存在于其中的机理，而且是不稳定的。向反应混合物中不断地添加H2O2的需要也会增加反应的成本，并且是不方便的。因此，可利用的生物技术方法是无效率的，并且不能以低成本生产高收率。因此，本领域中需要改进的从可再生资源生产烯烃的生物技术方法。
发明内容
根据本发明的任何方面的细胞通过提供从短链脂肪酸生产烯烃的生物技术方式解决了上述问题。具体地，根据本发明的任何方面的细胞提供了通过至少具有C4-C10的链长度的短链无分支饱和脂肪酸的氧化脱羧而生物催化合成末端烯烃的新酶级联，其中所述细胞不需要H2O2。所述新酶级联包括脱羧反应，其是H2O2-非依赖性的，且可以被至少一种P450单加氧酶催化。具体地，所述细胞表达酶，例如OleT，其可以能够优化生物催化系统以使用脱羧反应从短链脂肪酸生产至少一种烯烃。
在本发明的一个方面，提供了能够从至少一种短链脂肪酸生产至少一种末端烯烃的微生物细胞，其中所述细胞经过基因修饰以包含
- 至少第一个基因突变，其与野生型细胞相比增加选自CYP152过加氧酶（peroxygenase）家族的酶(E1)的表达，和
- 至少第二个基因突变，其与野生型细胞相比增加至少一种NAD(P)+ 氧化还原酶(E2)和对应的调节蛋白的表达，
其中所述短链脂肪酸是C4-C10脂肪酸。
与经常用于生产烯烃的常见化学催化路线不同，根据本发明的任何方面的方法可以使用全细胞或分离的酶。这允许在温和反应条件下进行所述方法，由此实现具有最小废物排放的可持续方法。这是一个意外的结果，因为现有技术(Fujishiro T., 2007和Matsunaga I., 2002)报道称，P450还原酶系统（诸如铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶）不支持P450BSβ和P450SPα的活性。
此外，根据本发明的任何方面的细胞允许从用作底物的短链脂肪酸大规模生产烯烃。这可以在实例中看到，在所述实例中，使用10mM的底物浓度来生产对应的烯烃。这是一个意外的结果，因为目前可得到的烯烃生产方法表明了最大1mM的底物（诸如硬脂酸）转化成各种烯烃。
根据本发明的另一个方面，提供了从至少一种短链脂肪酸生产至少一种末端烯烃的方法。
根据本发明的任何方面的方法具有其它优点，诸如它使用O2作为氧化剂，其使得该方法比本领域已知的使用H2O2作为氧化剂的方法更有效；该方法允许从可再生资源进行电子转移，并且根据本发明的任何方面的方法也导致显著高的烯烃产量。
根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的任何方面的细胞用于生产至少一种末端烯烃的用途。
根据本发明的任何方面的细胞可以直接地使用游离脂肪酸替代脂肪酸硫代酸酯作为底物，其对于代谢工程而言可能是有利的，因为脂肪酸可以是更丰富的。此外，在已经通常用作微生物细胞工厂的细胞（例如，大肠杆菌（E. coli））中可以更容易地操纵它们的丰度和组成。
因而，具有P450脂肪酸脱羧机制的根据本发明的任何方面的细胞可以保持经工程改造成生物末端烯烃生产系统的巨大潜力。此外，根据本发明的任何方面的细胞会为脱羧反应提供优化的生物催化系统(>100 mg L-1)，并将底物范围延伸至短链脂肪酸。
末端烯烃也可以被称作末端烯属烃，其表示在碳链的末端含有至少一个碳-碳双键的不饱和烃。该C-C双键可以是在烃链的开始(α)处或末端(γ)处。最简单的无环烯烃（仅具有一个双键且不具有其它官能团）可以具有通式CnH2n。在另一个实例中，末端烯烃也可以包含其它官能团。根据本发明的任何方面的末端烯烃可以包含与底物短链脂肪酸相同数目的碳原子作为碳原子的数目。例如，如果底物是丁酸，形成的末端烯烃可以是丙烯。类似地，如果底物是戊酸（valeric acid/ pentanoic acid），形成的末端烯烃可以是丁烯；如果底物是己酸（caproic acid/ hexanoic acid），形成的末端烯烃可以是戊烯；如果底物是庚酸（enanthic acid/ heptanoic acid），形成的末端烯烃可以是己烯；如果底物是辛酸（caprylic acid/ octanoic acid），形成的末端烯烃可以是庚烯；如果底物是壬酸（pelargonic acid/ nonanoic acid），形成的末端烯烃可以是辛烯；如果底物是癸酸（capric acid/ decanoic acid），形成的末端烯烃可以是壬烯等。在一个实例中，使用在实例中所示的新方法，可以测量从各种脂肪酸产生的烯烃诸如丙烯和/或1-丁烯。
在本发明中使用的术语“短链脂肪酸’表示具有小于10个碳的脂族尾巴的脂肪酸的亚组。所述脂肪酸可以是饱和的、不饱和的、支链或无支链脂肪酸。具体地，根据本发明的任何方面使用的短链脂肪酸可以选自：丙酸、丁酸（butyric acid/ butanoic acid）、戊酸（valeric acid/ pentanoic acid）、己酸（caproic acid/ hexanoic acid）、庚酸（enanthic acid/ heptanoic acid）、辛酸（caprylic acid/ octanoic acid）、壬酸（pelargonic acid/ nonanoic acid）、癸酸（capric acid/ decanoic acid）等。更具体地，根据本发明的任何方面使用的短链脂肪酸可以是C2-C22脂肪酸。甚至更具体地，所述脂肪酸可以是C4- C10脂肪酸。在一个实例中，所述脂肪酸可以选自：乙酸、丙酸、异丁酸(2-甲基丙酸)、丁酸、异戊酸(3-甲基丁酸)、戊酸(戊酸)等。
根据本发明的任何方面的细胞可以表示宽范围的微生物细胞。具体地，所述细胞可以是选自以下的原核或低等真核细胞：假单胞菌属（Pseudomonas）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）和埃希氏菌属（Escherichia）。在一个实例中，所述细胞可以是大肠杆菌（Escherichia coli）。在另一个实例中，所述细胞可以是低等真核生物，诸如来自酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）和子囊菌酵母属（Yarrowia）的真菌，特别是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。所述细胞可以是分离的细胞，换而言之，单个菌株的纯培养物，或可以包含至少两个菌株的混合物。生物技术上有关的细胞是商购可得的，例如得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)或德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)。用于保存和改变细胞的颗粒可得自现有技术，例如Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989)。
本文中结合细胞或微生物使用的短语“野生型”可以表示这样的细胞：其具有呈在野外天然地发现的形式的基因组构成。该术语可以应用于全细胞和单个基因两者。术语“野生型”因此不包括这样的细胞或这样的基因，其中人们已经使用重组方法至少部分地改变了基因序列。
根据本发明的任何方面使用的任何酶可以是分离的酶。具体地，根据本发明的任何方面使用的酶可以以活性状态并在有它的活性所必需的所有辅因子、底物、辅助性的和/或活化性的多肽或因子存在下使用。本文中使用的术语“分离的”是指，与它在其中天然地存在的细胞相比，富集目标酶。所述酶可以通过SDS聚丙烯酰胺电泳和/或活性测定来富集。例如，目标酶可以占存在于制品中的所有多肽的超过5%、10%、20%、50%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，如在用考马斯蓝染料染色以后目检聚丙烯酰胺凝胶所判断的。
根据本发明的任何方面使用的细胞和/或酶可以是重组体。本文中使用的术语“重组体”表示一种分子或由这样的分子编码，特别是多肽或核酸，其因而不会天然地存在，而是基因工程的结果，或表示包含重组分子的细胞。例如，如果核酸分子包含这样的启动子，则核酸分子是重组的：所述启动子在功能上与编码催化活性多肽的序列连接，且所述启动子已经经过工程改造，使得所述催化活性多肽与包含原始的未改变的核酸分子的对应野生型细胞中的多肽水平相比过表达。
根据本发明的任何方面使用的核酸分子、多肽（更具体地，酶）是否是重组体不一定暗示它的表达水平。但是，在一个实例中，根据本发明的任何方面使用的一种或多种重组核酸分子、多肽或酶可以过表达。本文中使用的术语“过表达”是指，编码或表达的各种多肽的表达水平或活性高于在没有用于增加表达的基因修饰存在下在相同条件下在所述细胞中（例如在各种野生型细胞中）通常存在的。本领域技术人员熟知众多实现过表达的方式。例如，要过表达的核酸分子或编码要过表达的多肽或酶的核酸分子可以置于强诱导型启动子（诸如lac启动子）的控制下。现有技术描述了可以用于该目的的标准质粒，例如以pET-3a为代表的pET载体系统(可商购得自Novagen)。通过定量PCR反应（在核酸分子的情况下）、SDS聚丙烯酰胺电泳、蛋白质印迹法或比较活性测定（在多肽的情况下），可以确定核酸或多肽是否被过表达。基因修饰可以指向在选择的和/或鉴别的培养条件下导致酶活性和/或选择性的变化的转录修饰、翻译修饰和/或翻译后修饰。因而，在本发明的不同实例中，为了更有效地发挥功能，微生物可以包含一个或多个基因缺失。基因缺失可以通过突变性基因缺失方案来完成，和/或开始于具有减少的这些酶中的一种或多种的表达或不表达的突变株，和/或本领域技术人员已知的其它方法。
根据本发明的任何方面使用的选自CYP152过加氧酶家族的酶(E1)可以是细胞色素P450酶(CYP)的超家族的组成部分(Malca等人, 2011)。通常，P450酶采用一个或多个氧化还原配偶体蛋白将两个电子从NAD(P)H转移至血红素铁反应中心用于双氧活化，然后将O2的一个原子插入它们的底物。在CYP152过加氧酶家族内的酶已经被鉴别为排它地使用H2O2作为唯一电子和氧供体。但是，在根据本发明的任何方面的细胞中，NAD(P)+ 氧化还原酶(E2)和对应的调节蛋白可以用作电子和氧供体的来源。这是有利的，因为在低成本末端烯烃的大规模生产中，大量过氧化物的应用是成本禁止性的，并且高H2O2浓度可以快速地灭活生物催化剂。因此，NAD(P)+ 氧化还原酶(E2)和对应的调节蛋白作为电子来源的应用会提供末端烯烃的更有成本效益的微生物生产。这可以在Liu等人, 2014中进一步解释。
具体地，酶E1可以选自：CYPSPα(E1a)、CYPBSB (E1b) (EC 1.11.2.4)和OleT (E1c)。更具体地，酶E1可以是OleT (E1c)或其变体。在一个实例中，酶E1可以包含ADW41779.1的序列。在一个实例中，酶E1与SEQ ID NO:1可以具有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、100%序列同一性。
技术人员能够鉴别可以用于实现从至少一种脂肪酸形成至少一种末端烯烃的方法的OleT的可能序列。在一个实例中，技术人员可以使用Liu等人, 2014、Rude M.A, 2011、Schallmey, A., 2011、Fukada H., 1994、Belcher J., 2014等中的公开内容来确定OleT(E1c)的结构和将OleT (E1c)引入合适细胞中并确定所述酶在所述细胞中的表达的方式。OleT (与其它H2O2依赖性的酶反应相比)可以导致更高收率的人工电子转移系统。
根据本发明的任何方面的细胞可以包含第二个基因突变，其与野生型细胞相比增加至少一种酶、NAD(P)+ 氧化还原酶(E2)和对应的调节蛋白的表达。这些酶属于氧化调节蛋白并接受两个电子的氧化还原酶家族。具体地，NAD(P)+ 氧化还原酶使用铁-硫蛋白作为电子供体并使用NAD+或NADP+ 作为电子受体。Hannemann等人公开了可以用作根据本发明的任何方面的酶E2的氧化还原-介质的不同类别的列表。在一个实例中，人工/”化学”氧化还原介质可以将电子从还原酶或电子来源转移至血红素铁簇。
更具体地，NAD(P)+ 氧化还原酶(EC 1.18.1.5)和对应的蛋白可以选自：
(a)铁氧还蛋白还原酶(E2a)和铁氧还蛋白；或者
(b)假单孢氧还蛋白还原酶(E2b)和假单孢氧还蛋白(Schallmey, A., 2011)。
具体地，E2可以是CamA，且调节蛋白可以是CamB。E2可以与SEQ ID: NO:2具有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、100%序列同一性，和/或调节蛋白可以与SEQID: NO:3具有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、100%序列同一性。
在一个实例中，在根据本发明的任何方面的细胞中，E2可以是铁氧还蛋白还原酶(E2a)，其中铁氧还蛋白也可以存在，且E2a可以能够在功能上与E1相互作用。具体地，E1和E2的来源可以相同或不同。在一个实例中，E1和E2可以来自相同来源，例如来自泊库岛食烷菌（Alcanivorax borkumensis） SK2 (登录号YP_691921)。在该实例中，E2a和铁氧还蛋白可以分别具有登录号YP_691923和YP_691920。
在另一个实例中，在根据本发明的任何方面的细胞中，E2可以是假单孢氧还蛋白还原酶(E2b)，其中假单孢氧还蛋白也可以存在，且E2b可以能够在功能上与E1相互作用。在一个实例中，E2b可以来自得自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的P450cam酶系统。对于假单孢氧还蛋白还原酶，采用的酶的量通常可以是约100-10,000 ca、1000-5000 ca、2000-4000 ca或特别是3000 ca。该ca是假单孢氧还蛋白还原酶在介导铁氰化物对NADH的氧化中的活性的单位，并且定义为每mg还原酶每分钟氧化的1 μmol的NADH。
E2是已经纯化或分离的重组蛋白或天然存在的蛋白。E2可以已经经过突变以改善它的性能，诸如以优化它进行电子转移的速度或它的底物特异性。采用的还原酶的量取决于测量对象的确切性质和测定的特定细节，但是通常，所述还原酶将以0-1000 μM、0.001-100 μM、0.01-50 μM、0.1-25 μM和特别是1-10 μM的浓度存在。
根据本发明的任何方面的细胞进一步包含至少第三个基因突变，其与野生型细胞相比增加至少一种能够再生辅因子的酶(E3)的表达。具体地，E3可以能够再生NAD(P)H。E3可以是可以能够再生NAD(P)H的任何酶。具体地，E3可以是使用NAD(P)作为电子受体的脱氢酶/氧化还原酶(EC 1.1.1.X)。更具体地，E3可以是在2014年2月24日在Brenda数据库中具有KEGG号EC 1.1.1.X的任何酶。例如，E3可以选自：醇脱氢酶、甘油磷酸脱氢酶、组氨醇脱氢酶、莽草酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、3-羟基芳基-CoA脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、马肝醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、氨基酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、20-β-羟基类固醇脱氢酶和甲醛脱氢酶。甚至更具体地，酶(E3)可以选自：葡萄糖脱氢酶(E3a) (EC 1.1.99.10)、亚磷酸脱氢酶(E3b) (EC 1.20.1.1)和甲酸脱氢酶(E3c) (EC1.2.1.43)，其中葡萄糖、亚磷酸盐和甲酸盐分别用作还原剂。酶(E3)的存在允许辅因子再生，这使得从脂肪酸生产烯烃的方法是自持续的。因此不必将外部能量引入生产烯烃的系统中。因此，根据本发明的任何方面的细胞可以能够在有至少酶E1、E2和/或E3存在下无需任何外部能源从脂肪酸产生至少一种烯烃。
在一个实例中，葡萄糖脱氢酶（E3a）可以是NADP+-特异性的葡萄糖脱氢酶。充当葡萄糖脱氢酶（E3a）的来源的生物不受限制，且可以是微生物或高等生物，并且微生物诸如细菌、真菌和酵母是合适的。例如，芽孢杆菌属（Bacillus）的微生物、特别是巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）可以是来源。在另一个实例中，所述来源可以是属于隐球菌属（Cryptococcus）、葡糖杆菌属（Gluconobacter）或酵母属（Saccharomyces）的微生物。具体地，可以选择属于隐球菌属的微生物，更具体地，所述微生物可以选自：白色隐球菌（Cryptococcus albidus）、土生隐球菌（Cryptococcus humicolus）、地生隐球菌（Cryptococus terreus）和指甲隐球菌（Cryptococcus uniguttulatus）。
在另一个实例中，酶E3可以是亚磷酸脱氢酶(E3b)或甲酸脱氢酶(E3c)。充当亚磷酸脱氢酶(E3b)或甲酸脱氢酶(E3c)的来源的生物可以不受限制，且可以是微生物或高等生物，并且微生物诸如细菌、真菌和酵母是合适的。
在一个实例中，根据本发明的任何方面的细胞与酶E1c、E2a和E3a的野生型细胞相比具有增加的表达。在另一个实例中，根据本发明的任何方面的细胞与以下酶的野生型细胞相比具有增加的表达：E1c、E2a和E3b；E1c、E2a和E3c；E1c、E2b和E3a；E1c、E2b和E3b；或E1c、E2b和E3c。
本发明的教导不仅可以使用具有在本申请中明确地（例如通过名称或登录号）或暗示地提及的确切氨基酸或核酸序列的生物大分子实现，而且可以使用这样的序列的变体实现。本文中使用的术语“变体”包含与参照氨基酸或核酸序列分别具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98或99%同一性的氨基酸或核酸序列，其中优选地除了功能（例如蛋白的催化活性）或分子的折叠或结构必需的那些氨基酸以外的氨基酸被缺失、置换或被插入替换，或必需氨基酸以保守的方式被替换以达到参照序列或从其衍生出的分子的生物活性被保留的效果。现有技术包括可以用于比对两个给出的核酸或氨基酸序列和计算同一性程度的算法，参见Arthur Lesk (2008), Thompson等人, 1994,和Katoh等人,2005。术语“变体”与术语“同系物”同义地和可互换地使用。这样的变体可以如下制备：在氨基酸或核酸序列以及包含这样的大分子或其变体的融合体中引入缺失、插入或置换。在一个实例中，关于氨基酸序列，术语“变体”除了包含以上序列同一性以外，还包含与各个参照或野生型序列相比包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列，或包含编码含有一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列的核酸序列。在一个实例中，氨基酸序列或核酸序列的术语“变体”除了包含以上序列同一性程度以外，还包含所述氨基酸序列或核酸序列各自的任意活性部分和/或片段，或编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的任意核酸序列。本文中使用的术语“活性部分”表示这样的氨基酸序列或核酸序列：其分别小于全长氨基酸序列或编码小于全长氨基酸序列，其中所述氨基酸序列或所述编码的氨基酸序列分别保留它的基本生物活性的至少一些。例如蛋白酶的活性部分和/或片段可以能够水解多肽中的肽键。本文中使用的短语“保留它的基本生物活性的至少一些”是指，目标氨基酸序列具有超过和不同于背景活性的生物活性和表征所述活性的动力学参数，更具体地kcat和KM优选地是在参照分子相对于特定底物表现出的值的3、2或1个数量级内。类似地，术语核酸的“变体”包含这样的核酸，其互补链优选地在严谨条件下与参照或野生型核酸杂交。技术人员能够容易地确定酶E1、E2和/或E3，所述酶将能够根据本发明的任何方面从脂肪酸制备烯烃。
在有H2O2存在下和没有H2O2存在下(即在有酶E2存在下和替代调节蛋白)在根据本发明的任何方面的细胞中发生的反应的差异的图解显示在化学反应路线1中。具体地，在化学反应路线1 (A)中，显示了将饱和脂肪酸脱羧为末端烯烃的酶促氧化还原-级联。显示了电子从氢化物供体(例如葡萄糖、甲酸盐或亚磷酸盐)经由CamAB转移至OleT，所述OleT以大气O2为代价催化脂肪酸氧化脱羧为具有在C3-C21范围内的链长度的末端烯烃。检测到的副产物显示在括号中。在化学反应路线1 (B)中，显示了在有H2O2存在下的相同反应。
化学反应路线1：OleT对无分支饱和脂肪酸的氧化脱羧。
杂交反应的严谨性由本领域普通技术人员容易地确定，且通常是依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的温度才能适当对合，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当存在于低于它们的熔化温度的环境中时变性的DNA与互补链重新对合的能力。探针和可杂交的序列之间的期望同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。所以，接下来较高的相对温度将倾向于使反应条件更严谨，而较低的温度使反应条件不太严谨。关于杂交反应的额外细节和严谨性的解释，参见F. M.Ausubel (1995)。本领域技术人员可以遵循在手册“The DIG System Users Guide forFilter Hybridization”, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993和在Liebl等人, 1991（关于如何借助于杂交来鉴别DNA序列）中给出的指导。在一个实例中，将严谨条件应用于任何杂交，即仅当探针与靶序列具有70%或更多同一性时发生杂交。与靶序列具有较低同一性程度的探针可以杂交，但是这样的杂交体是不稳定的，且将在严谨条件下在洗涤步骤中除去，例如通过将盐浓度降低至2 x SSC，或者，任选地和随后，降低至0,5x SSC，而温度以递增优先顺序为大约50℃- 68℃、大约52℃- 68℃、大约54℃- 68℃、大约56℃- 68℃、大约58℃- 68℃、大约60℃- 68℃、大约62℃- 68℃、大约64℃- 68℃、大约66℃- 68℃。在一个特别优选的实施方案中，温度是大约64℃- 68℃或大约66℃- 68℃。可能将盐浓度调至0.2 x SSC或甚至0.1 x SSC。可以分离与参照或野生型序列具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性程度的多核苷酸片段。本文中使用的术语核酸序列的“同系物”表示，按照遗传密码的简并性，编码与参照核酸序列相同的氨基酸序列的任何核酸序列。
技术人员将能够容易地测量酶E1、E2和E3中的每一种的活性。例如，为了确定细胞中的E1的表达是否增加，技术人员可以使用在Liu等人, 2014,Rude M.A, 2011、Schallmey, A., 2011等中公开的测定。例如，为了确定细胞中的E2的表达是否增加，技术人员可以使用在Scheps, D, 2011、Roome等人, Schallmey等人等中公开的测定。使用至少在Cartel等人中公开的测定，可以测量细胞中的E3的表达，无论它是增加还是下降，在所述测定中将甲酸脱氢酶活性测定(经由NAD(P)+ 还原)确定为在340 nm的吸光度的变化。技术人员将容易地能够鉴别本领域中的其它众所周知的方法，所述方法可以用于测量在本发明的细胞中使用的酶的表达。
根据本发明的任何方面的细胞与野生型细胞相比可以具有降低的通过β-氧化降解脂肪酸的能力。具体地，与野生型细胞相比降低的脂肪酸降解活性可以是与野生型细胞相比选自以下的至少一种酶的减少表达的结果：酰基辅酶A脱氢酶(FadE) (E6) (EC:1.3.99.-)、烯酰辅酶A水合酶(FadB) (E7) (EC 4.2.1.17)、(R)-3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(FadB) (E8) (EC 1.1.1.35)和3-酮脂酰基辅酶A硫解酶(FadA) (E9) (EC:2.3.1.16)。
本文中使用的术语“具有降低的脂肪酸降解能力”是指，各个细胞降解脂肪酸（特别是从环境吸收的那些）的速度低于具有正常脂肪酸降解能力的可比较细胞或野生型细胞在相同条件下的速度。在一个实例中，因为至少一个编码在β-氧化途径中涉及的酶的基因的缺失、抑制或灭活，这样的细胞的脂肪酸降解较低。在一个实例中，与各种野生型微生物中的相同酶在可比较条件下的活性相比，至少一种在β-氧化途径中涉及的酶以递增优先顺序已经丧失5%、10%、20%、40%、50%、75%、90%或99%活性。本领域技术人员可能熟知可以用于缺失编码酶的基因或降低细胞中这样的酶的活性的各种技术，例如通过将细胞暴露于放射性、随后积累或筛选得到的突变体，点突变的定位引入，或编码活性酶的染色体整合基因的敲除，如在Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989)中所述。另外，可以过表达转录抑制子FadR达到在β-氧化途径中涉及的酶的表达被抑制的效果(Fujita, Y., 等人, 2007)。本文中使用的短语“基因的缺失”是指，编码所述基因的核酸序列经过修饰，使得由所述基因编码的活性多肽的表达减少。例如，可以如下缺失基因：在框架内除去包含编码多肽的催化活性中心的序列的序列的一部分。可选地，可以改变核糖体结合位点，使得核糖体不再翻译对应的RNA。使用如在酶学教科书（例如Cornish-Bowden, 1995）中所述的标准测定测量由活细胞表达的酶的活性，属于本领域技术人员的常规技能。
脂肪酸的降解通过一系列酶促催化反应来实现。首先，脂肪酸通过运输/酰基-活化机制而被吸收和跨细胞膜转移，所述机制包括至少一种外膜蛋白和一种内膜结合的具有脂肪酸辅酶A连接酶活性的蛋白，在大肠杆菌的情况下分别被称作FadL和FadD/FadK。在细胞内，要降解的脂肪酸遭受催化β-氧化途径的其它反应的酶。第一个细胞内步骤涉及酰基辅酶A通过酰基辅酶A脱氢酶转化成烯酰辅酶A，后者在大肠杆菌的情况下被称作FadE。可以如在现有技术中所述测定酰基辅酶A脱氢酶的活性，例如通过分光光度计法在340 nm在100mM MOPS（pH 7.4）、0.2 mM烯酰辅酶A、0.4 mM NAD+中监测NADH的浓度。得到的烯酰辅酶A通过烯酰辅酶A水合酶/(R)-3-羟基酰基辅酶A脱氢酶（在大肠杆菌中被称作FadB和FadJ）催化的水合和氧化经由3-羟基酰基辅酶A转化成3-酮酰基辅酶A。可以如在现有技术中所述（例如如关于FadE所述）通过分光光度计法测定烯酰辅酶A水合酶/3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性，更具体地产物NADH的形成。最后，大肠杆菌中的3-酮脂酰基辅酶A硫解酶FadA和FadI催化3-酮酰基辅酶A的裂解，以产生乙酰辅酶A和缩短了2个碳原子的输入酰基辅酶A。可以如在现有技术中（例如在Antonenkov, V., 等人, 1997中）所述测定酮脂酰基辅酶A硫解酶的活性。
本文中使用的短语“具有降低的脂肪酸降解能力的细胞”表示具有降低的吸收和/或降解脂肪酸（特别是具有至少8碳链的那些）的能力的细胞。可以以不同的方式降低细胞的脂肪酸降解能力。具体地，根据本发明的任何方面的细胞与其野生型相比具有降低的在β-氧化途径中涉及的酶的活性。本文中使用的术语“在β-氧化途径中涉及的酶”表示这样的酶：其与通过β-氧化途径作为脂肪酸降解的一部分而形成的脂肪酸或其衍生物直接地相互作用。β-氧化途径包含一系列实现脂肪酸转化为乙酰辅酶A和缩短的脂肪酸的辅酶A酯的反应。在β-氧化途径中涉及的酶通过将脂肪酸或其衍生物识别为底物，可以将它转化为作为β-氧化途径的一部分而形成的代谢物。例如，酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.-)是在β-氧化途径中涉及的酶，因为它与脂肪酸辅酶A相互作用并将脂肪酸辅酶A酯转化成烯酰辅酶A，后者是作为β-氧化的一部分而形成的代谢物。在另一个实例中，本文中使用的术语“在β-氧化途径中涉及的酶”包含选自以下的任意多肽：酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.-)、烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶EC 1.1.1.35)和3-酮-酰基辅酶A硫解酶(EC 2.3.1.16)。酰基辅酶A合成酶(EC 6.2.1.1)可以催化脂肪酸转化为脂肪酸的辅酶A酯，即这样的分子，其中羧基的官能团–OH被-S-CoA替换，并将所述脂肪酸引入β-氧化途径。例如，大肠杆菌中的多肽FadD和FadK (登录号分别是: BAA15609.1和NP_416216.4)是酰基辅酶A脱氢酶。在一个实例中，本文中使用的术语“酰基辅酶A脱氢酶”可以是能够催化酰基辅酶A转化成烯酰辅酶A（作为β-氧化途径的一部分）的多肽。例如，大肠杆菌中的多肽FadE(登录号: BAA77891.2)可以是酰基辅酶A脱氢酶。本文中使用的术语“烯酰辅酶A水合酶”也被称作3-羟基酰基辅酶A脱氢酶，表示能够催化烯酰辅酶A转化成3-酮酰基辅酶A（通过水合和氧化，作为β-氧化途径的一部分）的多肽。例如，大肠杆菌中的多肽FadB和FadJ (登录号分别是: BAE77457.1和P77399.1)是烯酰辅酶A水合酶。本文中使用的术语“酮脂酰基辅酶A硫解酶”可以表示这样的多肽：其能够催化3-酮酰基辅酶A的裂解，从而产生缩短了2个碳原子的酰基辅酶A和乙酰辅酶A，作为β-氧化途径的最终步骤。例如，大肠杆菌中的多肽FadA和FadI (登录号分别是: YP_491599.1和P76503.1)是酮脂酰基辅酶A硫解酶。
本文中使用的术语“接触”是指在水溶液中实现根据本发明的任何方面的氨基酸、脂肪酸和/或细胞之间的直接接触。例如，细胞、氨基酸和脂肪酸可以不在被屏障（诸如无机膜）隔开的不同隔室中。如果氨基酸或脂肪酸是可溶性的且可以被细胞吸收或可以跨生物膜扩散，可以将它简单地加给水溶液中的根据本发明的任何方面的细胞。在它的可溶性不足的情况下，可以将它在加入水溶液中之前溶解在合适的有机溶剂中。本领域技术人员通过加入合适的有机溶剂和/或极性溶剂能够制备具有不足可溶性的氨基酸或脂肪酸的水溶液。这样的溶剂可以以包含液体有机溶剂的有机相的形式提供。在一个实例中，当在25℃和标准大气压为液体时，有机溶剂或相可以视作液体。在另一个实例中，脂肪酸可以以脂肪酸酯（诸如各种甲酯或乙酯）的形式提供。在另一个实例中，可以在体外使化合物和催化剂接触，即以大致上富集的或甚至纯化的状态，或可以在原位接触，即它们作为细胞代谢的一部分而产生，并随后在细胞内反应。
术语“水溶液”或“培养基”包含任何含水的溶液（主要是水）作为溶剂，所述溶剂可以用于至少暂时地将根据本发明的任何方面的细胞维持在有代谢活性的和/或可存活的状态，且包含（如果这是必要的话）任何额外的底物。本领域技术人员熟知众多水溶液的制备，所述水溶液经常被称作可以用于维持本发明细胞的培养基，例如就大肠杆菌而言的LB培养基。有利的是使用基本培养基作为水溶液，所述基本培养基即适当简化组成的培养基，其与复合培养基相比仅包含将细胞维持在有代谢活性的和/或可存活的状态所必不可少的盐和营养物的最小集合，以避免不希望的副产物对产物的不必要污染。例如，M9培养基可以用作基本培养基。
根据本发明的任何方面，将脂肪酸加入包含根据本发明的任何方面的细胞的水溶液中。该步骤可以不仅包括使脂肪酸与所述溶液暂时接触，而且事实上在有所述细胞存在下温育脂肪酸足以允许氧化反应和可能的其它下游反应发生的时间，例如至少1、2、4、5、10或20小时。选择的温度必须使得本发明的细胞保持催化活性和/或代谢活性，例如10-42℃，优选30-40℃，具体地，在所述细胞是大肠杆菌细胞的情况下，32-38℃。
在一个实例中，根据本发明的任何方面的方法可以包括在步骤(a)之后或与步骤(a)同时地将“水不可混溶的有机溶剂”加入根据本发明的任何方面的细胞和脂肪酸的混合物中的另一个步骤。本领域技术人员知晓根据本发明的任何方面可以使用的众多水不可混溶的有机溶剂。在一个实例中，本文中使用的术语“水不可混溶的有机溶剂”表示这样的化合物：其包含至少2个碳原子且具有在有水性液相存在下在25℃形成与所述水相明显分离的另一个液相的趋势。分离的相可以是连续液相或乳状液。在一个实例中，本文中使用的术语“水不可混溶的”表示液体化合物不可溶于水的趋势。在另一个实例中，本文中使用的术语“水不可混溶的”是指，如此命名的化合物具有特定pH-值(J Sangster, 1997)，所述pH-值的十进对数超过0、0.5、1或2。水不可混溶的有机溶剂的例子包括、但不限于选自以下的水不可混溶的溶剂：在室温为液体的取代的和直链的烷烃，环烷烃，环烯烃，芳基化合物，脂肪酸，脂肪酸酯，醇，杂环烷烃，杂环烯烃和杂芳基化合物。水不可混溶的有机溶剂可以包含超过一种有机溶剂。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语使用“水不可混溶的有机溶剂”“萃取”产物是指，使包含根据本发明的任何方面的细胞的水溶液与水不可混溶的有机溶剂接触足够长以允许所述产物进入包含水不可混溶的溶剂的相中。随后，可以使包含水不可混溶的有机溶剂的相与水溶液分离，例如通过蒸馏或通过倾析。
在一个实例中，水不可混溶的有机溶剂可以是脂肪酸或其酯，在一个实例中，所述脂肪酸由式CH3 - (CH2)x–COORs表示，其中x是8、9、10、28，且更优选地是12或超过12，且其中Rs是H或烷基，所述烷基可以是甲基或乙基。在一个实例中，水不可混溶的有机溶剂可以是不饱和脂肪酸，其在碳链的位置9处具有碳-碳双键的脂肪酸，或具有12个或更多碳原子。在另一个实例中，水不可混溶的有机溶剂可以是油酸或己酸或月桂酸甲酯。水不可混溶的有机溶剂的体积使得它与水溶液直接分离。在一个实例中，水不可混溶的有机溶剂的体积是水溶液和水不可混溶的有机溶剂的组合总体积的2-98%、5-95%、10-40%或20-30%。
具体地，根据本发明的任何方面的方法的辅因子可以是NAD+/NADH。更具体地，所述方法进一步包括用于再生消耗的辅因子NAD(P)+的偶联辅因子再生方法。所述偶联辅因子再生方法也包括消耗的牺牲的葡萄糖、甲酸盐、膦等的再生。
附图说明
以下附图和非限制性实例进一步解释了本发明，从以下附图和非限制性实例可以明白本发明的其它实施方案、方面和优点。
图1是得自OleT-CamABFDH对庚酸的转化的色谱图(级联. a = CO2; b = EtOH; c= 1-己烯; d = MIBK (衍生自EtOH)。将化合物从反应容器顶空手工地注射进GC-MS色谱仪中。
图2是手工顶空GC-MS注射1-己烯的分析标准品以后的色谱图。
图3是与1-己烯(84.1 g/mol)对应的图1中的峰c的GC-MS波谱的图。
图4是与1-己烯的分析标准品(84.1 g/mol)对应的图2中的峰c的GC-MS波谱的图。
图5是来自OleT-CamAB-FDH级联对庚酸的转化的离子84的离子提取以后得到的色谱图。
图6是使用提取的离子84的峰面积关于1-己烯的手工顶空GC-MS注射的校正曲线。
图7是用于捕集挥发性的α-烯烃（诸如1-丙烯和1-丁烯）的新反应方案的图。将含有10 ml 20 mM Br2/DCM溶液的小尘埃测定器放在烧瓶的顶部充当唯一气体出口和捕集α-烯烃产物。使用1-庚烯的分析标准品成功地证实了该系统的功能性。在路线图2中显示了挥发性α-烯烃的衍生化和捕集的概念。
图8是通过OleTCamAB-FDH级联从戊酸生产1-丁烯的GC-FID色谱图。1 = 尘埃测定器溶液(DCM/Br2)；2 = 用OleT-CamAB-FDH级联转化戊酸24 h以后尘埃测定器溶液的内容物。3 = 1,2-二溴丁烷的分析标准品；4 =在没有OleT下戊酸转化24 h以后尘埃测定器溶液的内容物。a = 溶剂峰(DCM)；b = 1,2-二溴丁烷; c = 来自DCM溶剂的杂质。
图9是通过OleT-CamAB-FDH级联从戊酸生产1-丙烯的GC-FID色谱图。1 = 1,2-二溴丙烷的分析标准品；2 =用OleT-CamAB-FDH级联转化戊酸24 h以后尘埃测定器溶液的内容物。3 =用OleT-CamAB-FDH级联转化丁酸24 h以后尘埃测定器溶液的内容物；4 =尘埃测定器溶液(DCM/Br2)；a = 溶剂峰(DCM)；b = 1,2-二溴丙烷; c = 1,2-二溴丁烷; d = 来自DCM溶剂的杂质。
实施例
前面描述了优选的实施方案，其如本领域技术人员将理解的，可以进行设计、构造或运行方面的变化或修改，而不脱离权利要求的范围。例如，这些变化意图被权利要求的范围涵盖。
实施例1
OleT的克隆、表达和定量
所有化学物质得自Sigma Aldrich。菠菜铁氧还蛋白、菠菜铁氧还蛋白还原酶、得自牛肝的过氧化氢酶、溶菌酶、得自牛心脏的细胞色素c和葡萄糖脱氢酶(NADPH依赖性的，澄清商业来源)得自Sigma Aldrich。甲酸脱氢酶(NADH依赖性的)得自Evocatal。根据标准方案制备亚磷酸脱氢酶(PDH) (Dudek, H.M., 2013)，质粒得自M. Fraaije (Groningen)。
从Life Technologies订购OleT，作为为了在大肠杆菌中的最佳表达经过密码子优化的合成基因。将合成的构建体通过限制/连接(NdeI和XhoI)克隆进pET28a表达载体在N-端His6-标签下游(pET28a-OleT)，然后化学转化进大肠杆菌SHuffle®T7菌株(NewEngland Biolabs)。通过菌落PCR、限制性分析和测序，验证成功的克隆。将含有pET28a-OleT的细胞在补充了50µg mL-1卡那霉素的溶源性肉汤(LB)培养基中培养过夜(140 rpm,37℃)作为预培养物。根据公开的方案(Nazor, J, 2009)，通过将2 mL预培养物转移进200mL极好肉汤（terrific broth）(TB)培养基中，实现OleT的表达。在25℃和140 rpm摇动下温育20 h后，实现OleT的有效表达。将细胞通过离心与表达培养基分离，并将沉淀物在-20℃储存24 h。将冷冻的细胞沉淀物再悬浮于纯化缓冲液(KPi; 0.1 M; pH 7.0; 20%甘油,0.3 M KCl; 50 mM咪唑)中。加入溶菌酶(1 mg mL-1)，随后在37℃温育1 h。最后使用超声破碎器通过声处理(1 min, 30%振幅)破碎细胞。通过离心使细胞碎片沉淀，并将无细胞的裂解物压过0.45µm过滤器以除去残余的颗粒。将过滤的无细胞的裂解物加载到与具有紫外检测器的Biorad FPLC泵送系统连接的His-Trap柱上。根据Matsunaga等人, 2001的方案纯化OleT，但是使用400 mM (而不是200 mM)咪唑用于最终的洗脱步骤。在用报道的透析缓冲液(KPi, 0.1 M, pH 7.0, 20%甘油)透析纯化的OleT的过程中，大量蛋白形成沉淀(仅1-2µMOleT的活性蛋白浓度得到保留)。为了除去残余的咪唑和预防沉淀，在含有300 mM KCl的磷酸盐缓冲液(KPi, 0.1 M, pH 7.0, 20%甘油)中进行透析。将蛋白裂解物装入透析管纤维素膜(14 kDa截止值, Sigma Aldrich, Steinheim, 德国)透析袋中，并在300 ml透析缓冲液中在4℃和连续搅拌下透析3次(3 x 12 h)。在透析操作过程中没有发生肉眼可见的沉淀，并且通常得到>10µM的活性P450浓度。通过记录CO差异波谱，确定无细胞的裂解物或纯化的OleT中的活性P450蛋白的浓度。
CamAB系统的克隆、表达和定量
根据公开的采用报道的质粒构建体和大肠杆菌宿主的方案(Schallmey, A., 2011)，进行CamA和CamB (CamAB)的表达。
产物提取、脂肪酸和羟酸的衍生化
通过加入100µL 5 N HCl，淬灭酶反应(1 mL规模)。用500µL含有0.1%1-癸醇的EtOAc作为内部标准品，执行底物和产物的萃取。将有机相经无水Na2SO4干燥。通过将有机相与MeOH(2.5:1.5 v/v)混合，随后补充5-15µL 2 M TMSCHN2 (三甲基甲硅烷基重氮甲烷在乙醚中的溶液)，实现羧酸(脂肪酸和羟酸)向对应的甲酯的衍生化。将混合物在25℃和750 rpm温育30 min，然后注射进GC-FID或GC-MS中。使用相同方案，执行来自短链FA (C12-C9)的转化的产物和底物的萃取和衍生化，但是所有步骤都在冰上进行以防止不希望的挥发性产物的损失。
用于顶空GC-MS分析的样品的制备
将得自具有C22至C10范围的链长度的FA底物的产物在HP5柱(Programm)上分离，并通过GC-FID或GC-MS进行检测。将萃取的来自壬酸的转化的产物(1-辛烯作为产物)在DB1702柱(Programm)上分离，并通过GC-FID进行检测。如上所述处理底物和末端烯烃的真正标准品，并用作参比物用于鉴别和制备校正曲线。通过从小瓶顶空手工注射进GC-MS中，完成挥发性的短链末端烯烃(1-丁烯/1-丙烯[进行中]至1-庚烯)的检测，为了防止产物的损失，将含有反应混合物的小瓶用PTFE隔膜密封。转化以后，将封闭的小瓶与10 ml注射器(TYPE)一起在80℃加热10 min。从顶空将2-9µl体积无分流地注射进GC-MS色谱仪中，并在HP5柱(Programm)上分离分析物。以相同的方式在4℃并使用5%DMF作为共溶剂，制备1-戊烯、1-己烯和1-庚烯的校正曲线。
实施例2
用CamAB-OleT氧化还原级联和作为氧化剂的O2转化FA
一个经优化的纯化方案允许改善活性形式的OleT的生产(来自400 mL培养液的10-20µM)，从而避免在透析(ESI)过程中的蛋白沉淀。使用细菌CamAB (假单孢氧还蛋白；I类)作为电子转移系统(Koga H., 1989和Roome P.W., 1983) (化学反应路线1)。初步实验证实，OleT可以接受来自CamAB的电子，从而允许用O2作为唯一氧化剂将硬脂酸脱羧，而对照反应不会导致任何产物形成(表1)。此外，发现较低的CamAB浓度对于较高的转化而言是最适的。在1 mM NADH的完全氧化以后根据生产商的方案使用高灵敏的HRP/ABTS测定(SigmaAldrich)可以检测到没有形成H2O2 (经由O2的还原而形成)，进一步指示从CamAB至OleT的直接电子转移，并排除H2O2对OleT的潜在灭活。
表1: 使用O2/CamAB或H2O2作为氧化剂用于硬脂酸和棕榈酸的脱羧时OleT的催化表征.
反应条件: 1µM OleT, 0.05 U ml-1 CamAB, 1200 U ml-1过氧化氢酶, 1 mM底物,2.5%EtOH, KPi缓冲液(pH 7.5, 0.1 M)。在塑料比色皿中在室温和没有搅拌下进行转化。与作为氧化剂的H2O2的反应仅含有OleT、底物、缓冲液和过氧化氢。
*观察到强沉淀。
1下述组分之一被排除在反应物之外：OleT、H2O2、CamAB、NAD(P)H或底物。
实施例3
用CamAB-OleT氧化还原级联和NAD(P)H再生系统转化FA
基于葡萄糖脱氢酶(GDH)的系统的应用会提供转化率(对于1mM硬脂酸为36%转化率)和TTN (对于10 mM硬脂酸多达389)的大幅增加，硬脂酸和棕榈酸具有可比较的转化率。24 h反应时间以后，得到1.16 mM (0.27 g L-1) 1-十七碳烯和1 mM (0.21 g L-1) 1-十五碳烯的产物浓度，但是不可进一步增加。因此研究了作为GDH和葡萄糖实现的NAD(P)H再生的副产物而形成的葡糖酸的抑制作用，并已经发现10 mM的浓度会显著降低OleT生产力(28%下降)。基于亚磷酸脱氢酶(PDH; NADPH依赖性的) (Dudek, H.M., 2013和Vrtis J.M.,2002)和基于甲酸脱氢酶(FDH; NADH依赖性的) (Busto E., 2014)的替代系统被证实是更有效的：从5 mM硬脂酸分别得到2.6 mM (0.62 g L-1)和3.1 mM (0.75 g L-1) 1-十七碳烯(分别是52%和62%转化率)，从而使用上述再生系统产生到目前为止最高的TTN值(分别是1739和2096)。与以前公开的全细胞反应系统相比，该FDH驱动的系统允许在8 h反应时间以后对于42.5 mg L-1 h-1的α-烯烃而言高6倍的产物滴度和高21倍的体积生产力(相对于在48 h中的98 mg L-1) (表2)。
表2: 使用O2作为氧化剂采用不同氧化还原配偶体系统时OleT对硬脂酸的脱羧.
反应条件: 0.05 U ml-1 CamAB, 1200 U ml-1过氧化氢酶, 12 U ml-1 GDH或2 U ml-1GDH或0.2 U ml-1 PDH, 100 mM D-葡萄糖或100 mM甲酸铵或100 mM亚磷酸钠, 5 mM硬脂酸, 2.5%EtOH, KPi缓冲液(pH 7.5, 0.1 M)和200µM NAD(P)H。在封闭的玻璃小瓶中在1ml规模在室温和170 rpm摇动下进行反应24 h。
aFdr/Fdx天然地存在于大肠杆菌中，并允许电子从NAD(P)H转移至OleT。
b反应物含有53 mg表达OleT的细胞的冷冻干燥的裂解物。
实施例4
采用FDH-CamAB-OleT氧化还原-级联对脂肪酸(FA)的脱羧.
通过将FA链长度从C3变为C22，进一步研究了OleT的底物范围。除了在室温的标准方案以外，还在4℃研究了该反应以防止高挥发性的短链α-烯烃的损失，这会导致令人惊讶地高的活性水平(表3)。首次可以将短FA脱羧为对应的烯烃，覆盖从C11低至C4的整个范围。令人感兴趣的是，从反应试管释放的强烈“汽油味”会识别短链FA (<C10)的转化。由于短链烯烃的高挥发度，在4℃进行产物后处理。收率强烈地依赖于反应温度和底物链长度，在C18以下在室温反应性显著下降(来自5 mM硬脂酸的最大产物浓度2.45 mM)，而C12似乎是在4℃的最佳底物(来自5 mM月桂酸的2.53 mM产物)。通过GC-MS对来自短链FA (C8-C5)的反应物的顶空分析证实了各种α-烯烃的形成，从而允许第一次通过生物技术用OleT获得1-庚烯、1-己烯和1-戊烯和1-丁烯。
表3: 采用FDH-CamAB-OleT氧化还原-级联将FA脱羧.
反应条件：使用3 μM OleT、6 μM OleT（对于底物C12-C3）执行底物C22-C14的转化。所有反应混合物含有0.05 U ml-1 CamAB、1200 U ml-1过氧化氢酶、2 U ml-1 FDH、100 mM甲酸铵、5%EtOH、10 mM底物、KPi缓冲液(pH7.5, 0.1 M)和200 μM NADH。在有作为共溶剂的5%DMSO存在下进行底物C8、C7和C6的转化。使用手工顶空GC-MS注射，实现短链末端烯烃的检测和定量。在封闭的玻璃小瓶(RT样品/24 h)或搅拌(4℃样品/72 h)下在1 ml规模和170rpm摇动下进行所有转化。
*相对于C18的转化率/仅GC-面积.
n. i. =未研究。
实施例5
OleT从庚酸生产的1-己烯的鉴别和定量
使用OleTCamAB-FDH反应级联如在实施例4中所述进行庚酸的转化。如在图1中所示可靠地进行庚酸的脱羧。
使用1-己烯的分析标准品证实靶产物的形成。分析标准品在相同保留时间洗脱(2.617 min；图1和2, 峰c)并表现出与OleT形成的反应产物相同的m/z模式(图3和4)。
相应地在0.05-2 mM范围内制备1-己烯的校正曲线。由于1-己烯与CO2和EtOH的峰面积的强重叠(图1，峰a、b和c)，使用GC-MS的离子提取模式产生可靠的校正曲线。对于1-己烯，使用如在图5中所示的特征性离子84用于定量。CO2和EtOH都没有干扰产物峰面积。这可以通过对比图1和5看到，其允许使用手工顶空GC-MS注射进行1-己烯的可靠和线性定量(图6)。
对于具有C11至C6的链长度的所有底物，成功地执行向GC-MS中的手工顶空注射。得到的产物浓度总结在表3中。10 mM庚酸的转化允许不经反应条件的进一步优化可靠地形成至多1.3 mM 1-己烯。
实施例6
1-丁烯和1-丙烯的捕集、衍生化和定量
最初使用手工顶空GC-MS注射证实1-丙烯和1-丁烯的产生。由于使用分析标准品对1-丙烯和1-丁烯的定量不是可行的，设计了从生物催化反应衍生出的高挥发性的短链α-烯烃的新捕集/衍生化系统。因而，将建立的反应装置(参见表3中的反应条件)放大至10 ml (使用25 ml双颈烧瓶)，并在如图7所示的装置中执行丁酸(C4)和戊酸(C5)的脱羧。
化学反应路线2: 通过OleT-CamAB-FDH级联将丁酸脱羧，随后在尘埃测定器中用Br2将挥发性的1-丙烯衍生化以产生1,2-二溴丙烷作为最终的反应产物。
使用1,2-二溴丁烷和1,2-二溴丙烷的分析标准品，通过GC-FID和GC-MS分析得到的产物。由于(肉眼可见的)气体排出(OleT和FDH产生CO2)和强烈的DCM蒸发(24 h以后损失约70%体积)，确定在尘埃测定器中的残余体积以允许可靠的产物定量。制备1,2-二溴丁烷和1,2-二溴丙烷的校正曲线以允许定量产生的1-丙烯和1-丁烯(未显示)。
进一步，将含有1,2-二溴丁烷的溶液通过干燥空气流浓缩至700µl，并通过1H-NMR进行分析(图11)，其充当OleT形成1-丁烯的另一个证据。类似地，将含有1,2-二溴丙烷的溶液通过干燥空气流浓缩至700µl，并通过1H-NMR进行分析(图16)，其充当OleT形成丙烯的另一个证据。
1,2-二溴丁烷的分析标准品是1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.23 - 4.09 (m,1H), 3.87 (dd, J = 10.2, 4.4 Hz, 1H), 3.66 (t, J = 10.1 Hz, 1H), 2.22 (dqd, J= 14.6, 7.3, 3.3 Hz, 1H), 1.97 - 1.74 (m, 1H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
使用的1,2-二溴丙烷的分析标准品是1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.34 - 4.20(m, 1H), 3.87 (dt, J = 10.1, 5.0 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 10.1 Hz, 1H), 1.85 (d,J = 6.6 Hz, 3H)。
执行对照反应(没有OleT的CamAB-FDH级联)以证实仅当在反应容器中重构完整级联时1-丙烯和1-丁烯的产生(图8和9)。还通过GC-MS证实了1,2-二溴丁烷和1,2-二溴丙烷的形成(未显示)。对于新颖的捕集策略，可能鉴别和定量1-丙烯和1-丁烯。10 mM戊酸的转化导致834 μM 1-丁烯的形成，而对于10 mM丁酸的转化，确定了504 μM 1-丙烯。至少一式三份地执行所有反应，对应的α-烯烃是在尘埃测定器溶液中检测到的唯一反应产物。
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Claims (12)

1.能够从至少一种短链脂肪酸生产至少一种末端烯烃的微生物细胞，其中所述细胞经过基因修饰以包含
- 至少第一个基因突变，其与野生型细胞相比增加选自CYP152过加氧酶家族的酶(E1)的表达，和
- 至少第二个基因突变，其与野生型细胞相比增加至少一种NAD(P)+ 氧化还原酶(E2)和对应的调节蛋白的表达，
其中所述短链脂肪酸是C4-C10脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中E1选自CYPSPα、(E1a)CYPBSB (E1b)和OleT (E1c)。
3.根据权利要求1或2中的任一项所述的细胞，其中E1是OleT (E1c)且与SEQ ID NO:1具有至少60%序列同一性。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述NAD(P)+ 氧化还原酶(E2)和对应的调节蛋白是：
(a) 铁氧还蛋白还原酶(E2a)和铁氧还蛋白；或者
(b) 假单孢氧还蛋白还原酶(E2b)和假单孢氧还蛋白。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中E2与SEQ ID NO:2具有60%序列同一性，且所述调节蛋白与SEQ ID NO:3具有60%序列同一性。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步包含至少第三个基因突变，其与野生型细胞相比增加至少一种能够再生NAD(P)H的酶(E3)的表达。
7.根据权利要求6所述的细胞，其中所述酶(E3)选自葡萄糖脱氢酶、亚磷酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述细胞与野生型细胞相比进一步包含降低的脂肪酸降解能力。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中通过编码选自以下的酶的基因的缺失来降低所述脂肪酸降解能力：脂肪酸输入酶、脂肪酸辅酶A连接酶、酰基辅酶A脱氢酶、2,4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A水合酶和3-酮脂酰基辅酶A硫解酶。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的细胞，其中所述细胞是原核或低等真核细胞。
11.一种从至少一种短链脂肪酸生产至少一种末端烯烃的方法，所述方法包括
- 使根据权利要求1-10中的任一项所述的重组微生物细胞与包含短链脂肪酸的介质接触。
12.根据权利要求1-10中的任一项所述的细胞用于生产至少一种末端烯烃的用途。
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