CN110964757A - 一种葡萄糖二酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种“一锅‑两步”酶催化法由肌醇制备葡萄糖二酸的方法，包括利用肌醇氧化酶催化肌醇生成中间体葡萄糖醛酸，继而利用醛酸脱氢酶将中间体葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸。本发明的方法与现有生产葡萄糖二酸的方法相比，具有生产工艺简单、绿色友好、产率高、易于规模化制备等优点。

Description

一种葡萄糖二酸的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种葡萄糖二酸的制备方法，更具体涉及一种“一锅-两步”酶催化法制备葡萄糖二酸的方法。
背景技术
葡萄糖二酸(glucaric acid，简称GA)是一种六碳单糖衍生物，广泛存在于蔬菜、水果等植物中以及少数哺乳动物体内，其具有重要的生物学功能，可以用于降低胆固醇及治疗癌症，其钙盐可用于食品添加剂。同时，葡萄糖二酸也是一种高附加值的有机酸，在精细化工领域具有广泛的应用，如可作为聚合物合成的基本单元合成聚酰胺类、羟基化的尼龙(PHPAs)及聚二甲基硅氧烷(BDMS)聚酰胺，合成生物可降解的聚合物、缓释肥料、各种薄膜等，也可作为原料生产无毒、可生物降解的磷酸盐替代物，用于家用洗涤剂、防腐剂和混凝土外加剂等。此外，葡萄糖二酸还可在电镀中作为金属防腐的螯合剂。2004年，葡萄糖二酸被美国能源部确定为12种“最具有价值的生物炼制产品(Top value added chemicalsfrom biomass)”之一，它作为合成多种高效环保的新兴生物质能源的原料，具有巨大的潜在经济价值。
目前，葡萄糖二酸的生产方法主要为化学氧化法，如硝酸氧化。然而，化学氧化过程控制要求高，若氧化不充分，葡萄糖氧化只能得到葡萄糖酸，如果氧化太强烈，又会导致过度氧化生成其它副产物而造成葡萄糖二酸的产率低。同时由于反应使用硝酸作为氧化剂，反应过程中会产生大量NO和NO2污染气体而难以满足葡萄糖二酸的工业生产对环境的要求。随着生物工程技术的发展，通过生物法来制备葡萄糖二酸越来越受到研究者的关注。例如利用合成生物学方法对大肠杆菌(Moon TS,et al.(2009)Production of glucaricacid from a synthetic pathway in recombinant Escherichia coli.Applied andenvironmental microbiology 75(3):589-595.)、酿酒酵母(Gupta A,et al.(2016)Porting the synthetic D-glucaric acid pathway from Escherichia coli toSaccharomyces cerevisiae.Biotechnology Journal 11(9):1201-1208.)以及毕赤酵母(Liu Y,et al.(2016)Production of glucaric acid from myo-inositol inengineered Pichia pastoris.Enzyme and Microbial Technology 91:8-16.)等进行代谢工程改造，利用基因工程菌发酵制备葡萄糖二酸。中国专利CN104312987B公开了一种生物合成葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的制备方法，通过肌醇(myo-inositol，简称MI)为培养基碳源，基因重组的大肠杆菌接种发酵制备葡萄糖二酸，发酵液中葡萄糖二酸含量为50mg/L。然而在这些研究中发现葡萄糖二酸在以肌醇为底物生产时存在产物限制，葡萄糖二酸的产量无法突破5-6g/L，而且生物发酵方法需消耗大量培养基，生产周期长，产物分离困难，难以实现规模化制备。
中国专利CN107365806A公开了一种以木聚糖为起始原料酶法制备葡萄糖二酸的方法，其中利用高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶催化木聚糖制备中间体葡萄糖醛酸，然后加入双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶反应制备葡萄糖二酸。但该方法以木聚糖作为起始原料，而木聚糖酶并不能完全将木聚糖降解为单一产品，因此仅有一部分原料转化为中间体葡萄糖醛酸，原料的利用率低；由木聚糖制备中间体葡萄糖醛酸的步骤需要在较高温度(60-90℃)下进行，并且制备的中间体葡萄糖醛酸需要进行分离，无疑增加了工艺的复杂性。
因此，亟待开发一种生产工艺简单、绿色友好、产率高、易于规模化制备葡萄糖二酸的新方法。
发明内容
为改善现有技术中存在的问题，本发明提供一种葡萄糖二酸的制备方法，包括下述步骤：
(1)以肌醇氧化酶(myo-Inositol oxygenase，E.C.1.13.99.1，简称MIOX)为催化剂，在有氧气存在的条件下催化底物肌醇生成中间体葡萄糖醛酸；
(2)向步骤(1)的反应体系中加入醛酸脱氢酶(uronate dehydrogenase，E.C.1.1.1.203，简称UDH)和辅因子NAD+，将中间体葡萄糖醛酸转化为终产物葡萄糖二酸。
根据本发明，所述催化反应途径如图1所示。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中，所述底物肌醇的浓度为1-150g/L，优选为2-100g/L，更优选为50g/L；所述肌醇氧化酶的用量为0.1-15g/L，优选为0.2-10g/L，更优选为5g/L。
本发明底物肌醇与肌醇氧化酶的浓度比可为0.1-50:1，优选为3-30:1。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中，所述底物肌醇可采用一次性加入、分批次加入、连续加入等方式加入。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中，所述肌醇氧化酶可采用一次性加入、分批次加入、连续加入等方式加入。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中，以每升反应体系计，所述氧气的利用速度为20mmol/h。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中所述催化反应的条件为：pH可以在5.5-8.5范围内，优选6.0-8.0，更优选6.5-7.5；反应温度在5-40℃范围内，优选15-35℃，更优选30℃；反应时间为体系中中间体葡萄糖醛酸的浓度不再变化，优选为2-24h，更优选为3-12h，最优选为6h。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中所述肌醇氧化酶可以为任何一种具有将肌醇氧化为葡萄糖醛酸功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述肌醇氧化酶的来源包括但不限于：小家鼠(Mus musculus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、嗜乳酸隐球酵母(Cryptococcus lactativorus)、地生隐球菌(Cryptococcus terreus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)等。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中所述肌醇氧化酶在进行催化反应前可使用还原剂进行活化。
根据本发明的实施方案，所述肌醇氧化酶的活化条件为：pH为5.0-8.0，优选为6.0-7.0，更优选为6.5；活化温度为-5-20℃，优选为-3-10℃，更优选为0-4℃；活化时间为1-150min，优选为30-120min，更优选为60-90min。
根据本发明的实施方案，所述肌醇氧化酶活化用其中一种还原剂可为二价铁盐，包括但不限于硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁、抗坏血酸亚铁。
根据本发明的实施方案，所述二价铁盐的浓度为0.2-10mM；更优选地，所述二价铁盐的浓度为0.5-5mM；最优选地，所述二价铁盐的浓度为2.0mM。
根据本发明的实施方案，所述肌醇氧化酶活化用另一种还原剂可为L-半胱氨酸、抗坏血酸、异抗坏血酸、抗坏血酸葡萄糖苷等；更优选地，所述肌醇氧化酶活化所用另一种还原剂可为L-半胱氨酸和抗坏血酸。
根据本发明的实施方案，所述肌醇氧化酶活化用另一种还原剂的浓度为0.5-25mM；更优选地，所述肌醇氧化酶活化用另一种还原剂的浓度为2-10mM；最优选地，所述肌醇氧化酶活化用另一种还原剂的浓度为5mM。
根据本发明的实施方案，所述肌醇氧化酶的活化可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；更优选地，所述肌醇氧化酶的活化在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中，所述醛酸脱氢酶的用量为0.1-15g/L，优选0.2-10g/L，更优选0.36-5g/L；所述NAD+的用量为0.1-300mM，优选0.5-100mM，更优选1-10mM。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中所述催化反应的条件为：pH可以在5.5-8.5范围内，优选6.5-8.0，更优选7.0-7.5；反应温度在5-40℃范围内，优选15-35℃，更优选30℃；反应时间为2-24h，优选为3-12h，更优选为6h。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中所述醛酸脱氢酶可以为任何一种具有将葡萄糖醛酸氧化为葡萄糖二酸功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述醛酸脱氢酶的来源包括但不限于：根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、Fulvimarina pelagi、产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、色盐杆菌(Chromohalobacter salixigens)、Polaromonas naphthalenivorans、高温双孢菌(Thermobispora bispora)等。
为了进一步降低生产成本，根据本发明的实施方案，步骤(2)中所述NAD+可通过本领域已知的任何辅因子NAD+再生的方法循环利用。所述NAD+再生的方法包括但不限于酶法(例如NADH氧化酶(NADH oxidase，E.C.1.6.99.3，简称NOX))、微生物细胞法(例如酵母细胞)、电化学法等。优选地，所述NAD+再生的方法为使用NADH氧化酶进行NAD+再生。
根据本发明的实施方案，所述NADH氧化酶可以为任何一种具有将NADH氧化为NAD+功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述NADH氧化酶的来源包括但不限于：变异链球菌(Streptococcus mutans)、氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等。
根据本发明的实施方案，所述NADH氧化酶的用量为0.1-15g/L；优选地，所述NADH氧化酶的用量为0.2-10g/L；更优选地，所述NADH氧化酶的用量为5g/L。NADH氧化酶用于实现NAD+循环再生，添加NADH氧化酶时，NAD+用量可以更低，优选为1mM。
根据本发明的实施方案，所述使用NADH氧化酶进行NAD+再生的反应体系中还可包含辅因子FAD和还原剂DTT。
根据本发明的实施方案，所述辅因子FAD的用量为1-50μM；更优选地，所述辅因子FAD的用量为5-25μM；最优选地，所述辅因子FAD的用量为10μM。
根据本发明的实施方案，所述还原剂DTT的用量为0.1-20mM；更优选地，所述还原剂DTT的用量为0.5-5mM；最优选地，所述还原剂DTT的用量为1mM。
根据本发明的实施方案，所述催化反应中的任何酶可为纯酶、酶裂解上清、全细胞等形式。
根据本发明的实施方案，所述催化反应可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；更优选地，所述催化反应在缓冲液体系中进行，所述缓冲液可为MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。根据本发明的实施方案，所述步骤(1)和(2)反应过程中分别实时控制反应体系的pH值在相应pH值范围内，保持pH值稳定。可以理解的是，可以通过添加本领域已知的pH调节剂控制pH，包括但不限于NaOH、KOH、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水、HCl、醋酸、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种，从而实现上述目的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明利用肌醇氧化酶和醛酸脱氢酶催化，采用“一锅-两步”法由肌醇制备葡萄糖二酸，开发了一种简单、绿色友好且产率高、易于规模化制备葡萄糖二酸的新方法。
(2)本发明采用“一锅-两步”法，与现有技术相比，一方面，可以防止产物抑制作用，特别是产物葡萄糖二酸对肌醇氧化酶活性的抑制，有利于提高反应产率；另一方面，无需对中间体葡萄糖醛酸进行分离，有利于简化反应工艺。
(3)本发明以肌醇为原料，与现有技术相比，原料利用率高。
(4)本发明的方法利用NADH氧化酶实现了NAD+的循环利用，因此反应体系中只需要添加催化量的NAD+，有利于降低生产成本，具有重要的工业应用价值。
(5)本发明通过分段实时调节pH值，确保反应体系中pH环境的稳定，大大提高了酶的催化效率，提高了反应产率。
(6)本发明方法中催化反应可在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行，不需要使用含有碳源、氮源、无机盐及抗生素的培养基，一方面有利于降低生产成本，另一方面有利于产物葡萄糖二酸的分离纯化。
附图说明
图1为由肌醇制备葡萄糖二酸催化途径的示意图。MI：肌醇；GA：葡萄糖二酸；MIOX：肌醇氧化酶；UDH：醛酸脱氢酶。
图2为肌醇氧化酶(MIOX)、醛酸脱氢酶(UDH)和NADH氧化酶(NOX)的表达情况。
图3为中间体葡萄糖醛酸和产物葡萄糖二酸的HPLC谱图。
图4为通过NAD+再生由肌醇制备葡萄糖醛酸的示意图。MI：肌醇；GA：葡萄糖二酸；MIOX：肌醇氧化酶；UDH：醛酸脱氢酶；NOX：NADH氧化酶。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1由肌醇(1.8g/L)制备葡萄糖二酸
本实施例中肌醇氧化酶来自Cryptococcus neoformans，NCBI登录号为AAN85573.1。该基因miox由华大基因合成，并进行密码子优化。本实施例中醛酸脱氢酶来自Agrobacterium tumefaciens，NCBI登录号为DAA06454.1。Agrobacterium tumefaciens购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。该基因udh使用相应引物从基因组DNA中通过PCR获取。采用酶切链接或Simple cloning的方法将上述基因分别克隆至pET21a载体中，获得相应的重组表达载体pET21a-MIOX和pET21a-UDH。将上述质粒分别转入Escherichiacoli BL21(DE3)中，并进行蛋白表达和纯化，蛋白表达结果如图2所示。
(1)肌醇氧化酶活化
将含有50mM MOPS缓冲液(pH 6.5)、5g/L肌醇氧化酶、2.0mM硫酸亚铁铵和5.0mML-半胱氨酸的混合物在冰水浴中孵育90min，用以活化肌醇氧化酶。
(2)中间体葡萄糖醛酸的生成
在0.2mL的反应体系中含有200mM MOPS缓冲液(pH 7.5)、1.8g/L肌醇和0.3g/L活化的肌醇氧化酶，在30℃，1000rpm下反应。使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，直至中间体葡萄糖醛酸的产量不再变化。HPLC检测条件如下：色谱柱为ZORBAX SB-C18；流动相为甲醇/缓冲液(v:v，5:95)，其中缓冲液为10mM磷酸氢二钾和10mM四丁基硫酸氢铵的混合物(pH7.2)；流速为0.7mL/min；柱温为40℃；检测器为紫外检测器(检测波长为210nm)；进样量为10μL。中间体葡萄糖醛酸和产物葡萄糖二酸的液相色谱图如图3所示。
(3)产物葡萄糖二酸的生成
向上述反应体系中加入0.36g/L醛酸脱氢酶和10mM NAD+，在30℃，1000rpm下继续反应6h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件如上述检测条件。
结果显示，葡萄糖二酸的产量为1.94g/L，产率(摩尔产率，以底物肌醇的量计)可达100％。
实施例2利用NAD+再生由肌醇(1.8g/L)制备葡萄糖二酸
利用NAD+再生由肌醇制备葡萄糖二酸的催化途径如图4所示。
肌醇氧化酶和醛酸脱氢酶的制备方法同实施例1。本实施例中NADH氧化酶来自Streptococcus mutans，NCBI登录号为BAA08707.1。该基因nox由华大基因合成，并进行密码子优化。采用酶切链接或Simple cloning的方法将该基因克隆至pET29a载体中，获得相应的重组表达载体pET29a-NOX。将上述质粒分别转入E.coli BL21(DE3)中，并进行蛋白表达和纯化，蛋白表达结果如图2所示。
(1)肌醇氧化酶活化
将含有50mM MOPS缓冲液(pH 6.5)、5g/L肌醇氧化酶、2.0mM硫酸亚铁铵和5.0mM抗坏血酸的混合物在冰水浴中孵育60min，用以活化肌醇氧化酶。
(2)中间体葡萄糖醛酸的生成
在0.2mL的反应体系中含有200mM MOPS缓冲液(pH 7.5)、1.8g/L肌醇和0.3g/L活化的肌醇氧化酶，在30℃，1000rpm下反应。使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，直至中间体葡萄糖醛酸的产量不再变化。HPLC检测条件同实施例1。
(3)产物葡萄糖二酸的生成
向上述反应体系中加入0.36g/L醛酸脱氢酶、0.36g/L NADH氧化酶、1mM NAD+、10μM FAD和1mM DTT，在30℃，1000rpm下继续反应6h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例1。
结果显示，葡萄糖二酸的产量为1.94g/L，产率(摩尔产率，以底物肌醇的量计)可达100％。
实施例3利用NAD+再生由肌醇(9g/L)制备葡萄糖二酸
肌醇氧化酶和醛酸脱氢酶的制备方法同实施例1。NADH氧化酶的制备方法同实施例2。肌醇的初始浓度为9g/L。
(1)肌醇氧化酶活化
将含有50mM MOPS缓冲液(pH 6.5)、10g/L肌醇氧化酶、2.0mM硫酸亚铁铵和5.0mM抗坏血酸的混合物在冰水浴中孵育60min，用以活化肌醇氧化酶。
(2)中间体葡萄糖醛酸的生成
在0.2mL的反应体系中含有200mM MOPS缓冲液(pH 7.5)、9g/L肌醇和2.1g/L活化的肌醇氧化酶，在30℃，1000rpm下反应。使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，直至中间体葡萄糖醛酸的产量不再变化。HPLC检测条件同实施例1。
(3)产物葡萄糖二酸的生成
向上述反应体系中加入1.5g/L醛酸脱氢酶、1.5g/L NADH氧化酶、1mM NAD+、10μMFAD和1mM DTT，在30℃，1000rpm下继续反应6h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例1。
结果显示，葡萄糖二酸的产量为10.5g/L，产率(摩尔产率，以底物肌醇的量计)可达100％。
实施例4利用NAD+再生由肌醇(50g/L)制备葡萄糖二酸
肌醇氧化酶和醛酸脱氢酶的制备方法同实施例1。NADH氧化酶的制备方法同实施例2。肌醇的初始浓度为50g/L。
(1)肌醇氧化酶活化
肌醇氧化酶的活化同实施例3。
(2)中间体葡萄糖醛酸的生成
在0.2mL的反应体系中含有1M MOPS缓冲液(pH 7.5)、50g/L肌醇和2.1g/L活化的肌醇氧化酶，在30℃，1000rpm下反应。使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，直至中间体葡萄糖醛酸的产量不再变化。HPLC检测条件同实施例1。
(3)产物葡萄糖二酸的生成
向上述反应体系中加入5g/L醛酸脱氢酶、5g/L NADH氧化酶、1mM NAD+、10μM FAD和1mM DTT，在30℃，1000rpm下继续反应6h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例1。
结果显示，葡萄糖二酸的产量为17g/L，产率(摩尔产率，以底物肌醇的量计)为42％。
实施例5通过实时调节pH利用NAD+再生由肌醇(50g/L)制备葡萄糖二酸
肌醇氧化酶和醛酸脱氢酶的制备方法同实施例1。NADH氧化酶的制备方法同实施例2。肌醇的初始浓度为50g/L。
(1)肌醇氧化酶活化
肌醇氧化酶的活化同实施例3。
(2)中间体葡萄糖醛酸的生成
在20mL的反应体系中含有50mM MOPS缓冲液(pH 6.5)、50g/L肌醇和5g/L活化的肌醇氧化酶。反应温度控制在25℃，反应pH使用2M NaOH利用pH控制器实时控制在pH 6.5，磁力搅拌，转速控制在800rpm，以保证足够的氧气浓度。使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，直至中间体葡萄糖醛酸的产量不再变化。HPLC检测条件同实施例1。
(3)产物葡萄糖二酸的生成
向上述反应体系中加入5g/L醛酸脱氢酶、5g/L NADH氧化酶、1mM NAD+、10μM FAD和1mM DTT。反应温度控制在25℃，反应pH使用2M NaOH利用pH控制器实时控制在pH 7.5，磁力搅拌，转速控制在800rpm，以保证足够的氧气浓度。继续反应6h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例1。
结果显示，葡萄糖二酸的产量为46g/L，产率(摩尔产率，以底物肌醇的量计)约为80％。
实施例6通过实时调节pH利用酶的裂解上清和NAD+再生由肌醇(50g/L)制备葡萄糖二酸
将实施例1中的肌醇氧化酶、醛酸脱氢酶和NADH氧化酶进行表达，高压均质破碎，获得相应酶的裂解上清。肌醇的初始浓度为50g/L。
(1)肌醇氧化酶活化
将含有50mM MOPS缓冲液(pH 6.5)、35g/L肌醇氧化酶的裂解上清、2.0mM硫酸亚铁铵和5.0mM抗坏血酸的混合物在冰水浴中孵育60min，用以活化肌醇氧化酶。
(2)中间体葡萄糖醛酸的生成
在20mL的反应体系中含有50mM MOPS缓冲液(pH 6.5)、50g/L肌醇和5g/L活化的肌醇氧化酶的裂解上请。反应温度控制在25℃，反应pH使用2M NaOH利用pH控制器实时控制在pH 6.5，磁力搅拌，转速控制在800rpm，以保证足够的氧气浓度。使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，直至中间体葡萄糖醛酸的产量不再变化。HPLC检测条件同实施例1。
(3)产物葡萄糖二酸的生成
向上述反应体系中加入5g/L醛酸脱氢酶的裂解上清、5g/L NADH氧化酶的裂解上清、1mM NAD+、10μM FAD和1mM DTT。反应温度控制在25℃，反应pH使用2M NaOH利用pH控制器实时控制在pH 7.5，磁力搅拌，转速控制在800rpm，以保证足够的氧气浓度。继续反应6h，取样进行HPLC分析。HPLC检测条件同实施例1。
结果显示，葡萄糖二酸的产量为43g/L，产率(摩尔产率，以底物肌醇的量计)约为74％。
本发明以肌醇为起始原料，采用“一锅-两步”酶催化法生产葡萄糖二酸，肌醇转化率非常高，可达100％。通过实施例2可以看出，本发明采用NADH氧化酶进行NAD+再生，实现NAD+的循环利用，大幅减小了NAD+的用量，且仍然可以保持高的原料利用率，降低了生产成本。同时，本发明通过在反应过程中动态控制pH值，确保反应体系的稳定性，大大提高了规模化反应的产率，具有良好的工业化应用价值。

Claims (10)

1.一种制备葡萄糖二酸的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)以肌醇氧化酶(E.C.1.13.99.1)为催化剂，在有氧气存在的条件下催化底物肌醇生成中间体葡萄糖醛酸；
(2)向步骤(1)的反应体系中加入醛酸脱氢酶(E.C.1.1.1.203)和辅因子NAD+，将中间体葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述底物肌醇的浓度为1-150g/L，优选2-100g/L，更优选50g/L；进一步优选地，所述肌醇氧化酶的用量为0.1-15g/L，优选0.2-10g/L，更优选5g/L。
优选地，所述底物肌醇与肌醇氧化酶的浓度比为0.1-50:1，例如3-30:1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述底物肌醇采用一次性加入、分批次加入或连续加入方式加入；
优选地，步骤(1)中，所述肌醇氧化酶采用一次性加入、分批次加入或连续加入方式加入。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中，以每升反应体系计，所述氧气的利用速度为20mmol/h。
优选地，步骤(1)中pH在5.5-8.5范围内，更优选6.0-8.0，最优选6.5-7.5；反应温度在5-40℃范围内，优选15-35℃，更优选30℃；反应时间为体系中中间体葡萄糖醛酸的浓度不再变化，优选为2-24h，更优选为3-12h，最优选为6h。
进一步优选地，所述步骤(1)反应过程中实时控制反应体系的pH值在所述pH值范围内。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述肌醇氧化酶的来源包括但不限于：小家鼠(Mus musculus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、嗜乳酸隐球酵母(Cryptococcus lactativorus)、地生隐球菌(Cryptococcus terreus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括所述肌醇氧化酶在进行催化反应前使用还原剂进行活化的步骤。
优选地，所述肌醇氧化酶的活化条件为：pH为5.0-8.0，优选为6.0-7.0，更优选为6.5；活化温度为-5-20℃，优选为-3-10℃，更优选为0-4℃；活化时间为1-150min，优选为30-120min，更优选为60-90min。优选地，所述肌醇氧化酶活化用其中一种还原剂为二价铁盐，包括但不限于硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁、抗坏血酸亚铁中的一种或一种以上。
优选地，所述二价铁盐的浓度为0.2-10mM；更优选地，所述二价铁盐的浓度为0.5-5mM；最优选地，所述二价铁盐的浓度为2.0mM。
优选地，所述肌醇氧化酶活化用还原剂还包括另一种还原剂，选自L-半胱氨酸、抗坏血酸、异抗坏血酸、抗坏血酸葡萄糖苷中的一种或一种以上；更优选地，所述肌醇氧化酶活化用还原剂为L-半胱氨酸和抗坏血酸。
优选地，所述肌醇氧化酶活化用另一种还原剂的浓度为0.5-25mM；更优选地，所述肌醇氧化酶活化用另一种还原剂的浓度为2-10mM；最优选地，所述肌醇氧化酶活化用另一种还原剂的浓度为5mM。
优选地，所述肌醇氧化酶的活化在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；更优选地，所述肌醇氧化酶的活化在缓冲液体系中进行，所述缓冲液为MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述醛酸脱氢酶的用量为0.1-15g/L，优选0.2-10g/L，更优选0.36-5g/L；所述NAD+的用量为0.1-300mM，优选为0.5-100mM，更优选为1-10mM。
优选地，步骤(2)中所述反应的反应条件为：
pH在5.5-8.5范围内，更优选为6.5-8.0，最优选为7.0-7.5；反应温度在5-40℃范围内，更优选15-35℃，最优选30℃；反应时间为2-24h，更优选为3-12h，最优选6h。
进一步优选地，所述步骤(2)反应过程中实时控制反应体系的pH值在所述pH值范围内。
优选地，步骤(2)中所述醛酸脱氢酶的来源包括但不限于：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、Fulvimarinapelagi、产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、色盐杆菌(Chromohalobactersalixigens)、Polaromonas naphthalenivorans、高温双孢菌(Thermobispora bispora)等。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述辅因子NAD+为再生NAD+。优选的，所述NAD+再生的方法包括但不限于酶法，例如NADH氧化酶(E.C.1.6.99.3)、微生物细胞法，例如酵母细胞、电化学法等。优选地，所述NAD+再生的方法为使用NADH氧化酶进行NAD+再生。
优选地，所述NADH氧化酶的来源包括但不限于：变异链球菌(Streptococcus mutans)、氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
优选地，所述NADH氧化酶的用量为0.1-15g/L；更优选地，所述NADH氧化酶的用量为0.2-10g/L；最优选地，所述NADH氧化酶的用量为5g/L。
优选地，所述使用NADH氧化酶进行NAD+再生的反应体系中还可包含辅因子FAD和还原剂DTT。
优选地，所述辅因子FAD的用量为1-50μM；更优选地，所述辅因子FAD的用量为5-25μM；最优选地，所述辅因子FAD的用量为10μM。
优选地，所述还原剂DTT的用量为0.1-20mM；更优选地，所述还原剂DTT的用量为0.5-5mM；最优选地，所述还原剂DTT的用量为1mM。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中的所用酶为纯酶、酶裂解上清或全细胞的形式。
10.根据权利要求1所述的方法，所述反应在无缓冲液体系或缓冲液体系中进行；更优选地，所述反应在缓冲液体系中进行，所述缓冲液为MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、或醋酸盐缓冲液。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111593012A (zh) * 2020-04-23 2020-08-28 济南大学 提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用
CN111593013A (zh) * 2020-04-23 2020-08-28 济南大学 一种全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法
CN111647543A (zh) * 2020-04-23 2020-09-11 济南大学 一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用
CN111909973A (zh) * 2020-07-03 2020-11-10 华南理工大学 一种生物催化合成d-(+)-葡萄糖醛酸的方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002074926A2 (en) * 2001-03-19 2002-09-26 Cargill Incorporated Myo-inositol oxygenases
CN104312935A (zh) * 2014-10-22 2015-01-28 江南大学 一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法
CN107365806A (zh) * 2017-08-02 2017-11-21 南京师范大学 一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶‑nadh氧化酶和应用
CN108018265A (zh) * 2018-01-31 2018-05-11 山东大学 一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用
CN108220176A (zh) * 2018-01-30 2018-06-29 江南大学 一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002074926A2 (en) * 2001-03-19 2002-09-26 Cargill Incorporated Myo-inositol oxygenases
CN104312935A (zh) * 2014-10-22 2015-01-28 江南大学 一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法
CN107365806A (zh) * 2017-08-02 2017-11-21 南京师范大学 一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶‑nadh氧化酶和应用
CN108220176A (zh) * 2018-01-30 2018-06-29 江南大学 一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法
CN108018265A (zh) * 2018-01-31 2018-05-11 山东大学 一种肌醇氧化酶突变体及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHUANG ZHENG，等: "One-pot two-strain system based on glucaric acid biosensor for rapid screening of myo-inositol oxygenase mutations and glucaric acid production in recombinant cells", 《METABOLIC ENGINEERING》 *
仇钰莹，等: "葡萄糖二酸研究进展", 《生物工程学报》 *
余作龙，等: "葡萄糖二酸的生物炼制及应用研究进展", 《化工进展》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111593012A (zh) * 2020-04-23 2020-08-28 济南大学 提高细胞通透性的方法及其在制备葡萄糖二酸中的应用
CN111593013A (zh) * 2020-04-23 2020-08-28 济南大学 一种全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法
CN111647543A (zh) * 2020-04-23 2020-09-11 济南大学 一株高效生物合成葡萄糖二酸的工程菌株及其应用
CN111909973A (zh) * 2020-07-03 2020-11-10 华南理工大学 一种生物催化合成d-(+)-葡萄糖醛酸的方法及其应用
CN111909973B (zh) * 2020-07-03 2022-01-18 华南理工大学 一种生物催化合成d-(+)-葡萄糖醛酸的方法及其应用

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