CN109072264A - 不饱和氨基酸 - Google Patents

不饱和氨基酸 Download PDF

Info

Publication number
CN109072264A
CN109072264A CN201780027259.7A CN201780027259A CN109072264A CN 109072264 A CN109072264 A CN 109072264A CN 201780027259 A CN201780027259 A CN 201780027259A CN 109072264 A CN109072264 A CN 109072264A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
cell
amino acid
wild
coa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780027259.7A
Other languages
English (en)
Inventor
T.哈斯
A.赫克
T.比尔特
W.克劳蒂尔
K.法贝尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa GmbH filed Critical Evonik Degussa GmbH
Publication of CN109072264A publication Critical patent/CN109072264A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C319/00—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides
    • C07C319/14—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides
    • C07C319/18—Preparation of thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides of sulfides by addition of thiols to unsaturated compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0095—Oxidoreductases (1.) acting on iron-sulfur proteins as donor (1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/02—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11) with H2O2 as acceptor, one oxygen atom of which is incorporated into the product (1.11.2)
    • C12Y111/02004—Fatty-acid peroxygenase (1.11.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/14—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.14)
    • C12Y114/14001—Unspecific monooxygenase (1.14.14.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y118/00—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18)
    • C12Y118/01—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.18.1)
    • C12Y118/01002—Ferredoxin-NADP+ reductase (1.18.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y118/00—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18)
    • C12Y118/01—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.18.1)
    • C12Y118/01005—Putidaredoxin—NAD+ reductase (1.18.1.5)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了从至少一种包含至少两个羰基的氨基酸产生至少一种不饱和氨基酸的方法，所述方法包括：(a)使重组微生物细胞与包含含有羰基的氨基酸的培养基接触，其中所述细胞经基因修饰以包含‑至少第一基因突变，其相对于野生型细胞增加选自CYP152过氧合酶家族的酶(E1)的表达，和‑至少第二基因突变，其相对于野生型细胞增加至少一种NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白的表达。

Description

不饱和氨基酸
发明领域
本发明涉及能够从至少一种氨基酸产生至少一种不饱和氨基酸的生物技术方法，其中起始氨基酸具有至少两个羰基。具体而言，所得不饱和氨基酸具有至少一个末端双碳键。
发明背景
具有不饱和侧链的氨基酸具有几种新用途。具体而言，这些氨基酸可用作其他有用化合物的构建模块。例如，这些烯烃部分可用于生物正交合成策略以形成杂合结构，将化学探针引入生物分子中，或将大片段彼此连接。
更重要且有用的不饱和氨基酸之一是乙烯基甘氨酸(2-氨基-3-丁烯酸)。乙烯基甘氨酸是一种天然的非蛋白α-氨基酸，且通常从真菌中分离，且已知不可逆地抑制许多使用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅因子的酶。因此，乙烯基甘氨酸及其衍生物已被用作酶抑制剂和/或抗生素。
基于相应的N-氯亚氨酸酯的Neber重排，已经使用3-丁烯腈作为起始材料开发了乙烯基甘氨酸的三步合成。然而，这种方法非常复杂且难以获得起始材料。制备L-乙烯基甘氨酸的其他更常见的方法包括保护的甲硫氨酸亚砜(MetO)的高温分解和从L-谷氨酸、L-高丝氨酸或L-高丝氨酸内酯获得的芳基硒氧化物(aryl selonoxides)的热分解。然而，由于高真空(≦3 mm Hg)和温度(> 150℃)要求，异构化始终是反应的一个问题。此外，在这些方法中，L-乙烯基甘氨酸转化为热稳定的β-甲基脱氢丙氨酸的机会也非常高。这降低了L-乙烯基甘氨酸的产率。使用该方法通过色谱法从所得反应混合物中分离乙烯基甘氨酸也是困难的。乙烯基甘氨酸也可以通过使丁二烯与环氧酶接触以产生丁二烯环氧化物、然后将其水解(其中环氧化物基团转化为二醇)来制备。然后将二醇氧化成羟基酸并胺化以形成乙烯基甘氨酸。然而，这种形成乙烯基甘氨酸的方法需要许多步骤，且因此成本高，并且可导致产物沿途的损失。
因此，本领域需要找到一种生产不饱和氨基酸(包括乙烯基甘氨酸)的不同手段，其不使用非高温分解大规模方法且使用容易获得的起始材料。具体而言，需要开发使用容易获得且价格合理的原料的不饱和氨基酸的生物技术生产方法。
发明描述
本发明试图通过提供一种生物技术手段来解决上述问题，所述生物技术手段从至少一种具有至少两个羰基的氨基酸生产至少一种不饱和氨基酸。具体而言，提供了具有特定酶级联的基因修饰细胞，所述特定酶级联用于通过具有两个羰基的氨基酸的氧化脱羧化来生物催化合成末端烯基。对于该脱羧化的步骤，细胞不需要H2O2。所述酶级联包括脱羧化反应，其是H2O2-非依赖性的并且可以被至少一种P450单加氧酶催化。具体而言，所述细胞表达酶，例如OleT，其可以使用脱羧化反应来优化生物催化系统以从氨基酸中的羧基产生至少一个烯基。
根据本发明的一个方面，提供了由至少一种包含至少两个羰基的氨基酸产生至少一种不饱和氨基酸的方法，所述方法包括
(a) 使重组微生物细胞与包含含有羰基的氨基酸的培养基接触，
其中所述细胞被基因修饰以包含
- 至少第一基因突变，其相对于野生型细胞增加选自CYP152过氧合酶(peroxygenase)家族的酶(E1)的表达，和
- 至少第二基因突变，其相对于野生型细胞增加至少一种NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白的表达。
与通常用于产生烯基的常用化学-催化途径相反，根据本发明的任一方面的方法可以使用全细胞或分离的酶。这允许该方法在温和的反应条件下进行，由此实现具有最少废物排放的可持续过程。这是意料之外的结果，因为现有技术(Fujishiro T., 2007和Matsunaga I., 2002)报道了P450还原酶系统诸如铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶不支持P450BSβ和P450SPα的活性。
此外，根据本发明的任一方面的方法允许从用作底物的具有羰基的氨基酸大规模生产不饱和氨基酸。
根据本发明的任一方面的方法具有进一步的优点，诸如其使用O2作为氧化剂，这使得该方法比使用H2O作为氧化剂的本领域已知方法更有效；该方法允许从可再生资源的电子转移，并且根据本发明的任一方面的方法也导致不饱和氨基酸的显著高产生。
根据本发明的任一方面的包含至少两个羰基的氨基酸可以选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。这些氨基酸包含至少两个羰基(C=O)基团。羰基之一是形成氨基酸主链的羧基的一部分，另一个可用于形成根据本发明的任一方面的烯基。
在一个实例中，根据本发明的任一方面的包含至少两个羰基的氨基酸可以是谷氨酸和/或其衍生物。谷氨酸的衍生物包括谷氨酸的酯和/或酰胺。具体而言，谷氨酸的衍生物可以包括烷氧基酯、N-Boc保护的衍生物、N-乙酰基保护的衍生物、谷氨酸的盐，诸如谷氨酸钠等，以及谷氨酸的同型或异型肽。在一个进一步实例中，根据本发明的任一方面的包含至少两个羰基的氨基酸可以是N-乙酰基谷氨酸。
在又另一个实例中，谷氨酸和至少一种谷氨酸的衍生物的混合物可以用作根据本发明的任一方面的用于生产乙烯基甘氨酸和/或各自衍生物的底物。形成的乙烯基甘氨酸的衍生物可以取决于用作底物的谷氨酸的衍生物。
不饱和氨基酸可以是具有至少一个烯基的任何氨基酸。具体而言，不饱和氨基酸可以包含至少一个羧基、氨基和烯基。不饱和氨基酸的实例可以选自乙烯基甘氨酸、脱氢丙氨酸、β-甲基脱氢丙氨酸等。
具体而言，不饱和氨基酸可以是乙烯基甘氨酸和/或其衍生物。乙烯基甘氨酸具有C4H7NO2的一般化学式和以下结构式：
式I。
乙烯基甘氨酸的衍生物可选自乙烯基甘氨酸的酰胺类、乙烯基甘氨酸的酯类、根瘤菌毒素、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、乙烯基甘氨酸的胺酯类、乙烯基甘氨酸的酰胺酯类、乙烯基甘氨酸的HCl-盐类、乙烯基甘氨酸的受保护的氨基酸等。保护基团可能是Boc、Fmoc、Cbz或酯部分或它们的组合。具体而言，乙烯基甘氨酸的衍生物可选自根瘤菌毒素、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、乙烯基甘氨酸的胺酯类、乙烯基甘氨酸的酰胺酯类、乙烯基甘氨酸的酰胺类、乙烯基甘氨酸的酯类和乙烯基甘氨酸的肽类。在一个实例中，乙烯基甘氨酸的衍生物可以是N-乙酰基乙烯基甘氨酸。
根据本发明的任一方面的细胞可以指广泛范围的微生物细胞。具体而言，所述细胞可以是原核细胞或低等真核细胞，其选自假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和埃希氏菌属(Escherichia)。在一个实例中，所述细胞可以是大肠杆菌。在另一个实例中，所述细胞可以是低等真核生物，诸如来自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)的真菌，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。所述细胞可以是分离的细胞，换言之，是单一菌株的纯培养物，或者可以包含至少两种菌株的混合物。生物技术相关的细胞可商购获得，例如来自American Type Culture Collection (ATCC)或German Collection of Microorganismsand Cell Cultures (DSMZ)。用于保持和修饰细胞的颗粒可得自现有技术，例如Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989)。
如本文与细胞或微生物结合使用的短语“野生型”可以表示具有呈野生自然可见的形式的基因组构成的细胞。该术语可适用于整个细胞和个别基因。因此，术语‘野生型’还可以包括在其他方面(即关于一种或多种基因)已经基因修饰、但关于目标基因不修饰的细胞。因此，术语“野生型”不包括此类细胞或此类基因，其中基因序列已被人类使用重组方法至少部分改变。因此，根据本发明的任一方面的野生型细胞是指就全基因组和/或特定基因而言没有基因突变的细胞。因此，在一个实例中，关于酶E1的野生型细胞可以指细胞中具有酶E1的天然/非改变表达的细胞。关于酶E2、E3等的野生型细胞可以以相同的方式解释，并且可以指细胞中分别具有酶E2、E3等的天然/非改变表达的细胞。
根据本发明的任一方面使用的任何酶可以是分离的酶。具体而言，根据本发明的任一方面使用的酶可以以活性状态并且在所有辅因子、底物、辅助多肽和/或活化多肽或其活性必需的因子存在的情况下使用。如本文所用，术语“分离的”意味着与其天然存在的细胞相比，目标酶是富集的。可以通过SDS聚丙烯酰胺电泳和/或活性测定来富集酶。例如，目标酶可以构成制剂中存在的所有多肽的超过5、10、20、50、75、80、85、90、95或99％，如通过在用考马斯蓝染料染色后目视检查聚丙烯酰胺凝胶来判断。
根据本发明的任一方面使用的细胞和/或酶可以是重组的。如本文所用的术语“重组”是指这样的分子或由这种分子编码（特别是多肽或核酸），其本身不是天然存在的，但是基因工程改造的结果，或是指包含重组分子的细胞。例如，如果核酸分子包含与编码催化活性多肽的序列功能性连接的启动子且启动子已被工程改造、使得催化活性多肽相对于包含原始未改变的核酸分子的相应野生型细胞中的多肽水平过表达，则该核酸分子是重组的。
核酸分子、多肽、更具体地是根据本发明的任一方面使用的酶是否是重组的，不一定暗示其表达水平。然而，在一个实例中，可以过表达根据本发明的任一方面使用的一种或多种重组核酸分子、多肽或酶。如本文所用，术语“过表达”意味着编码或表达的相应多肽以比在相同条件下不进行遗传修饰以增加表达的情况下(例如在相应的野生型细胞中)通常在细胞中发现的更高水平或更高活性表达。本领域技术人员熟悉产生过表达的多种方法。例如，待过表达或编码待过表达的多肽或酶的核酸分子可置于强诱导型启动子诸如lac启动子的控制下。现有技术描述了可用于该目的的标准质粒，例如由pET-3a示例的载体的pET系统 (可从Novagen商购获得)。核酸或多肽是否过表达可以通过定量PCR反应(在核酸分子的情况下)、SDS聚丙烯酰胺电泳、Western印迹或比较活性测定(在多肽的情况下)来确定。基因修饰可以针对转录、翻译和/或翻译后修饰，其导致在选定和/或鉴定的培养条件下酶活性和/或选择性的变化。因此，在本发明的各种实例中，为了更有效地发挥功能，微生物可以包含一个或多个基因缺失。基因缺失可以通过突变基因缺失方法和/或从具有这些酶中的一种或多种的表达降低或不表达的突变菌株开始和/或本领域技术人员已知的其他方法来完成。在一个实例中，可以对根据本发明的任一方面的细胞进行基因修饰以包含至少第一基因突变，其相对于野生型细胞增加选自CYP152过氧合酶家族的酶(E1)的表达。在该实例中，酶E1可以在野生型细胞中过表达，其中酶E1的表达可以不存在或以野生型水平表达。类似地，在相同实例或另一个实例中，酶、NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白可以相对于野生型细胞中这些酶和/或蛋白的表达是过表达的。
根据本发明的任一方面使用的选自CYP152过氧合酶家族的酶(E1)可以是细胞色素P450酶(CYP)的超家族的一部分(Malca等人，2011)。通常，P450酶采用一种或多种氧化还原伴侣蛋白将两个电子从NAD(P)H转移至血红素铁反应中心用于双氧活化，且然后将O2的一个原子插入其底物中。已经鉴定出CYP152过氧合酶家族内的酶专门使用H2O2作为唯一的电子和氧供体。然而，在根据本发明的任一方面的细胞中，NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白可用作电子和氧供体的来源。这是有利的，因为在具有末端烯基的低成本不饱和氨基酸的大规模生产中，使用大量过氧化物受成本过高限制，并且高浓度的H2O2可以快速使生物催化剂失活。因此，使用NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白作为电子源提供了更节约成本的不饱和氨基酸的微生物产生。这可以在Liu等人，2014中进一步解释。
具体而言，酶E1可以选自CYPSPα (E1a)、CYPBSB (E1b) (EC 1.11.2.4)和OleT (E1c)。更具体而言，酶E1可以是OleT (E1c)或其变体。在一个实例中，酶E1可以包含ADW41779.1的序列。在另一个实例中，酶E1可以与SEQ ID NO:1具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、100%序列同一性。
技术人员能够鉴定可用于进行从至少一种包含至少两个羰基的氨基酸形成至少一种不饱和氨基酸的方法的OleT的可能序列。在一个实例中，技术人员可以使用Liu等人,2014, Rude M.A, 2011, Schallmey, A., 2011, Fukada H., 1994, Belcher J., 2014等中的公开内容来确定结构和将OleT (E1c)引入合适的细胞和确定酶在细胞中的表达的手段。OleT(与其他H2O2-依赖性酶促反应相比)可以形成人工电子转移系统以获得更高产率。
在根据本发明的任一方面的方法中使用的细胞可以包含第二基因突变，其相对于野生型细胞增加至少一种酶NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白的表达。这些酶属于氧化还原酶的家族，其氧化介体蛋白并接受两个电子。具体而言，NAD(P)+氧化还原酶可以使用铁-硫蛋白作为电子供体，且使用NAD+或NADP+作为电子受体。Hannemann等人公开了可用作根据本发明的任一方面的酶E2的各类氧化还原介体的列表。在一个实例中，人工/“化学”氧化还原介体可以将电子从还原酶或电来源转移至血红素铁簇。
更具体而言，NAD(P)+氧化还原酶(EC 1.18.1.5)和相应的蛋白可以选自：
(a)铁氧还蛋白还原酶(E2a)和铁氧还蛋白；或
(b)假单胞氧还蛋白还原酶(E2b)和假单胞氧还蛋白(Schallmey, A., 2011)。
具体而言，E2可以是CamA，且介体蛋白可以是CamB。E2可以包含与SEQ ID:NO:2的50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、100%序列同一性和/或介体蛋白可以包含与SEQ ID:NO:3的50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、100%序列同一性。
在一个实例中，在根据本发明的任一方面的细胞中，E2可以是铁氧还蛋白还原酶(E2a)，其中也可以存在铁氧还蛋白，且E2a能够在功能上与E1相互作用。具体而言，E1和E2的来源可以是相同或不同的。在一个实例中，E1和E2两者均可来自相同的来源，例如来自泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis) SK2(登录号YP_691921)。在该实例中，E2a和铁氧还蛋白可以分别具有登录号YP_691923和YP_691920。
在另一个实例中，在根据本发明的任一方面的方法中使用的细胞中，E2可以是假单胞氧还蛋白还原酶(E2b)，其中也可以存在假单胞氧还蛋白，且E2b能够在功能上与E1相互作用。在一个实例中，E2b可以来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的P450cam酶系统。对于假单胞氧还蛋白还原酶，通常使用的酶的量可以是约100至10,000 ca、1000至5000 ca、2000至4000 ca或特别是3000 ca。ca是假单胞氧还蛋白还原酶在介导铁氰化物氧化NADH中的活性单位，并且被定义为每分钟每mg还原酶氧化1μmol的NADH。
E2是已经纯化或分离的重组蛋白或天然存在的蛋白。E2可能已被突变以改善其性能，诸如以优化其进行电子转移的速度或其底物特异性。采用的还原酶的量将取决于所测量者的确切性质和测定的具体细节，但通常，还原酶将以0至1000 μM、0.001至100 μM、0.01至50 μM、0.1至25 μM且特别是1至10 μM的浓度存在。
在根据本发明的任一方面的方法中使用的细胞可以进一步包含至少第三基因突变，其可以相对于野生型细胞增加至少一种能够辅因子再生的酶(E3)的表达。具体而言，E3可以是能够再生NAD(P)H的酶。更具体而言，E3可以是脱氢酶/氧化还原酶，其使用NAD(P)作为电子受体(EC 1.1.1.X)。甚至更具体而言，E3可以是截至2014年2月24日具有Brenda数据库中的KEGG编号EC 1.1.1.X的任何酶。例如，E3可以选自醇脱氢酶、甘油磷酸脱氢酶、组氨醇脱氢酶、莽草酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、3-羟基芳基-CoA脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、马肝醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、氨基酸脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶、20-β-羟基类固醇脱氢酶和甲醛脱氢酶。具体而言，酶(E3)可以选自葡萄糖脱氢酶(E3a) (EC 1.1.99.10)、亚磷酸脱氢酶(E3b) (EC 1.20.1.1)和甲酸脱氢酶(E3c) (EC1.2.1.43)，其中葡萄糖、亚磷酸和甲酸分别用作还原剂。在根据本发明的任一方面的方法中使用的细胞中的酶(E3)的存在允许辅因子再生，其使得从具有两个羰基的氨基酸产生不饱和氨基酸的过程能够自我维持。因此，不必将外部能量引入产生不饱和氨基酸的系统中。因此，根据本发明的任一方面的细胞能够在至少酶E1、E2和/或E3存在的情况下从具有至少两个羰基的氨基酸产生至少一种不饱和氨基酸，而无需任何外部能源。
在一个实例中，葡萄糖脱氢酶(E3a)可以是NADP+特异性葡萄糖脱氢酶。充当葡萄糖脱氢酶(E3a)的来源的生物体可以不受限制，并且可以是微生物，诸如细菌、真菌和酵母。例如，芽孢杆菌属的微生物，特别是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，可以是来源。在另一个实例中，来源可以是属于隐球菌属、葡糖杆菌属或酵母属的微生物。具体而言，可以选择属于隐球菌属的微生物，更具体而言，微生物可以选自白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、土生隐球菌(Cryptococcus humicolus)、地生隐球菌(Cryptococus terreus)和指甲隐球菌(Cryptococcus uniguttulatus)。
在另一个实例中，酶E3可以是亚磷酸脱氢酶(E3b)或甲酸脱氢酶(E3c)。充当亚磷酸脱氢酶(E3b)或甲酸脱氢酶(E3c)的来源的生物体可以不受限制，并且可以是微生物，诸如细菌、真菌和酵母。
在一个实例中，根据本发明的任一方面的细胞相对于野生型细胞具有酶E1c、E2a和E3a的增加的表达。在另一个实例中，根据本发明的任一方面的细胞相对于野生型细胞具有E1c、E2a和E3b；E1c、E2a和E3c；E1c、E2b和E3a；E1c、E2b和E3b；或E1c、E2b和E3c的增加的表达。
本发明的教导不仅可以使用具有本申请中明确地(例如通过名称或登录号)或隐含地提及的确切氨基酸或核酸序列的生物大分子来进行，但也可以使用此类序列的变体来进行。如本文所用的术语“变体”分别包括与参考氨基酸或核酸序列具有至少70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸或核酸序列，其中优选地，对于分子的功能(例如蛋白的催化活性)或折叠或结构必需的氨基酸以外的氨基酸可以被缺失、取代或通过插入替代，或者必需氨基酸以保守的方式被替代，以达到参考序列或由其衍生的分子的生物活性得以保留的效果。现有技术包括可用于比对两种给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的算法，参见Arthur Lesk (2008), Thompson等人, 1994,和Katoh等人, 2005。术语“变体”与术语“同源物”同义且可互换使用。此类变体可以通过在氨基酸或核酸序列以及包含此类大分子或其变体的融合体中引入缺失、插入或取代来制备。在一个实例中，关于氨基酸序列，术语“变体”除了上述序列同一性以外，还包括相对于相应的参考或野生型序列包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列，或者包括编码包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列的核酸序列。在一个实例中，除了上述序列同一性程度以外，氨基酸序列或核酸序列的术语“变体”分别包括氨基酸序列或核酸序列的任何活性部分和/或片段，或任何编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的核酸序列。如本文所用的术语“活性部分”是指分别小于全长氨基酸序列或编码小于全长氨基酸序列的氨基酸序列或核酸序列，其中氨基酸序列或编码的氨基酸序列分别保留至少一些其基本生物活性。例如，蛋白酶的活性部分和/或片段能够水解多肽中的肽键。如本文所用的短语“保留至少一些其基本生物活性”是指所讨论的氨基酸序列具有超出和不同于背景活性的生物活性，并且表征所述活性的动力学参数，更具体地kcat和KM，优选在参考分子相对于特定底物显示的值的3个、2个或1个数量级内。类似地，核酸的术语“变体”包括其互补链优选在严格条件下与参考或野生型核酸杂交的核酸。根据本发明的任一方面，技术人员将能够容易地确定将能够从具有至少两个羰基的氨基酸制备不饱和氨基酸的酶E1、E2和/或E3。
在方案1中显示在存在H2O2和不存在H2O2(即反而存在酶E2和介体蛋白)的情况下在根据本发明的任一方面的细胞中发生的反应差异的说明。具体而言，在方案1 (A)中，显示用于将羧基脱羧化为末端-烯基的酶促氧化还原-级联。显示电子经由CamAB从氢化物供体(例如葡萄糖、甲酸或亚磷酸)转移至OleT，OleT消耗大气O2催化羧基氧化脱羧为末端烯基。检测到的副产物显示于括号中。在方案1 (B)中，显示在H2O2存在的情况下的相同反应。
方案1：用OleT将羧基氧化脱羧。
杂交反应的严格性可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度用于适当退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于变性DNA在低于其解链温度的环境中存在时与互补链再退火的能力。探针和可杂交序列之间期望同源性程度越高，可使用的相对温度越高。结果表明，较高的相对温度倾向于使反应条件更严格，而较低的温度则较不那么严格。对于杂交反应的严格性的额外细节和解释，参见F. M. Ausubel (1995)。本领域技术人员可以遵循手册“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”,Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993和Liebl等人, 1991 中关于如何通过杂交方式鉴定DNA序列给出的说明。在一个实例中，严格条件适用于任何杂交，即仅当探针与靶序列具有70％或更高同一性时才发生杂交。与靶序列具有较低程度的同一性的探针可以杂交，但是此类杂交体是不稳定的并且将在严格条件下在洗涤步骤中除去，例如通过将盐的浓度降低至2 x SSC，或任选地且随后，降低至0.5 x SSC，而温度以递增优先的顺序为近似50℃ – 68℃、近似52℃ – 68℃、近似54℃ – 68℃、近似56℃ – 68℃、近似58℃– 68℃、近似60℃ – 68℃、近似62℃ – 68℃、近似64℃ – 68℃、近似66℃ – 68℃。在一个特别优选的实施方案中，温度为近似64℃-68℃或近似66℃-68℃。可以将盐的浓度调节至0.2 x SSC或甚至0.1 x SSC。可以分离与参考或野生型序列具有至少70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同一性程度的多核苷酸片段。如本文所用，核酸序列的术语“同源物”是指根据遗传密码的简并性，编码与参考核酸序列相同的氨基酸序列的任何核酸序列。
技术人员能够容易地测量酶E1、E2和E3各自的活性。例如，为了确定细胞中E1的表达是否增加，技术人员可以使用Liu等人, 2014, Rude M.A, 2011, Schallmey, A., 2011等中公开的测定法。例如，为了确定细胞中E2的表达是否增加，技术人员可以使用Scheps,D, 2011, Roome等人, Schallmey等人等中公开的测定法。细胞中E3的表达，无论其是增加还是减少，可以使用至少在Cartel等人中公开的测定法测量，其中甲酸脱氢酶活性测定(经由NAD(P)+还原)被测定为340 nm处吸光度的变化。技术人员将能够容易地鉴定本领域中可用于测量本发明的细胞中使用的酶的表达的其他众所周知的方法。
相对于野生型细胞，根据本发明的任一方面的细胞可以通过β-氧化具有降低的脂肪酸降解能力。具体而言，与野生型细胞相比脂肪酸降解活性降低可以是相对于野生型细胞的至少一种酶的表达降低的结果，所述酶选自酰基-CoA脱氢酶(FadE) (E6) (EC:1.3.99.-)、烯酰-CoA水合酶(FadB) (E7) (EC 4.2.1.17)、(R)-3-羟基酰基-CoA脱氢酶(FadB) (E8) (EC 1.1.1.35)和3-酮脂酰-CoA硫解酶(FadA) (E9) (EC:2.3.1.16)。
如本文所用，术语“具有降低的脂肪酸降解能力”意味着相应的细胞以比在相同条件下具有正常脂肪酸降解能力的相当细胞或野生型细胞更低的速率降解脂肪酸，特别是取自环境的那些。在一个实例中，由于至少一种编码参与β-氧化途径的酶的基因的缺失、抑制或失活，这种细胞的脂肪酸降解较低。在一个实例中，相对于相同酶在相当条件下在相应的野生型微生物中的活性，至少一种参与β-氧化途径的酶已损失(以渐增优先顺序) 5、10、20、40、50、75、90或99%活性。本领域技术人员可熟悉可用于缺失编码酶的基因或降低细胞中这种酶的活性的各种技术，例如通过将细胞暴露于放射性，然后积累或筛选所得突变体，定点引入点突变或敲除编码活性酶的染色体整合基因，如Sambrook/Fritsch/Maniatis(1989)中所述。此外，转录抑制因子FadR可以过表达，以达到抑制参与β-氧化途径的酶的表达的效果(Fujita, Y.,等人, 2007)。如本文所用，短语“基因的缺失”意味着修饰编码所述基因的核酸序列，使得由所述基因编码的活性多肽的表达降低。例如，可以通过框内去除包含编码多肽的催化活性中心的序列的序列的一部分来缺失所述基因。或者，可以改变核糖体结合位点，使得核糖体不再翻译相应的RNA。使用如酶学教科书(例如Cornish-Bowden,1995)中所述的标准测定法(standard essays)测量活细胞表达的酶的活性将在本领域技术人员的常规技术内。
通过一系列酶促催化反应实现脂肪酸的降解。首先，脂肪酸被吸收并经由转运/酰基活化机制转运穿过细胞膜，所述转运/酰基活化机制涉及至少一种外膜蛋白和一种具有脂肪酸-CoA连接酶活性的内膜相关蛋白，在大肠杆菌的情况下分别称为FadL和FadD /FadK。在细胞内，待降解的脂肪酸经受催化β-氧化途径的其他反应的酶。第一个细胞内步骤涉及通过酰基-CoA脱氢酶将酰基-CoA转化为烯酰-CoA，所述酰基-CoA脱氢酶在大肠杆菌的情况下被称为FadE。可以如现有技术中所述测定酰基-CoA脱氢酶的活性，例如通过在100mM MOPS, pH 7.4, 0.2 mM 烯酰-CoA, 0.4 mM NAD+中在340nm处分光光度监测NADH的浓度。所得烯酰-CoA经由3-羟基酰基-CoA通过水合和氧化转化为3-酮脂酰-CoA，其由烯酰-CoA水合酶/(R)-3-羟基酰基-CoA脱氢酶(在大肠杆菌中被称为FadB和FadJ)催化。烯酰-CoA水合酶/3-羟基酰基-CoA脱氢酶活性，更具体地产物NADH的形成，可以如现有技术中所述，例如如对于FadE所概述，进行分光光度测定。最后，3-酮脂酰-CoA硫解酶（大肠杆菌中的FadA和FadI）催化3-酮脂酰-CoA的裂解，以得到乙酰基-CoA和缩短两个碳原子的输入酰基-CoA。酮脂酰-CoA硫解酶的活性可以如现有技术中所述，例如在Antonenkov, V.,等人,1997中进行测定。
如本文所用，短语“具有降低的脂肪酸降解能力的细胞”是指具有降低的摄取和/或降解脂肪酸(特别是具有至少8碳链的那些)的能力的细胞。可以以各种方式降低细胞的脂肪酸降解能力。具体而言，与其野生型相比，根据本发明的任一方面的细胞具有降低的参与β-氧化途径的酶的活性。如本文所用，术语“参与β-氧化途径的酶”是指与脂肪酸或作为经由β-氧化途径的脂肪酸的降解的一部分形成的其衍生物直接相互作用的酶。β-氧化途径包括实现脂肪酸向乙酰基-CoA和缩短的脂肪酸的CoA酯转化的一系列反应。参与β-氧化途径的酶可以通过识别脂肪酸或其衍生物作为底物，将其转化为作为β-氧化途径的一部分形成的代谢物。例如，酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.-)是参与β-氧化途径的酶，因为其与脂肪酸-CoA相互作用并将脂肪酸-CoA酯转化为烯酰-CoA，其为作为β-氧化的一部分形成的代谢物。在另一个实例中，如本文所用，术语“参与β-氧化途径的酶”包括选自酰基-CoA脱氢酶(EC 1.3.99.-)、烯酰-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)、3-羟基酰基-CoA脱氢酶EC 1.1.1.35)和3-酮脂酰-CoA硫解酶(EC 2.3.1.16)的任何多肽。酰基-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)可以催化脂肪酸转化为脂肪酸的CoA酯，即分子，其中羧基的官能团-OH被-S-CoA替代并且将脂肪酸引入β-氧化途径。例如，大肠杆菌中的多肽FadD和FadK(登录号分别为：BAA15609.1和NP_416216.4)是酰基-CoA脱氢酶。在一个实例中，如本文所用，术语“酰基-CoA脱氢酶”可以是能够催化酰基-CoA转化为烯酰-CoA(作为β-氧化途径的一部分)的多肽。例如，大肠杆菌中的多肽FadE (登录号：BAA77891.2)可以是酰基-CoA脱氢酶。如本文所用，术语“烯酰-CoA水合酶”也称为3-羟基酰基-CoA脱氢酶，是指能够通过水合和氧化催化烯酰-CoA转化为3-酮脂酰-CoA(作为β-氧化途径的一部分)的多肽。例如，大肠杆菌中的多肽FadB和FadJ(登录号分别为：BAE77457.1和P77399.1)是烯酰-CoA水合酶。如本文所用，术语“酮脂酰-CoA硫解酶”可以指能够催化3-酮脂酰-CoA的裂解、产生缩短两个碳原子的酰基-CoA和乙酰基-CoA(作为β-氧化途径的最后步骤)的多肽。例如，大肠杆菌中的多肽FadA和FadI (登录号分别为：YP_491599.1和P76503.1)是酮脂酰-CoA硫解酶。
如本文所用，术语“接触”意指在水溶液中将用作底物的氨基酸与根据本发明的任一方面的细胞之间直接接触。例如，细胞和氨基酸可以在不同的隔室中，所述隔室由屏障诸如无机膜隔开。如果氨基酸是可溶的并且可以被细胞摄取或可以扩散穿过生物膜，则可以简单地将其添加至水溶液中的根据本发明的任一方面的细胞中。在其溶解性不足的情况下，可以在添加至水溶液之前将其溶解于合适的有机溶剂中。本领域技术人员能够通过添加合适的有机和/或极性溶剂来制备溶解度不足的氨基酸水溶液。此类溶剂可以以包含液体有机溶剂的有机相的形式提供。在一个实例中，当在25℃和标准大气压下为液体时，有机溶剂或相可以被认为是液体。在另一个实例中，所述化合物和催化剂可以在体外接触，即以或多或少富集或甚至纯化的状态接触，或者可以原位接触，即它们作为细胞代谢的一部分制备并随后在细胞内部反应。
术语“水溶液”或“培养基”包括任何包含水，主要是水作为溶剂的溶液，所述溶液可用于将根据本发明的任一方面的细胞至少暂时地保持代谢活性和/或存活状态，并且如果这是必要的，所述溶液包含任何额外基质。本领域技术人员熟悉制备许多水溶液，通常称为可用于保持根据本发明的任一方面的方法中使用的细胞的培养基，例如，在大肠杆菌的情况下，LB培养基。与复杂培养基相比，有利的是使用基本培养基作为水溶液，即具有合理简单组成的培养基，其仅包含对于使细胞保持代谢活性和/或存活状态必不可少的最低的盐和营养素的组，以避免产物不必要地污染有不想要的副产物。例如，M9培养基可用作基本培养基。
根据本发明的任一方面，可以将包含至少两个羰基的氨基酸添加至包含根据本发明的任一方面的细胞的水溶液中。该步骤不仅可以包括使氨基酸与溶液暂时接触，而且实际上在细胞存在的情况下将氨基酸孵育足够长以允许氧化反应且可能发生进一步的下游反应，例如至少1、2、4、5、10或20小时。选择的温度必须使得根据本发明的任一方面的细胞保持催化能力和/或代谢活性，例如，在细胞是大肠杆菌细胞的情况下，10至42℃，特别是30至40℃，更特别是32至38℃。
具体而言，根据本发明的任一方面的方法的辅因子可以是NAD+/NADH。更具体而言，该方法还包括用于再生消耗的辅因子NAD(P)+的辅因子再生的偶联过程。偶联的辅因子再生过程还包括再生消耗的牺牲葡萄糖、甲酸、磷酸(phosphine)等。
在一个实例中，根据本发明的任一方面形成的不饱和氨基酸可以是乙烯基甘氨酸及其衍生物。在该实例中，根据本发明的任一方面的方法可以包括以下进一步步骤：
(b)使乙烯基甘氨酸或其衍生物与自由基甲基硫醇接触。这是导致甲硫氨酸形成的步骤。具体而言，该步骤是制备甲硫氨酸的化学过程的一部分。也称为甲硫醇的甲基硫醇具有CH4S的化学式和式II的结构：
式II。
甲基硫醇向乙烯基甘氨酸中的自由基加成可以导致自由基化的甲基硫醇作用于乙烯基甘氨酸的末端碳-碳双键，以产生2-氨基-4-(甲基硫基)丁酸。该步骤具有通过具有高转化率和短反应时间而经济地产生L-和/或D-甲硫氨酸的优点。此外，与其中使用乙酰基高丝氨酸作为甲基硫醇活性的底物的本领域中使用的方法相比，乙烯基甘氨酸的使用具有其他优点。例如，使用乙酰基高丝氨酸作为甲基硫醇活性的底物导致产生副产物乙酸。该产生可以被认为是碳的损失，其中不是来自底物(即乙酰基高丝氨酸)的所有碳都转化为靶产物甲硫氨酸。此外，随着乙酸释放，甲硫氨酸部分吸收乙酸的气味。因此，使用该方法产生的甲硫氨酸具有痕量的乙酸。这些问题可以通过根据本发明的任一方面的方法克服。因此，根据本发明的任一方面的方法具有通过具有高转化率和短反应时间而经济地产生L-甲硫氨酸和/或D-甲硫氨酸的优点。
另一方面，使用乙烯基甘氨酸作为自由基化的甲基硫醇活性的底物不具有与当使用乙酰基高丝氨酸时所提及的那些相同的缺点。首先，没有碳的损失，因为乙烯基甘氨酸中的所有碳都转化为甲硫氨酸的一部分。也没有乙酸的产生。此外，底物乙烯基甘氨酸可以容易地从易于获得的谷氨酸(生物中产量最高的氨基酸之一)合成。谷氨酸可以是L和/或D异构体。自由基化的甲基硫醇步骤，也称为硫醇-烯偶联反应，也可以被认为是相对选择性的，因为当乙烯基甘氨酸用作底物时不会释放副产物。
通过本领域已知的任何方式自由基化甲基硫醇可以导致甲基硫醇中的硫-氢键断裂以产生甲基硫醇自由基。
然后，甲基硫醇自由基可以作用于乙烯基甘氨酸中的末端碳-碳双键。该作用可以导致双键被还原为单键且在末端碳原子处根据反马尔可夫尼科夫规则添加甲硫基基团。底物中相邻的非末端碳原子上的未成对电子与由甲基硫醇提供的氢原子结合，由此产生另一个甲基硫醇自由基，并且这继续加成循环。
具体而言，甲基硫醇与乙烯基甘氨酸或其衍生物的比率可以是1:1，特别是在反应介质中。然而，技术人员能够根据用于形成自由基的引发剂改变该比率。在一个实例中，甲基硫醇与乙烯基甘氨酸或其衍生物的比率可以选自1:1至1:10的范围。具体而言，该比率可以为1.2:1。在一个实例中，甲基硫醇与乙烯基甘氨酸或其衍生物的比率可以选自3:1-6:1。根据本发明的任一方面，这可以是有利的，如在硫醇-烯偶联反应中，可能需要过量的硫醇。
在一个实例中，甲基硫醇的自由基化可以通过使甲基硫醇与至少一种自由基引发剂接触来进行。存在可以根据本发明的任一方面使用的几种引发剂。技术人员能够鉴定这些引发剂。例如，自由基引发剂可以选自偶氮二异丁腈(AIBN)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、过氧化二苯甲酰(DBPO)、Vazo®-44 (2,2'-偶氮二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二氯化物)等。当与任何这些自由基引发剂接触时，甲基硫醇可以被自由基化以产生自由基，其然后可以与乙烯基甘氨酸反应以产生甲硫氨酸。在一个实例中，AIBN是自由基引发剂。AIBN在室温下是热稳定的。然而，在加热至活化温度后，其产生自由基，其然后可以开始与乙烯基甘氨酸的自由基加成链反应。在另一个实例中，Vazo®-44可以是自由基引发剂。自由基引发剂的VAZO®系列可得自DuPont Chemicals of Wilmington, Delaware, U.S.A.。具体而言，自由基引发剂可以选自偶氮二异丁腈(AIBN)和2,2-偶氮二(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二盐酸盐。
在另一个实例中，代替使用化学试剂如自由基引发剂来使甲基硫醇自由基化，可以使用紫外光源。UV光可以在300 nm或365 nm的波长处。具体而言，所述UV光可以具有300nm的波长。
在一个进一步实例中，甲基硫醇的自由基化可以通过UV光和光引发剂诸如2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DPAP)的组合进行。在该实例中，所述UV光可以具有365nm的波长。
在一个实例中，甲基硫醇的自由基化可以在没有额外引发剂的情况下进行。在该实例中，不需要化学引发剂和/或UV射线。甲基硫醇的自由基化可以在加热后自催化发生，或者可以通过超声波或杂质(例如氧气)辅助。技术人员能够使用各种方式进行自由基化。然而，没有额外化学引发剂的反应可以遭受低反应速率和产率。
在所有上述实例中，甲基硫醇的自由基化步骤可以在乙烯基甘氨酸转化为甲硫氨酸的同时进行。因此，自由基化和乙烯基甘氨酸向甲硫氨酸转化的两个步骤可以在同一罐中进行。例如，当使用温度活化的自由基引发剂诸如AIBN时，首先保持反应的温度和压力条件，使得反应物(即甲基硫醇、乙烯基甘氨酸和AIBN)作为液体存在并且温度低于自由基引发剂的活化温度。将反应物和自由基引发剂引入罐中的顺序是不重要的，因为罐中反应混合物的条件使得基本上不发生反应。当温度升高时，反应起始(kick starts)并且自由基化的AIBN导致甲基硫醇的自由基的形成，其然后攻击乙烯基甘氨酸中的C双键以形成甲硫氨酸。
具体而言，自由基引发剂与甲基硫醇的比率可以在1:10000至1:5的范围内。更具体而言，自由基引发剂与甲基硫醇的比率可以在1:10000至1:10的范围内。甚至更具体而言，自由基引发剂与甲基硫醇的比率可以为约1:1000、1:500、1:100、1:50、1:20、1:30、1:10、1:3等。
在另一个实例中，所述罐可以具有半透明部分(例如，反应器窗口)，其中UV光可以照射至罐中。或者，紫外光源可以设置在延伸至罐中的半透明封壳内。然后反应罐中的UV光可以使罐中的甲基硫醇自由基化。该过程可以花费至少约5小时或更长时间。然后可以将反应混合物冷却至室温，并可以使过量的甲基硫醇挥发并从反应罐中移出。然后可以回收过量的甲基硫醇用于重复使用。然后可以将甲硫氨酸留在罐中。
在一个进一步实例中，具有半透明部分的罐可以包含乙烯基甘氨酸、光引发剂如DPAP和甲基硫醇。没有UV光的情况下，罐中不会发生反应。当通过本领域已知的任何方式将365nm的UV光引入罐中时，可以活化光引发剂以使甲基硫醇自由基化。然后甲基硫醇的自由基可以作用于乙烯基甘氨酸以产生甲硫氨酸。然后可以如上所述除去过量的乙烯基甘氨酸并再循环。然后，罐中的所得产物可以仅为甲硫氨酸。
根据本发明的另一个方面，提供了产生甲硫氨酸的方法，所述方法包括，
(a) 使重组微生物细胞与包含谷氨酸的培养基接触以产生乙烯基甘氨酸和/或其衍生物，
(b) 使(a)的乙烯基甘氨酸或其衍生物与自由基甲基硫醇接触，
其中所述细胞被基因修饰以包含
- 至少第一基因突变，其相对于野生型细胞增加选自CYP152过氧合酶家族的酶(E1)的表达，和
- 至少第二基因突变，其相对于野生型细胞增加至少一种NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白的表达。
根据本发明的任一方面的产生甲硫氨酸的方法可以是两罐法。在一个罐中，可以进行步骤(a)，其中根据本发明的任一方面的细胞与含有谷氨酸的水性培养基接触。维持罐1中的条件以优化乙烯基甘氨酸的产生。技术人员将能够鉴定用于该罐中细胞产生乙烯基甘氨酸的优化活性的合适条件。然后可以通过本领域已知的任何方式从罐1中浓缩或分离乙烯基甘氨酸。在一个实例中，可以通过沉淀或提取将乙烯基甘氨酸与罐1的溶液分离，并将所得的乙烯基甘氨酸转移至第二罐(罐2)中。在另一个实例中，将罐1的所有内容物转移至罐2。罐1可以不断地用谷氨酸再填充，并且将细胞再循环以保持低成本。在另一个实例中，在萃取乙烯基甘氨酸并转移至罐2之前，使形成的乙烯基甘氨酸在罐1中积累。在该实例中，在引入乙烯基甘氨酸之前，罐2可以已经包含(i)温度活化的自由基引发剂诸如AIBN和甲基硫醇。当可以将乙烯基甘氨酸引入罐2时，首先维持罐2的温度和压力条件，使得反应物(即甲基硫醇、乙烯基甘氨酸和AIBN)作为液体存在并且温度低于自由基引发剂的活化温度。当温度升高时，反应起始(kick starts)并且自由基化的AIBN导致甲基硫醇的自由基的形成，其然后攻击乙烯基甘氨酸中的C双键以在罐2中形成甲硫氨酸。
在另一个实例中，可以将来自罐1的乙烯基甘氨酸引入罐2中，所述罐2包含甲基硫醇且可以具有半透明部分(例如，反应器窗口)，其中UV光可以照射至罐中。或者，紫外光源可以设置在延伸至罐中的半透明封壳内。引入罐2中的UV光可以然后使罐中的甲基硫醇自由基化。该过程可以花费至少约5小时或更长时间。然后可以将反应混合物冷却至室温，并可以使过量的甲基硫醇挥发并从反应罐中移出。然后可以回收过量的甲基硫醇用于重复使用。然后可以将甲硫氨酸留在罐2中。
在一个进一步实例中，可以将来自罐1的乙烯基甘氨酸引入罐2中，所述罐2包含甲基硫醇、光引发剂如DPAP和半透明部分。没有UV光的情况下，罐中不会发生反应。当通过本领域已知的任何方式将365nm的UV光引入罐中时，可以活化光引发剂以使甲基硫醇自由基化。然后甲基硫醇的自由基可以作用于乙烯基甘氨酸以产生甲硫氨酸。然后可以如上所述除去过量的乙烯基甘氨酸并再循环。然后，罐2中的所得产物可以仅为甲硫氨酸。
实施例
前面描述了优选实施方案，其，如本领域技术人员将理解，在不脱离权利要求的范围的情况下，可以进行设计、构建或操作的变化或修改。例如，这些变化旨在由权利要求的范围所涵盖。
实施例1
经由硫醇 -烯偶联(TEC)从乙烯基甘氨酸开始合成甲硫氨酸
在装有回流冷凝器的烧瓶(250mL)中，将乙烯基甘氨酸(1.011 g, 10.00 mmol, 1.00eq.)溶解于甲醇/水(1/1, 40 mL)中，并添加AIBN (0.164 g, 1.00 mmol, 0.10 eq.)。将甲基硫醇(2.887 g, 2.60 mL, 60.00 mmol, 6.00 eq.)在-30℃下在充当储器的第二烧瓶中冷凝。移去冷却浴，且储器与反应设备连接，以使甲基硫醇通过反应混合物，同时将混合物在60℃下加热6小时。将反应冷却至环境温度，并通过过滤收集形成的沉淀，以获得标题化合物(作为甲硫氨酸的白色结晶固体)。通过NMR证实产物的结构完整性。
实施例2
使用OleT在水溶液中通过谷氨酸的氧化脱羧形成乙烯基甘氨酸。
实施例3
用OleT从N-乙酰基谷氨酸产生N-乙酰基乙烯基甘氨酸
为了将N-乙酰基谷氨酸生物转化为N-乙酰基乙烯基甘氨酸，在甲酸、氧气和NADH存在的情况下使用具有P450单加氧酶(OleT)、电子转移系统(CamAB)和甲酸脱氢酶(FDH)的纯化酶的生物催化系统。
除非另有说明，否则所有化学品均获自Sigma Aldrich (Steinheim, Germany)；N-乙酰基谷氨酸获得自Alfa Aesar (Thermo Fisher, Karlsruhe, Germany)，甲酸铵获得自Carl Roth (Karlsruhe, Germany)，NADH-二钠盐获得自Panreac (Barcelona, Spain)。
来自牛肝的过氧化氢酶、来自鸡蛋的溶菌酶和来自牛心脏的细胞色素c获得自Sigma Aldrich (Steinheim, Germany)，甲酸脱氢酶(NADH-依赖性)获得自Evocatal(Monheim am Rhein, Germany)。用于表达CamAB的质粒获得自Anett Schallmey (TUBraunschweig, Germany)。根据Dennig等人, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 8819开发的标准方案进行OleT的表达和纯化以及CamAB电子转移系统的表达和活性测定。
对于生物转化，将磷酸盐缓冲液(100 mM, pH 7.5)中的6 μM OleT、10 mM N-乙酰基谷氨酸、0.05 U/mL CamAB、1200 U/mL过氧化氢酶、2 U/mL FDH、100 mM NH4COOH和200 μM NADH在室温下在4mL玻璃小瓶中以160rpm振荡24小时。对于对照反应，使用相同的条件，除了省略OleT。所有反应均一式两份进行。
对于产物的衍生化，将样品的等分试样(900μL)转移至1.5mL玻璃小瓶中，用150μL的NaIO4溶液(10 mM)处理，并在25℃下以1000 rpm振荡30分钟。然后通过离心蒸发器(SpeedVac)除去水，并通过涡旋将残余物溶解于700μL含有5％ DMAP (4-二甲基氨基吡啶)的MeOH的溶液中；然后添加150μL氯甲酸乙酯，并将混合物在50℃下在800 rpm振荡下加热1小时。然后通过SpeedVac除去溶剂，将残余物溶解于700μL 2% HCl水溶液中，并用200μLEtOAc(掺入5mM (R)-柠檬烯作为内部标准)萃取两次；将收集的有机级分经Na2SO4干燥。
在配备有FID(火焰离子化检测器)的Agilent 7890A GC (气相色谱)系统(H2作为载气)上将样品分析为衍生化的氨基酸，其使用Agilent DB-1701柱(30 m x 350 μm, 0.25μm膜)；注射体积：5μL，分流比：50:1，注射温度：250℃，检测温度：250℃；程序：100℃/保持3分钟，20℃/min至280℃，保持1分钟。
用OleT分析生物转化的样品揭示存在小峰，其具有乙烯基甘氨酸的氨基甲酸酯衍生形式的相同的保留时间(Rt =6.2 min)(独立合成参考化合物)。共注射少量合成的参考材料导致新峰的面积增加。
序列表
<110> Evonik Industries AG
<120> 不饱和氨基酸
<130> 201600055
<150> 16168227.3
<151> 2016-05-04
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 422
<212> PRT
<213> 微纯白微球菌(Micrococcus candicans) ATCC 8456
<400> 1
Met Ala Thr Leu Lys Arg Asp Lys Gly Leu Asp Asn Thr Leu Lys Val
1 5 10 15
Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Tyr Thr Thr Asn Gln Arg Asn Arg Leu Asn
20 25 30
Thr Ser Val Phe Gln Thr Lys Ala Leu Gly Gly Lys Pro Phe Val Val
35 40 45
Val Thr Gly Lys Glu Gly Ala Glu Met Phe Tyr Asn Asn Asp Val Val
50 55 60
Gln Arg Glu Gly Met Leu Pro Lys Arg Ile Val Asn Thr Leu Phe Gly
65 70 75 80
Lys Gly Ala Ile His Thr Val Asp Gly Lys Lys His Val Asp Arg Lys
85 90 95
Ala Leu Phe Met Ser Leu Met Thr Glu Gly Asn Leu Asn Tyr Val Arg
100 105 110
Glu Leu Thr Arg Thr Leu Trp His Ala Asn Thr Gln Arg Met Glu Ser
115 120 125
Met Asp Glu Val Asn Ile Tyr Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Thr Lys
130 135 140
Val Gly Thr Arg Trp Ala Gly Val Gln Ala Pro Pro Glu Asp Ile Glu
145 150 155 160
Arg Ile Ala Thr Asp Met Asp Ile Met Ile Asp Ser Phe Arg Ala Leu
165 170 175
Gly Gly Ala Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Ser Lys Glu Ala Arg Arg Arg
180 185 190
Val Glu Asp Trp Leu Glu Glu Gln Ile Ile Glu Thr Arg Lys Gly Asn
195 200 205
Ile His Pro Pro Glu Gly Thr Ala Leu Tyr Glu Phe Ala His Trp Glu
210 215 220
Asp Tyr Leu Gly Asn Pro Met Asp Ser Arg Thr Cys Ala Ile Asp Leu
225 230 235 240
Met Asn Thr Phe Arg Pro Leu Ile Ala Ile Asn Arg Phe Val Ser Phe
245 250 255
Gly Leu His Ala Met Asn Glu Asn Pro Ile Thr Arg Glu Lys Ile Lys
260 265 270
Ser Glu Pro Asp Tyr Ala Tyr Lys Phe Ala Gln Glu Val Arg Arg Tyr
275 280 285
Tyr Pro Phe Val Pro Phe Leu Pro Gly Lys Ala Lys Val Asp Ile Asp
290 295 300
Phe Gln Gly Val Thr Ile Pro Ala Gly Val Gly Leu Ala Leu Asp Val
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Thr His Asp Glu Ser Leu Trp Asp Asp Pro Asn Glu Phe
325 330 335
Arg Pro Glu Arg Phe Glu Thr Trp Asp Gly Ser Pro Phe Asp Leu Ile
340 345 350
Pro Gln Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Thr Asn His Arg Cys Ala Gly Glu
355 360 365
Trp Ile Thr Val Ile Ile Met Glu Glu Thr Met Lys Tyr Phe Ala Glu
370 375 380
Lys Ile Thr Tyr Asp Val Pro Glu Gln Asp Leu Glu Val Asp Leu Asn
385 390 395 400
Ser Ile Pro Gly Tyr Val Lys Ser Gly Phe Val Ile Lys Asn Val Arg
405 410 415
Glu Val Val Asp Arg Thr
420
<210> 2
<211> 422
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 2
Met Asn Ala Asn Asp Asn Val Val Ile Val Gly Thr Gly Leu Ala Gly
1 5 10 15
Val Glu Val Ala Phe Gly Leu Arg Ala Ser Gly Trp Glu Gly Asn Ile
20 25 30
Arg Leu Val Gly Asp Ala Thr Val Ile Pro His His Leu Pro Pro Leu
35 40 45
Ser Lys Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Ala Thr Ala Glu Ser Leu Tyr Leu
50 55 60
Arg Thr Pro Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Asn Ile Gln Leu Leu Gly Gly
65 70 75 80
Thr Gln Val Thr Ala Ile Asn Arg Asp Arg Gln Gln Val Ile Leu Ser
85 90 95
Asp Gly Arg Ala Leu Asp Tyr Asp Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Gly
100 105 110
Arg Pro Arg Pro Leu Pro Val Ala Ser Gly Ala Val Gly Lys Ala Asn
115 120 125
Asn Phe Arg Tyr Leu Arg Thr Leu Glu Asp Ala Glu Cys Ile Arg Arg
130 135 140
Gln Leu Ile Ala Asp Asn Arg Leu Val Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile
145 150 155 160
Gly Leu Glu Val Ala Ala Thr Ala Ile Lys Ala Asn Met His Val Thr
165 170 175
Leu Leu Asp Thr Ala Ala Arg Val Leu Glu Arg Val Thr Ala Pro Pro
180 185 190
Val Ser Ala Phe Tyr Glu His Leu His Arg Glu Ala Gly Val Asp Ile
195 200 205
Arg Thr Gly Thr Gln Val Cys Gly Phe Glu Met Ser Thr Asp Gln Gln
210 215 220
Lys Val Thr Ala Val Leu Cys Glu Asp Gly Thr Arg Leu Pro Ala Asp
225 230 235 240
Leu Val Ile Ala Gly Ile Gly Leu Ile Pro Asn Cys Glu Leu Ala Ser
245 250 255
Ala Ala Gly Leu Gln Val Asp Asn Gly Ile Val Ile Asn Glu His Met
260 265 270
Gln Thr Ser Asp Pro Leu Ile Met Ala Val Gly Asp Cys Ala Arg Phe
275 280 285
His Ser Gln Leu Tyr Asp Arg Trp Val Arg Ile Glu Ser Val Pro Asn
290 295 300
Ala Leu Glu Gln Ala Arg Lys Ile Ala Ala Ile Leu Cys Gly Lys Val
305 310 315 320
Pro Arg Asp Glu Ala Ala Pro Trp Phe Trp Ser Asp Gln Tyr Glu Ile
325 330 335
Gly Leu Lys Met Val Gly Leu Ser Glu Gly Tyr Asp Arg Ile Ile Val
340 345 350
Arg Gly Ser Leu Ala Gln Pro Asp Phe Ser Val Phe Tyr Leu Gln Gly
355 360 365
Asp Arg Val Leu Ala Val Asp Thr Val Asn Arg Pro Val Glu Phe Asn
370 375 380
Gln Ser Lys Gln Ile Ile Thr Asp Arg Leu Pro Val Glu Pro Asn Leu
385 390 395 400
Leu Gly Asp Glu Ser Val Pro Leu Lys Glu Ile Ile Ala Ala Ala Lys
405 410 415
Ala Glu Leu Ser Ser Ala
420
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 3
Met Ser Lys Val Val Tyr Val Ser His Asp Gly Thr Arg Arg Glu Leu
1 5 10 15
Asp Val Ala Asp Gly Val Ser Leu Met Gln Ala Ala Val Ser Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Asp Ile Val Gly Asp Cys Gly Gly Ser Ala Ser Cys Ala Thr
35 40 45
Cys His Val Tyr Val Asn Glu Ala Phe Thr Asp Lys Val Pro Ala Ala
50 55 60
Asn Glu Arg Glu Ile Gly Met Leu Glu Cys Val Thr Ala Glu Leu Lys
65 70 75 80
Pro Asn Ser Arg Leu Cys Cys Gln Ile Ile Met Thr Pro Glu Leu Asp
85 90 95
Gly Ile Val Val Asp Val Pro Asp Arg Gln Trp
100 105

Claims (15)

1.从至少一种包含至少两个羰基的氨基酸产生至少一种不饱和氨基酸的方法，所述方法包括
(a) 使重组微生物细胞与包含含有羰基的氨基酸的培养基接触，
其中所述细胞被基因修饰以包含
- 至少第一基因突变，其相对于野生型细胞增加选自CYP152过氧合酶家族的酶(E1)的表达，和
- 至少第二基因突变，其相对于野生型细胞增加至少一种NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中包含至少两个羰基的氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述不饱和氨基酸是乙烯基甘氨酸或其衍生物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中E1选自CYPSPα (E1a)CYPBSB (E1b)和OleT(E1c)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中E1是OleT (E1c)且包含与SEQ ID NO:1至少60％序列同一性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白选自：
- 铁氧还蛋白还原酶(E2a)和铁氧还蛋白；和
- 假单胞氧还蛋白还原酶(E2b)和假单胞氧还蛋白。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中E2包含与SEQ ID NO:2的60％序列同一性，且所述介体蛋白包含与SEQ ID NO:3的60％序列同一性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含至少第三基因突变，所述第三基因突变相对于野生型细胞增加至少一种能够NAD(P)H再生的酶(E3)的表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酶(E3)选自葡萄糖脱氢酶、亚磷酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含相对于野生型细胞降低的脂肪酸降解能力。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述脂肪酸降解能力通过缺失编码这样的酶的基因来降低，所述酶选自脂肪酸输入蛋白、脂肪酸-CoA连接酶、酰基-CoA脱氢酶、2,4-二烯酰-CoA还原酶、烯酰-CoA水合酶和3-酮脂酰-CoA硫解酶。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤
(b) 使乙烯基甘氨酸或其衍生物与自由基甲基硫醇接触。
13.产生甲硫氨酸的方法，所述方法包括，
(a) 使重组微生物细胞与包含谷氨酸的培养基接触以产生乙烯基甘氨酸和/或其衍生物，
(b) 使(a)的乙烯基甘氨酸或其衍生物与自由基甲基硫醇接触，
其中所述细胞被基因修饰以包含
- 至少第一基因突变，其相对于野生型细胞增加选自CYP152过氧合酶家族的酶(E1)的表达，和
- 至少第二基因突变，其相对于野生型细胞增加至少一种NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白的表达。
14.根据权利要求13所述的方法，其中E1是OleT (E1c)且包含与SEQ ID NO:1至少60％序列同一性。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中NAD(P)+氧化还原酶(E2)和相应的介体蛋白选自：
- 铁氧还蛋白还原酶(E2a)和铁氧还蛋白；和
- 假单胞氧还蛋白还原酶(E2b)和假单胞氧还蛋白。
CN201780027259.7A 2016-05-04 2017-05-03 不饱和氨基酸 Pending CN109072264A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16168227 2016-05-04
EP16168227.3 2016-05-04
PCT/EP2017/060552 WO2017191195A1 (en) 2016-05-04 2017-05-03 Unsaturated amino acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109072264A true CN109072264A (zh) 2018-12-21

Family

ID=56014806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780027259.7A Pending CN109072264A (zh) 2016-05-04 2017-05-03 不饱和氨基酸

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20190127769A1 (zh)
EP (1) EP3452607A1 (zh)
CN (1) CN109072264A (zh)
WO (1) WO2017191195A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113286782A (zh) * 2019-01-18 2021-08-20 安迪苏法国联合股份有限公司 引发自由基加成反应的试剂及其使用方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3390622B1 (en) 2015-12-17 2020-05-13 Evonik Operations GmbH A genetically modified acetogenic cell
JP2019523271A (ja) 2016-07-27 2019-08-22 エボニック デグサ ゲーエムベーハーＥｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ Ｎ−アセチルホモセリン
CN113896783B (zh) * 2021-10-27 2023-12-19 大连理工大学 一种sumo-c4h7no2探针、合成方法及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009085278A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing olefins
US20140206057A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-24 Shell Oil Company Novel yeast strains
CA2937594A1 (en) * 2015-02-26 2016-08-26 Evonik Degussa Gmbh Alkene production

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113286782A (zh) * 2019-01-18 2021-08-20 安迪苏法国联合股份有限公司 引发自由基加成反应的试剂及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017191195A1 (en) 2017-11-09
EP3452607A1 (en) 2019-03-13
US20190127769A1 (en) 2019-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102121888B1 (ko) 재조합 미생물 및 이에 대한 용도
JP6373190B2 (ja) ＡｌｋＢアルカン１−モノオキシゲナーゼを用いた、アルカンの酸化法
CN109072264A (zh) 不饱和氨基酸
EP2922963B1 (en) Process for producing alpha,omega-diols from c4-alkanes or c4-1-alkanols employing a cyp153 alkane hydroxylase
US20150010968A1 (en) Biological alkene oxidation
RU2294370C2 (ru) Способ получения спирта с использованием микроорганизма
EP3061827A1 (en) Alkene production
CN109311808A (zh) 甲硫氨酸生产
JP7186261B2 (ja) ω－官能化カルボン酸及びそのエステルの生物工学的な製造
EP1743943A1 (en) Process for producing l-fuculose and process for producing l-fucose
Murakami et al. Cloning and functional analysis of aniline dioxygenase gene cluster, from Frateuria species ANA-18, that metabolizes aniline via an ortho-cleavage pathway of catechol
CN110964757A (zh) 一种葡萄糖二酸的制备方法
JP5243748B2 (ja) ブタノール生産能を有する形質転換体
KR20220141146A (ko) 유전자 재조합 포름산 탈수소효소 또는 고정화된 유전자 재조합 포름산 탈수소효소 및 그들을 이용한 개미산의 제조 방법
EP3283621A1 (en) Acyl amino acid production
CN105593368B (zh) 2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法
JP2005278414A (ja) １，３−プロパンジオール及び３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法
US20240279691A1 (en) Method for producing formic acid using carbon monoxide dehydrogenase and formate dehydrogenase
US20050239180A1 (en) Nucleotide sequence coding for a mannitol-2 dehydrogenase and method for the production of d-mannitol
EP4170033A1 (en) Transformant of genus hydrogenophilus bacterium capable of producing aspartic acid and methionine
JP2014150748A (ja) 変異微生物、並びに、コハク酸の生産方法
KR20200052377A (ko) Wood-ljungdahl 미생물에서의 폴리히드록시부티레이트의 생성
CN109321610A (zh) 微生物发酵法高效制备2-氨基-1,3-丙二醇
JPWO2006104124A1 (ja) 新規パントテン酸キナーゼ遺伝子及びその利用方法
MC MK et al. 45128 Essen (DE)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181221

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication